用于沉默老芒麦EsPDS基因的特异性片段及方法
本发明属于生物，具体涉及一种用于沉默老芒麦espds基因的特异性片段及方法。
背景技术：
1、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，vigs）是通过携带目的基因片段的重组病毒载体抑制植物内源基因表达的反向遗传学技术，依托植物自身天然存在的rna沉默免疫机制实现基因转录后水平沉默。相较于基因敲除、突变体筛选及稳定遗传转化等传统手段，vigs技术无需构建稳定转基因植株，具有试验周期短、操作简便、成本低廉及可高通量筛选等突出优势，已成为植物功能基因组学研究的核心工具之一。
2、烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，trv）是目前应用最广泛的vigs载体之一，具有寄主范围广、病毒症状温和、沉默效率高等特点，已在番茄（solanum lycopersicum）、烟草（nicotiana tabacum）、辣椒（capsicum annuum）、拟南芥（arabidopsis thaliana）、矮牵牛（petunia hybrida）等多种双子叶植物中成功应用。然而，由于单子叶植物与双子叶植物在病毒侵染机制、基因沉默通路响应及组织再生特性等方面存在显著差异，trv-vigs体系在禾本科植物中的建立面临较大挑战，目前尚未见适用于老芒麦的成熟报道。
3、老芒麦（elymus sibiricus l.）是禾本科披碱草属多年生优良牧草，广泛分布于我国青藏高原、西北及华北高寒地区，是青海、西藏、四川、甘肃、内蒙古等地草地生态恢复与人工草地建植的重要草种。其具有抗寒、耐旱、耐瘠薄、适口性好、营养价值高等优良特性，是高寒地区草食家畜的重要饲草来源。此外，老芒麦根系发达、返青早、枯黄晚，在退化草地修复、水土保持及草原生态治理中发挥着重要作用。因此，建立老芒麦高效、稳定的trv-vigs基因沉默体系，对于突破其功能基因组学研究瓶颈、加速重要性状相关基因的功能鉴定具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速、高通量分析鉴定老芒麦espds基因基因功能的用于沉默老芒麦espds基因的特异性片段。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该用于沉默老芒麦espds基因的特异性片段，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
3、进一步的是，所述特异性片段采用如下方式获得：
4、1）、获取espds全长基因序列
5、首先，获得拟南芥atpds（at4g14210）基因蛋白质序列，然后在sequence readarchive (sra)数据库中，利用老芒麦转录组测序数据，通过tblastn比对查找老芒麦同源基因，获得八氢番茄红素脱氢酶基因espds的全长cdna序列，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、2）、以八氢番茄红素脱氢酶基因espds的全长基因序列为模板，设计用于扩增espds基因cds结构域上的300bp特异性片段的引物espds-f和espds-r；其核苷酸序列分别为：
7、espds-f：5'-ggcttctaccagcaatgcttg-3'
8、espds-r：5'-cctcaccacccaaagactgaat-3'
9、通过同源重组法构建载体，在上述基因特异性引物espds-f和espds-r的5'端分别引入与ptrv2载体xbai和bamhi酶切位点两侧同源的序列，获得全长扩增引物espds-f-rec和espds-r-rec，其序列如下：
10、espds-f-rec：
11、5'-aaggttaccgaattctctagaggcttctaccagcaatgcttg-3'
12、espds-r-rec：
13、5'-cgtgagctcggtaccggatcccctcaccacccaaagactgaat-3'
14、3）、取老芒麦幼嫩叶片，液氮研磨成粉后，用eastep®super 总rna 提取试剂盒操作步骤提取rna，按照hiscript® ii 1st strand cdna synthesis kit（vazyme，r211-01）反转录试剂盒操作步骤合成cdna第一链，于-20℃保存；以cdna为模板利用引物对espds-f-rec和espds-r-rec进行pcr扩增，获得两端带有同源臂的espds基因特异性片段，其基因特异性部分大小为300bp，核苷酸序列如seq id no.1所示。
15、进一步的是，所述pcr扩增反应体系（20μl）为：cdna模板 1 μl，上下游引物（10μm）各1.5μl，dntp mixture（各2.5 mm）1 μl，taq dna聚合酶（5 u/μl）0.2 μl，补加ddh2o至20μl
16、进一步的是，所述pcr扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共34个循环；72℃终延伸5 min。
17、本发明还提供了一种利用上述特异性片段用于沉默老芒麦espds基因的方法，包括以下步骤：
18、a、构建重组病毒载体ptrv2-espds：利用同源重组技术将espds基因特异性片段连接至vigs病毒骨架载体ptrv2中，构建获得重组病毒载体ptrv2-espds；
19、b、农杆菌转化与阳性鉴定：通过冻融法将重组病毒载体ptrv2-espds转化至农杆菌eha105感受态细胞中，涂布于含50 μg/ml卡那霉素和50 μg/ml利福平的lb平板上进行抗性筛选，获得阳性克隆后，再通过pcr扩增进行阳性鉴定；
20、c、混合菌液制备：将步骤b鉴定为阳性的含ptrv2-espds农杆菌菌液与含ptrv1辅助质粒的农杆菌菌液，按菌液体积比1:1混合，用新鲜lb培养基稀释至od600值为0.8-1.5，得到混合菌液；然后向所述混合菌液中依次加入半胱氨酸、tween-20及乙酰丁香酮，使各组分在混合菌液中的终浓度分别达到400 mg/l半胱氨酸、0.5% (v/v) tween-20及150 μmol/l，于室温黑暗条件下静置1 h，得到用于侵染的混合菌液；
21、d、真空渗透处理：取老芒麦刚萌发的种子，置于步骤c所得用于侵染的混合菌液中，真空渗透处理1.5 h，超声波处理 5 min；
22、e、超声波处理：将d真空渗透处理后的老芒麦种子连同d中的混合菌液，进行超声波处理，超声频率40khz，功率120w，震荡间隔时间为5s，共超声时间为5min；
23、f、共培养孵育：将步骤e超声波处理后的老芒麦种子取出，置于新鲜配置的混合菌液中，恒温振荡培养，于20℃- 25℃条件下进行低速孵育处理，振荡频率为80 rpm，孵育时间为1h；
24、g、培养与检测：将步骤e孵育后的老芒麦种子转移至石英砂上，放置培养箱中，培养条件为20℃-25℃，光照/黑暗=14h/10h的条件下生长，观察新长出的老芒麦叶片的表型变化，并检测叶片中espds的表达情况，即构建得到老芒麦espds基因序列沉默体系。
25、本发明的有益效果在于：本发明首次从老芒麦中克隆获得八氢番茄红素脱氢酶基因espds的特异性沉默片段，并成功建立了基于trv载体的vigs沉默体系；本发明通过农杆菌侵染液配方优化（乙酰丁香酮、半胱氨酸、tween-20协同使用）结合真空渗透与共培养孵育处理，有效克服了禾本科植物细胞壁屏障和天然免疫反应对农杆菌侵染的阻碍，成功解决了trv-vigs体系在禾本科植物中侵染效率低的技术难题，使trv载体首次能够在老芒麦中实现高效侵染和基因沉默；该体系操作简便、周期短，无需构建稳定转基因植株，可高效、特异性地沉默老芒麦内源espds基因，致使植株叶片出现明显的白化表型；本发明有效克服了老芒麦遗传转化效率低、传统转基因技术难以快速鉴定基因功能的瓶颈问题，为老芒麦生长发育、抗逆调控、种质性状形成等关键基因的功能解析提供了可靠的技术平台，对推动禾本科牧草功能基因组学研究具有重要价值。