一种具有高酶活的碱性蛋白酶及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程与工业酶制剂，具体地涉及一种具有高酶活的碱性蛋白酶及其应用。

背景技术：

1、碱性蛋白酶（alkaline protease，ec 3.4.21.62）是全球用量最大的工业水解酶之一，广泛应用于洗涤剂、纺织退浆、皮革脱毛及食品加工等领域。其中，丝氨酸蛋白酶（subtilisin样蛋白酶）是最主要、最常见的碱性蛋白酶类型。

2、现有野生型碱性蛋白酶在碱性、高温条件下活性较高，但一旦进入中性或弱碱性环境（ph 7.0-7.5），活性便迅速下降，温和洗涤、医用创口清创及食品酶解等场景难以适用。此外，在工业应用中，反应底物成分复杂，对碱性蛋白酶的水解效率和抗抑制能力都有较高的要求。然而传统定向进化方法因突变空间巨大（多达20的275次方）、结构-功能关系认知不足，难以实现活性、稳定性与底物谱的协同优化。因此，提供一种与已知蛋白酶一级序列差异显著、且在中性条件下保持高催化活性的丝氨酸蛋白酶及其配套技术方案，具有重要的工业应用价值。

3、近年来，深度学习序列生成模型（如carbonara）能依据蛋白质结构在数秒内产出百万级的高质量突变序列库，分子对接技术则可精确评估酶与底物的结合情况，二者为酶蛋白的理性改造开辟了新途径。不过，现有技术中尚无将二者深度融合、系统用于碱性蛋白酶多性能协同提升的成熟方案。

4、综上所述，本领域迫切需要开发具有高催化活性，尤其在中性条件下可维持酶活性的碱性蛋白酶。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有高酶活的碱性蛋白酶及其应用。

2、本发明第一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽选自下组：

3、(1) 具有如seq id no:1或2所示的氨基酸序列的多肽；

4、(2) 将如seq id no:1或2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、较优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有碱性蛋白酶活性的多肽；

5、(3) 序列中含有(1)或(2)中所述多肽序列的衍生多肽；和

6、(4) 氨基酸序列与seq id no:1或2所示氨基酸序列的同源性≥85%(较佳地≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥ 94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%)并具有碱性蛋白酶活性的多肽。

7、在另一优选例中，所述(3)为由(1)或(2)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。

8、在另一优选例中，所述的多肽的氨基酸序列如seq id no:1或2所示。

9、在另一优选例中，所述多肽为丝氨酸蛋白酶。

10、在另一优选例中，所述的多肽用于水解蛋白质。

11、在另一优选例中，在碱性条件下，所述多肽的酶活≥10000 u/ml，较佳地≥15000u/ml，更佳地≥18000 u/ml，最佳地≥20000 u/ml。

12、在另一优选例中，所述碱性条件为ph为8.0-11.5。

13、在另一优选例中，在中性条件下，所述多肽的酶活≥8000 u/ml，较佳地≥10000u/ml，更佳地≥12000 u/ml。

14、在另一优选例中，所述中性条件为ph为6.5-7.5。

15、在另一优选例中，所述多肽的蛋白热变性温度tm≥60℃。

16、在另一优选例中，所述的多肽经过化学修饰和/或固定化修饰。

17、在另一优选例中，所述化学修饰选自下组：乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰、或其组合。

18、在另一优选例中，所述多肽连接有用于检测和/或纯化的标签。

19、在另一优选例中，所述标签选自下组：his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、cmyc、profinityexact、或其组合。

20、本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码如本发明第一方面所述的多肽。

21、在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：

22、(a) 核苷酸序列如seq id no:9所示的多核苷酸；

23、(b) 核苷酸序列与seq id no:9所示的核苷酸序列的同一性≥80%，≥85%，≥90%，≥91%，≥92%，≥93%，≥94%，≥95%，≥96%，≥97%，≥98%，≥99%或≥99.5%，且编码如本发明第一方面所述的多肽的多核苷酸；

24、(c) 在seq id no:9所示的核苷酸序列的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸，且编码如本发明第一方面所述的多肽的多核苷酸；或

25、(d) 与(a)-(c)中任一所述多核苷酸互补的多核苷酸。

26、在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no:9所示。

27、在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述多肽的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、或其组合。

28、在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：dna序列、rna序列、或其组合。

29、本发明第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

30、在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

31、在另一优选例中，所述表达载体包括原核表达载体和真核表达载体。

32、本发明第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的多核苷酸。

33、在另一优选例中，所述细胞为原核细胞或真核细胞。

34、在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞，如芽孢杆菌。

35、在另一优选例中，所述宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。

36、在另一优选例中，所述宿主细胞为芽孢杆菌。

37、在另一优选例中，所述宿主细胞为地衣芽孢杆菌（

bacillus licheniformis）或枯草芽孢杆菌（

bacillus subtilis）。

38、本发明第五方面，提供了如本发明第一方面所述的多肽的制备方法，包括以下步骤：

39、(1) 在适合蛋白表达的条件下，培养如本发明第四方面所述的遗传工程化的宿主细胞，从而获得包含所述多肽的培养物；和

40、(2) 任选地，从所述培养物中分离和/或纯化所述多肽。

41、本发明第六方面，提供了如本发明第一方面所述的多肽的用途，用于水解蛋白或用于制备水解蛋白的酶制剂。

42、本发明第七方面，提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含如本发明第一方面所述的多肽。

43、在另一优选例中，所述酶制剂为固定化酶制剂。

44、本发明第八方面，提供了一种水解蛋白的方法，包括步骤：

45、在如本发明第一方面所述的多肽或如本发明第七方面所述的酶制剂存在的条件下，水解蛋白。

46、在另一优选例中，所述水解蛋白在碱性条件下进行。

47、在另一优选例中，所述碱性条件为ph为8.0-11.5。

48、在另一优选例中，所述水解蛋白在中性条件下进行。

49、在另一优选例中，所述中性条件为ph为6.5-7.5。

50、在另一优选例中，所述水解蛋白在30-65℃下进行，较佳地在35-60℃下进行，更佳地在40-55℃下进行。

51、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。