一种三维细胞培养生物反应器及培养方法与流程

本发明涉及生物医学工程，更具体地，涉及一种三维细胞培养生物反应器及培养方法。

背景技术：

1、随着组织工程、类器官构建、再生医学及生物制药等领域的快速发展，三维细胞培养技术已成为体外模拟组织微环境、药物筛选及细胞治疗产品规模化生产的关键支撑手段。然而，如何实现高密度三维细胞培养，尤其是保障培养体系中细胞功能与活性的长期稳定维持，已成为制约上述领域从实验室研究向产业化应用转化的核心技术瓶颈。

2、目前，常规的三维细胞培养系统主要包括静态培养体系、搅拌式生物反应器培养体系及灌流培养体系等。静态培养（如t型瓶、多层细胞工厂等）操作简便，但由于缺乏对流和主动传质，营养物质和氧气主要依赖扩散传递，传质效率极低，难以支持高密度细胞生长。搅拌式生物反应器（如搅拌罐式反应器、旋转壁式反应器等）通过机械搅拌或旋转营造培养液流动，增强了培养体系内的混合与传质，但搅拌产生的剪切力对细胞尤其是干细胞、肝细胞等剪切敏感型细胞易造成不可逆损伤，限制了其适用范围。灌流培养系统通过持续或间歇地向反应器内泵入新鲜培养液并排出用液，能够在一定程度上改善营养物质供给和代谢废物清除，但培养液消耗量大、利用率低，且设备复杂、操作成本较高，难以满足经济性要求。

3、在上述培养体系中，氧气供应始终是限制高密度三维细胞培养的最核心问题之一。现有系统通常依赖培养液中溶解氧的液相传递来满足细胞呼吸需求。当细胞密度增加至一定水平（如106cells/ml以上）时，细胞的单位体积耗氧速率显著上升，而氧气在培养液中的扩散系数较低（约为2×10-5cm²/s），有效扩散距离通常仅为数百微米。这一物理限制导致反应器内部尤其是三维支架或细胞聚集体中心区域出现严重的氧浓度梯度，形成局部缺氧微环境，进而引发细胞坏死、线粒体功能障碍、代谢重编程异常以及关键功能蛋白表达下调等一系列问题，严重影响培养质量和实验数据的可靠性。

4、为解决供氧不足的问题，本领域已提出了若干改进策略。提高培养液循环流速可在一定程度上强化对流传输，但受限于细胞对剪切力的耐受阈值，流速提升空间有限。直接向培养液中鼓泡曝气能够大幅提高溶氧浓度，但气泡破裂所产生的剪切力及气液界面表面张力对悬浮细胞及微载体培养体系中的贴壁细胞具有明显的损伤效应，同时大量气泡的存在也会干扰光镜观察和在线监测。采用透气性培养瓶底或透气膜封装方式增加气液接触面积，虽然能够改善静态培养条件下的氧气补给，但其供氧速率受限于膜面积和膜两侧氧分压差，且随着培养规模放大，比表面积急剧下降，无法满足大规模高密度培养的供氧需求。此外，上述各种增氧方式均存在局部氧浓度波动大的问题，无法稳定模拟体内毛细血管网向周围组织持续、均匀供氧的生理过程，不利于构建仿生氧微环境。

5、值得注意的是，膜曝气生物膜反应器（membrane aerated biofilm reactor,mabr）是一种在污水处理领域发展较为成熟的新型生物反应器技术。其核心工作原理为：氧气通过具有透气性的中空纤维膜壁向附着在膜外表面的生物膜内部扩散，而有机底物和营养物质则由液相主体向生物膜内部传递，氧气与底物的传质方向相反，形成典型的反向扩散传质结构。在该传质模式下，氧气与营养物质的浓度梯度方向相反，生物膜内靠近膜壁一侧氧浓度较高而底物浓度较低，靠近液相一侧则相反，从而实现生物膜内活性组分的分区分布。mabr具有氧利用率高（可达80%~100%）、供氧稳定、无需鼓泡、能耗低且膜比表面积大等显著技术优势。然而，迄今为止，mabr技术的应用场景主要局限于废水处理中的微生物硝化、反硝化及有机污染物降解等领域，尚未见将其反向扩散供氧传质机制迁移应用于哺乳动物细胞三维培养、类器官规模化扩增或组织工程构建体培养的系统性设计方案。由于哺乳动物细胞与微生物在培养条件（温度、ph、渗透压、剪切力耐受性）、代谢特性（需氧量、营养需求、代谢产物种类）及培养周期等方面存在根本性差异，mabr在污水处理领域的既有系统构型和操作参数无法直接转用，二者之间的技术鸿沟使得这一应用方向的提出远非显而易见的简单转用。

6、此外，现有三维细胞培养过程中，培养基的供给策略大多采用批次培养或半连续换液方式。培养过程中细胞持续消耗葡萄糖、氨基酸、维生素及生长因子等关键营养物质，同时不断向培养体系中释放乳酸、氨及其他酸性代谢副产物。随着培养时间的延长，营养物质逐步耗竭而代谢废物不断累积，导致培养环境ph下降、渗透压升高、营养匮乏，严重抑制细胞增殖和功能表达。为维持细胞活性，操作者通常需要频繁更换大量培养基，不仅显著提高了培养成本（尤其是含血清培养基或含特定生长因子的无血清培养基成本高昂），而且换液操作引起的温度、ph及生化成分的瞬时剧烈波动极易对细胞造成应激刺激，不利于长期稳定培养。虽然已有灌流培养系统实现了培养液的连续流入和流出，但现有大多数灌流系统仅为“单向通过式”或“部分循环式”，缺乏对流出培养液进行代谢废物选择性清除和关键营养组分精确回补的培养基回收再利用功能，大量尚含可利用成分的培养液被直接废弃，培养基整体利用率偏低，难以兼顾高密度培养、稳定供氧和培养基高效利用的多重目标。

