一种高亲和力Microvirin突变体及其应用

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及蛋白质工程、基因改造、治疗性蛋白药物开发及诊断技术，尤其涉及mvn关键氨基酸的突变对于mvn亲和力的提升及其应用。

背景技术：

1、microvirin(以下简称mvn)是一种从蓝藻中分离出来的可以特异性识别α-1,2-甘露糖的凝集素。它与cyanovirin-n(以下简称cvn)具33％的同源性，对末端含有α-1,2-甘露糖的高甘露糖型聚糖表现出高度特异性。microvirin具有广泛的抗病毒活性，能够特异性识别并结合病毒表面的高甘露糖修饰，从而抑制病毒感染宿主细胞。研究表明，mvn对hiv-1病毒具有显著的抑制作用，其ec50值在纳摩尔水平，且具有较低的细胞毒性。与cvn相比，mvn的细胞毒性要低50倍以上，并且不会增加cd4+t淋巴细胞中激活标记物cd25、cd69和hla-dr的表达水平。由于其独特的作用机制和良好的安全性，mvn被认为是潜在的抗hiv先导化合物，在新型抗病毒药物开发中具有重要的研究价值，是重新设计以预防人类病毒感染的更具吸引力的靶点。此外，mvn的这种糖识别特性也使其在抗肿瘤、抗炎、生物标记和疾病诊断等领域具有应用前景。

2、提高凝集素的亲和力对于其作为抗病毒药物、肿瘤标志物识别工具以及生物传感器等应用至关重要，因为更强的结合力意味着更低的有效剂量和更好的治疗效果。同样地，提高mvn与其糖基配体的结合亲和力，能够增强其识别病毒表面特定糖蛋白的能力，从而更有效地阻断病毒与宿主细胞的结合，抑制病毒的入侵和复制，对于扩展mvn在生物医药领域的应用具有重要意义。基于mvn糖结合区域的关键氨基酸对mvn进行进化和改造，以期获得和α-1,2-甘露糖具有更高亲和力的mvn突变体，是一种提高mvn生物学功能的有效策略，也是推动凝集素相关研究和应用发展的重要手段。例如，在癌症生物标志物的研究中，高亲和力的凝集素可以更有效地富集和识别与癌症相关的糖蛋白，

3、筛选并获得具有对α-1,2-甘露糖具有高亲和力的凝聚素是产业发展的重要课题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种提高mvn对α-1,2-甘露糖亲和力的有效突变体。本发明通过无缝pcr技术，对mvn活性结构域的关键氨基酸进行突变，基于基因工程技术和手段，在原核表达系统中重组获得了mvn不同形式的突变体，通过elisa，itc等检测mvn和α-1,2-甘露糖的亲和力，获得一种可以有效提升mvn亲和力的突变体，为mvn在生物医药领域的应用提供理论基础和依据。

2、本发明所采用的技术方案包括如下方面：

3、一种mvn蛋白突变体，其特征在于所述突变体的序列与野生型mvn蛋白序列(seqid no.1)相比具有90％以上的序列一致性，并且所述突变体与α-1,2-甘露二糖的结合亲和力是野生型mvn蛋白与α-1,2-甘露二糖结合亲和力的2倍及以上。

4、在本发明的另一方面，所述的mvn蛋白突变体包含t82r突变。

5、在本发明的另一方面，所述突变体的序列如seq id no:5所示。

6、本发明还提供了编码上述mvn突变体的核苷酸分子。

7、在本发明的另一方面，所述核苷酸分子的序列如seq id no:9所示。

8、本发明还提供了包含如上所述核苷酸分子的表达载体或宿主细胞。

9、本发明还提供了包含如上所述表达载体的宿主细胞。

10、本发明还提供了如上所述的mvn蛋白突变体在检测高甘露糖型，尤其是在检测α-1,2-甘露二糖中的应用。

11、本发明还提供了如上所述的mvn蛋白突变体及所述的核苷酸分子在制备治疗疾病中的应用。

12、在本发明的另一方面，所述疾病为肿瘤、炎症、感染、免疫失调。

13、本发明还提供了如如上所述的mvn蛋白突变体及所述的核苷酸分子在药物递送中的应用。

14、更进一步的，本发明所提供的mvn突变体，命名为mvn-t82r，其氨基酸序列如seqid no:5所示，其中相当于野生型mvn蛋白seq id no.1，该突变体的第82位苏氨酸被精氨酸取代。

15、mvn-t82r突变体的结构特征，在于精氨酸的引入改变了电势能，增强了与α-1,2-甘露糖的结合能力。

16、mvn-t82r突变体的表达载体设计，通过无缝pcr技术将mvn基因的第82位氨基酸的密码子由aca替换为cgc。

17、mvn-t82r突变体的表达与纯化，将pet28a-mvn-t82r-his转化至宿主细胞bl21(de3)，诱导表达后通过亲和层析纯化获得mvn-t82r蛋白。

18、mvn-t82r突变体对高甘露糖蛋白的亲和力提高2倍，适用于高灵敏度检测或靶向治疗。

19、mvn-t82r突变体对α-1,2-甘露二糖的亲和力提高2倍，适用于高灵敏度检测或靶向治疗。

20、本发明的有益效果为：

21、本发明提供了一种对高甘露糖蛋白，尤其是对α-1,2-甘露二糖具有更高亲和力的mvn有效突变体及应用。本发明通过无缝pcr技术，对mvn活性结构域的关键氨基酸进行突变，基于基因工程技术和手段，通过ni柱亲和层析，在原核表达系统中重组获得了mvn-d53w，mvn-d53q，mvn-d53k，mvn-t82r四种不同形式的突变体。通过elisa检测了mvn及其不同形式的突变体和高甘露糖型n-聚糖修饰的山羊蛋白的亲和力强弱，发现mvn-t82r突变体可以将ec50降低一半。而后通过itc检测了mvn和α-1,2-甘露糖的亲和力，确证了t82r突变体可以将mvn亲和力提高2倍。因此，本发明提供了有效提高mvn亲和力的突变分子mvn-t82r，为推动mvn在疾病诊断及治疗中的应用提供依据。

1.一种mvn蛋白突变体，其特征在于所述突变体的序列与野生型mvn蛋白序列(seq idno.1)相比具有90％以上的序列一致性，并且所述突变体与α-1,2-甘露二糖的结合亲和力是野生型mvn蛋白与α-1,2-甘露二糖结合亲和力的2倍及以上。

2.根据权利要求1所述的mvn蛋白突变体，其特征在于，所述突变体包含t82r突变。

3.根据权利要求2所述的mvn蛋白分子突变体，其特征在于，所述突变体的序列如seqid no:5所示。

4.编码如权利要求1-3中任一项所述mvn突变体的核苷酸分子。

5.根据权利要求4所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸分子的序列如seq id no:9所示。

6.包含如权利要求4或5所述核苷酸分子的表达载体。

7.包含如权利要求4或5所述核苷酸分子或如权利要求6所述表达载体的宿主细胞。

8.如权利要求1-3中任一项所述的mvn蛋白突变体在检测高甘露糖型，尤其是α-1,2-甘露二糖中的应用。

9.如权利要求1-3中任一项所述的mvn蛋白突变体及如权利要求4-5所述的核苷酸分子在制备治疗疾病中的应用，优选的所述疾病为肿瘤、炎症、感染、免疫失调。

10.如权利要求1-3中任一项所述的mvn蛋白突变体及如权利要求4-5所述的核苷酸分子在药物递送中的应用。