鲤原始生殖细胞的高特异性标记基因及其应用

本发明属于鱼类分子生物学和水产遗传育种，尤其涉及鲤原始生殖细胞的高特异性标记基因及其应用。

背景技术：

1、原始生殖细胞（primordial germ cells, pgcs）是生殖细胞的祖细胞，是胚胎发育过程中最早形成的一群生殖细胞。在鱼类中，pgcs由继承了生殖质（germ plasma）的早期胚胎细胞特化而来，特化形成的pgcs边增殖边迁移，到达性腺原基后协同周围体细胞形成完整的生殖腺，最终分化为卵子或精子。pgcs是胚胎发育阶段唯一能将遗传信息传递给子代的细胞类群，因具有可被标记、剔除、分离及全能性等特点，已成为鱼类生物工程技术的理想遗传操作对象。

2、在鱼类遗传育种中，pgcs的精准识别和追踪具有重要的应用价值：一是用于性别控制育种，通过pgc的精准剔除或操作实现全雌鲤、全雄鲤等单性群体的高效创制；二是用于生殖细胞移植和种质资源保存；三是用于研究性腺分化过程中生殖细胞与体细胞的相互作用机制。

3、鱼类pgcs的精准标记与特异性鉴定是开展鱼类生殖发育机制研究、种质资源保存、生殖细胞操作及种质创新的核心基础。目前鱼类pgcs的识别与标记主要依赖少数已知的保守标记基因，现有主流标记基因及存在的技术缺陷具体如下：

4、（1）

ddx4（vasa）基因。该基因为目前多种鱼类通用的pgcs标记基因，广泛应用于鱼类生殖细胞定位与鉴定。但该基因表达不具备阶段特异性，不仅在原始生殖细胞中表达，还持续表达于后续发育的精原细胞、卵原细胞及各阶段生殖细胞中，无法从细胞层面精准区分pgcs与后续分化的生殖细胞类群。

5、（2）

dnd1基因。该基因在鱼类胚胎发育阶段特异性富集于原始生殖细胞，编码进化保守的rna结合蛋白，是现阶段应用较多的pgcs候选标记基因。但现有研究证实，

dnd1基因在pgcs之外的其他生殖细胞亚群中仍存在不同程度的异位表达，无法实现pgcs的专一性标记，检测特异性存在明显局限。

6、（3）

nanos3基因。该基因可在青鳉、斑马鱼等模式鱼类中与

dnd1基因协同调控pgc样细胞的形成与发育，常用于辅助识别生殖细胞。但该基因同样存在表达特异性不足的问题。

7、综上，现有鱼类pgc标记技术普遍存在四大核心缺陷，严重制约了鲤pgcs的基础研究与产业化应用：

8、第一，标记特异性不足。现有常规标记基因普遍在pgcs、生殖干细胞（gsc）、精原细胞、卵原细胞等多个生殖细胞亚群中广谱表达，无法在单细胞水平精准区分早期原始生殖细胞与后续分化的生殖细胞，难以实现pgcs的精准识别、动态追踪及靶向特异性操作。

9、第二，物种适用性局限大。不同鱼类物种间pgc标记基因的核酸序列、表达模式及调控机制差异显著，斑马鱼、青鳉等模式鱼类中已报道的标记基因体系，无法直接适配鲤等重要经济鱼类的生殖细胞标记与检测需求，技术通用性差。

10、第三，可用标记基因资源匮乏。目前业内可稳定用于鱼类pgc鉴定的特异性标记基因数量极少，分子工具单一，难以适配pgc分子定量检测、原位定位、活体示踪、流式分选、靶向编辑等多元化实验与应用场景。

11、第四，缺乏鲤专属高特异性标记体系。现有技术中尚无专门针对鲤（

cyprinus

carpio）pgcs的高特异性标记基因及配套检测方法的公开报道，导致鲤pgcs的精准鉴定、发育机制研究及生殖细胞工程应用缺乏核心技术支撑。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供鲤原始生殖细胞的高特异性标记基因及其应用。

2、为了实现上述目的，本申请采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一组在鲤原始生殖细胞中特异性表达的标记基因，所述标记基因由核苷酸序列如seq id no. 1-21所示的其中一个或多个基因组成。

4、第二方面，本发明提供了用于鲤原始生殖细胞鉴定的引物对，所述引物对基于上述标记基因设计，其核苷酸序列如seq id no. 22-63所示。

5、第三方面，本发明提供了一种鲤原始生殖细胞检测试剂盒，包括以下组分：

6、（1）基于上述标记基因设计的特异性引物对或探针；

7、（2）阳性对照；

8、（3）阴性对照；

9、（4）2× sybr green qpcr master mix；

10、（5）无核酸酶水。

11、第四方面，本发明提供了上述标记基因在鲤原始生殖细胞鉴定、示踪和分选中的应用。

12、第五方面，本发明提供了上述标记基因在鲤性别控制育种中的应用。

13、第六方面，本发明提供了上述标记基因在鲤生殖细胞示踪中的应用。

14、第七方面，本发明提供了上述标记基因在鲤种质资源保护中的应用。

15、本发明的有益效果在于：

16、（1）特异性更高：相较于现有pgcs标记基因，本发明首次在鲤中系统鉴定出21个pgcs特异性标记基因，其在pgcs中特异性高表达，在gsc、精原细胞、卵原细胞、减数分裂各阶段细胞及体细胞中均不表达或极低表达，可实现pgcs的精确定位和识别。

17、（2）选择更多样：本发明一次性提供21个pgcs标记基因，为不同应用场景（如原位杂交、免疫染色、流式分选、活体示踪、基因敲除等）提供了多样化的分子工具选择。

18、（3）鲤专属：本发明专门针对鲤（

cyprinus carpio）开发，克服了模式生物标记基因在鲤中应用效果不佳的问题。

19、（4）应用前景广阔：本发明可广泛应用于鲤的性别控制育种、生殖细胞移植、种质资源保护及性腺发育机制研究等领域。

1.一组在鲤原始生殖细胞中特异性表达的标记基因，其特征在于：所述标记基因由核苷酸序列如seq id no. 1-21所示的其中一个或多个基因组成。

2.用于鲤原始生殖细胞鉴定的引物对，其特征在于：所述引物对基于权利要求1所述标记基因设计，其核苷酸序列如seq id no. 22-63所示。

3.一种鲤原始生殖细胞检测试剂盒，其特征在于：包括以下组分：

4.权利要求1所述标记基因在鲤原始生殖细胞鉴定、示踪和分选中的应用。

5.权利要求1所述标记基因在鲤性别控制育种中的应用。

6.权利要求1所述标记基因在鲤生殖细胞示踪中的应用。

7.权利要求1所述标记基因在鲤种质资源保护中的应用。