7、综上所述，现有三维细胞培养技术领域亟需一种能够同时解决高密度培养条件下稳定供氧、避免剪切损伤、构建仿生氧微环境，并实现培养基循环利用与代谢废物动态清除的新型生物反应器系统及相应的培养方法，以突破当前制约组织工程、类器官及生物制造等领域产业化发展的技术瓶颈。本发明正是基于上述需求而提出。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种能够同时解决高密度培养条件下稳定供氧、避免剪切损伤、构建仿生氧微环境，并实现培养基循环利用与代谢废物动态清除的三维细胞培养生物反应器及培养方法。

2、为解决上述问题，本技术采用下述技术方案：

3、本技术目的之一，提供一种三维细胞培养生物反应器，包括：

4、膜曝气供氧模块，所述膜曝气供氧模块包括若干中空纤维膜，所述中空纤维膜被配置为允许含氧气体在膜内流动，并使氧气通过膜壁向膜外的培养区域扩散；

5、细胞培养模块，所述细胞培养模块被配置为允许细胞在所述中空纤维膜的外部空间进行三维培养；

6、培养液模块，所述培养液模块被配置为向所述培养区域提供细胞培养液；

7、其中，所述反应器被构造成反向扩散传质结构，所述反向扩散传质结构使得氧气由所述中空纤维膜内部向所述培养区域的传递方向，与营养物质由所述培养液向所述培养区域的传递方向相反；

8、监测与控制模块，所述监测与控制模块包括若干传感器，用于实时监测培养参数，并基于监测结果进行反馈控制。

9、在其中一些实施例中，所述中空纤维膜的材料选自聚4-甲基-1-戊烯、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯中的至少一种。

10、在其中一些实施例中，所述含氧气体为氧气、空气或氧气与二氧化碳的混合气体。

11、在其中一些实施例中，所述细胞培养液中含有葡萄糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、血清或无血清培养基成分中的至少一种。

12、在其中一些实施例中，所述细胞选自干细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞、肿瘤细胞和神经细胞中的至少一种。

13、在其中一些实施例中，所述细胞培养模块中，细胞在所述中空纤维膜外表面直接贴壁生长，或在悬浮于所述培养液中的微载体表面贴壁生长。

14、在其中一些实施例中，所述监测与控制模块的传感器包括溶解氧传感器、ph传感器、温度传感器和流量传感器中的至少一种。

15、在其中一些实施例中，还包括培养基循环回收模块，所述培养基循环回收模块与所述细胞培养模块连通，用于对流出所述反应器的培养液进行回收处理并回输至所述反应器。

16、在其中一些实施例中，所述培养基循环回收模块包括：

17、细胞/微载体留存模块，用于将细胞或微载体保留于所述反应器内，并使培养液进入循环回路；

18、代谢废物清除纯化模块，用于对循环回路中的培养液进行代谢副产物的去除；

19、营养液补加模块，用于向循环回路中的培养液补充营养物质。

20、在其中一些实施例中，所述代谢副产物包括乳酸和/或氨。

21、在其中一些实施例中，所述营养物质包括葡萄糖、氨基酸、生长因子中的至少一种。

22、本技术目的之二，提供了一种所述反应器的三维细胞培养方法，包括以下步骤：

23、将细胞接种于所述反应器的中空纤维膜外部空间，并供应细胞培养液进行三维培养；

24、向所述中空纤维膜内通入含氧气体，使氧气通过膜壁向所述外部空间扩散；

25、在培养过程中，通过所述监测与控制模块实时监测培养参数并进行反馈控制；

26、其中，氧气由膜内向培养区域的传递方向与营养物质由培养液向培养区域的传递方向相反，形成反向扩散传质。

27、在其中一些实施例中，还包括培养基循环回收步骤：

28、将流出所述反应器的培养液引出，进行代谢废物去除和/或营养物质补加后，再返回所述反应器继续参与培养。

29、在其中一些实施例中，所述代谢废物去除包括去除乳酸和/或氨。

30、在其中一些实施例中，所述营养物质补加包括补充葡萄糖、氨基酸和/或生长因子。

31、本技术采用上述技术方案，其有益效果如下：

32、本技术提供的三维细胞培养生物反应器，包括：膜曝气供氧模块，包括若干中空纤维膜，被配置为允许含氧气体在膜内流动，并使氧气通过膜壁向膜外的培养区域扩散；细胞培养模块，被配置为允许细胞在所述中空纤维膜的外部空间进行三维培养；培养液模块，被配置为向培养区域提供细胞培养液；及监测与控制模块，包括若干传感器，用于实时监测培养参数，并基于监测结果进行反馈控制。本技术通过透气膜无泡供氧与反向扩散传质结构的协同作用，供氧效率显著提升、无剪切损伤、仿生微环境真实构建、传质过程独立可控、培养环境长期稳定，为三维细胞培养从实验室规模向产业化应用提供了切实可行的技术路径。