一种来源于拟南芥的启动子pAtCHS、甜菜红素的基因表达盒及其应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种来源于拟南芥的启动子patchs、甜菜红素的基因表达盒及其应用。

背景技术：

1、甜菜红素（betacyanin）是一类含氮水溶性天然色素，天然分布于石竹目少数植物中，如红甜菜（

beta vulgaris）、苋属（

amaranthus spp.）、火龙果（

hylocereus spp.）等。该色素以l-酪氨酸为前体，经多级酶促反应生成甜菜苷等红紫色发色团，具有抗氧化能力强、ph稳定性好、安全性高等优点，已被列为gras级天然食品添加剂，广泛应用于食品、化妆品及功能食品领域。然而，甜菜红素天然来源作物种类有限、含量偏低，且对高温、光照和氧化敏感，导致工业化生产长期受限于原料供给不稳定、提取成本高、储运损耗大等问题。因此，在非天然宿主中重构甜菜红素合成途径，是实现其规模化供给的关键方向。

2、甜菜红素的核心合成由三个关键酶驱动：cyp76ad1催化l-酪氨酸经l-dopa氧化生成环多巴前体（cyclo-dopa）；bvdoda1催化l-dopa开环生成甜菜醛氨酸；cdopa5gt催化环多巴糖基化生成环多巴-5-o-葡萄糖苷，后者与甜菜醛氨酸自发缩合形成甜菜苷。已有研究表明，将这三个基因的编码序列构建为单一融合基因，可实现甜菜红素在异源植物中的协同合成。在启动子选择方面，拟南芥查尔酮合成酶基因启动子（patchs）为组成型启动子，在双子叶植物中表现出较强的转录活性，且跨物种活性高、组织广谱性好。然而，现有技术中甜菜红素异源表达系统仍存在转化盒结构复杂、启动子表达活性难以直观评估、阳性转化体筛选依赖分子检测手段等问题，限制了该技术在规模化育种和高附加值作物开发中的应用。

3、绝大多数观赏植物及主要农作物（如烟草、水稻、番茄等）自身缺乏甜菜红素合成途径，其色素积累主要依赖类黄酮途径，限制了开发新颖色泽品种或功能性产品。现有技术尚未提供一种以精简表达盒在烟草中高效表达甜菜红素、并同时实现启动子活性可视化标记与高附加值产物积累的技术方案。因此，亟需一种操作简便、表型直观筛选、适用于烟草等作物的甜菜红素异源表达策略，以推动天然色素规模化生产和作物功能化增值。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种来源于拟南芥的启动子patchs、甜菜红素的基因表达盒及其应用；所述来源于拟南芥的启动子patchs能够在烟草植株中高效启动甜菜红素生物合成关键酶的融合基因的表达，实现了在烟草的根、茎、叶和花各组织中表达并积累甜菜红素。本发明在植物育种领域以及甜菜红素的生产领域具有重要的应用价值。

2、本发明提供了一种来源于拟南芥的启动子patchs，所述启动子patchs的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明提供了一种甜菜红素的基因表达盒，包括顺次连接的所述的启动子patchs、编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因和终止子tpsrbcs。

4、优选的，所述编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因包含顺次连接的

cyp76ad1s、

bvdoda1s和

cdopa5gts基因，相邻两个基因通过t2a肽编码序列串联；所述

cyp76ad1s、

bvdoda1s和

cdopa5gts基因的核苷酸序列分别如seq id no.2~4所示。

5、优选的，所述终止子tpsrbcs的核苷酸序列如seq id no.5所示。

6、本发明提供了一种表达甜菜红素生物合成关键酶的重组载体，包括所述的基因表达盒和植物表达载体。

7、优选的，所述植物表达载体为pcambia1301。

8、本发明提供了一种表达甜菜红素生物合成关键酶的重组菌株，通过将所述的重组载体转入农杆菌获得。在本发明中，所述重组载体优选地通过电击法转入农杆菌中。本发明对所述电击法的具体操作没有特殊限定，采用本领域公知的操作即可。

9、本发明最主要的目的是公开了上述启动子patchs在驱动编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因在烟草中表达中的应用。也就是找到了一个新的来源于拟南芥的启动子patchs，该启动子可以驱动编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因在烟草中特异性表达。在烟草中，其不仅能在花器官中表达，并且还在烟草中展现出不同于其在本源植物中的表达特性（在花瓣中特异性表达），表现为在花器官中活性最高，同时在营养组织（如茎、叶柄）中具有“渗漏表达”的广谱性启动子。所得转基因烟草花色艳丽，且茎、叶柄等组织均呈现红色表型，所含甜菜红素浓度较高。

10、因此，本发明还提供了一种在烟草中合成甜菜红素的方法，用所述的重组菌株转染烟草植株，获得合成甜菜红素的转基因烟草，也就是本发明提供了一种新的烟草育种方法，为创制高效积累甜菜红素的转基因烟草提供一种新的遗传资源。

11、优选的，所述烟草为本氏烟草。

12、优选的，所述转基因烟草合成甜菜红素的器官包括花、叶脉、根和茎。

13、更加具体地，一种在烟草中合成甜菜红素的方法，包括以下步骤：

14、1）将启动子patchs、编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因和终止子tpsrbcs连接构建甜菜红素的基因表达盒；

15、2）将所述基因表达盒连入植物表达载体，获得重组载体；

16、3）将所述重组载体转入宿主菌中获得重组菌株；

17、4）将所述重组菌株侵染并转化烟草，经共培养、愈伤诱导、不定芽分化、生根及抗性筛选，得到稳定过表达编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因的转基因烟草。

18、另外，本发明还提供了一种检测启动子活性的方法，包括以下步骤：1）将待检测启动子、编码甜菜红素生物合成关键酶的融合基因和终止子tpsrbcs连接构建甜菜红素的基因表达盒；2）将所述基因表达盒连入植物表达载体，获得重组载体；3）将所述重组载体转入宿主菌中获得重组菌株；4）将所述重组菌株侵染并转化植物，通过直接观察色素积累判断启动子的活性和组织特异性；观察植物的颜色，若植物出现红色或紫红色，则待检测启动子有活性，若植物未发生颜色变化，则待检测启动子无活性；植物某一组织出现红色或紫红色，则待检测启动子具有该组织特异性。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、本发明提供的patchs启动子可以驱动目标基因（甜菜红素生物合成关键酶的融合基因）在烟草的特定器官中特异性表达，表现为在花器官中活性最高，同时在营养组织（如茎、叶柄）中具有“渗漏表达”的广谱性启动子，通过将patchs启动子与所述融合基因连接后转入烟草中，patchs启动子驱动所述融合基因在烟草特异组织中表达，提高了所述融合基因在特异组织中的表达水平；本发明提供的patchs启动子为植物分子育种提供了一种新方法。

21、进一步的，本发明将所述patchs启动子、甜菜红素生物合成关键酶的融合基因和来源于豌豆的终止子tpsrbcs连接构建完成的基因表达盒，再连入植物表达载体，并转化烟草；本发明不仅创制了一种能够高效积累甜菜红素的转基因烟草新种质，为这种高价值色素（甜菜红素）的植物生物反应器生产提供了新材料。