一种β-呋喃果糖苷酶突变体及其在低聚乳果糖合成中的应用

本发明属于生物催化，具体涉及一种高活性的β-呋喃果糖苷酶突变体及其在低聚乳果糖合成中的应用。

背景技术：

1、目前，低聚乳果糖（lactosucrose，简称los）的规模化制备主要依赖于以蔗糖和乳糖为廉价底物的生物酶催化法，其中糖苷水解酶gh68家族的β-呋喃果糖苷酶（又称β-呋喃果糖基转移酶，β-fructofuranosidase，简称ftase）是催化该反应的核心工具酶。然而，天然微生物来源的野生型β-呋喃果糖苷酶通常存在催化活力受限、转糖基/水解活性比值偏低等缺陷。

2、为改善酶催化性能，现有技术中已有针对β-呋喃果糖苷酶催化活性中心进行定点改造的报道，例如专利cn122521731a公开了一种来源于节杆菌（arthrobacter sp.）eprs66的β-呋喃果糖苷酶突变体d110n/r112i，虽然对催化活性有所改善，但仅限于对活性中心催化残基进行改造，而天然酶仍存在活性中心底物与产物通道狭窄、空间位阻过大的缺陷。在实际反应过程中，不仅极易发生不可避免的水解副反应导致底物无效消耗，而且还会导致底物转化率和产物积累量不足，增加后续分离纯化难度与工业制剂成本。

3、因此，对β-呋喃果糖苷酶催化口袋、通道及氢键网络位点作进一步定向改造与组合突变以促进大分子产物释放，创制高催化活性、高产物释放效率的新型β-呋喃果糖苷酶工程突变体，对于推进低聚乳果糖的大规模工业化绿色生物制造十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于获得一种β-呋喃果糖苷酶突变体（简称m4-ftase），该突变体通过对酶催化口袋通道及氢键网络关键位点的定向改造得到扩大的催化活性口袋和拓宽的产物通道，从而提高低聚乳果糖的催化合成效率。

2、本发明技术方案具体如下：

3、一种β-呋喃果糖苷酶突变体（m4-ftase），通过对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列进行如下四个位点的定点突变后得到：w195g（第195位色氨酸突变为甘氨酸）、y453a（第453位酪氨酸突变为丙氨酸）、f439s（第439位苯丙氨酸突变为丝氨酸）和r142a（第142位精氨酸突变为丙氨酸）。通过多点突变协同作用进一步扩大酶的产物出口通道，重构氢键网络。

4、上述野生型β-呋喃果糖苷酶来源于谷氨酸杆菌（glutamicibacter sp. jl.03c），其氨基酸序列如seq id no: 2所示，基因序列如seq id no: 1所示。

5、进一步地，所述突变体m4-ftase的氨基酸序列如seq id no: 4所示，编码该突变体的核苷酸序列如seq id no: 3所示。

6、进一步地，本发明提供一种重组表达载体，包含如seq id no: 3所示的核苷酸序列。优选地，所述重组表达载体为pet-22b载体。

7、进一步地，本发明提供一种工程菌，含有上述重组表达载体。优选地，所述工程菌以大肠杆菌bl21(de3)为宿主细胞。

8、进一步地，本发明提供前述突变体m4-ftase在酶催化合成低聚乳果糖中的应用。

9、进一步地，本发明提供一种利用前述突变体m4-ftase进行体外酶催化合成低聚乳果糖的方法，具体为：将突变体m4-ftase加入到含有蔗糖和乳糖的反应体系中，反应体系中还包含浓度0.5～2 mm的mg2+；在ph7.0～8.0、35～45 ℃条件下反应3～4h，反应结束后灭活酶，离心取上清，即得含有低聚乳果糖的产物；其中：所述蔗糖和乳糖在反应体系中的总质量浓度为30%～60%（w/v）；所述突变体m4-ftase在反应体系中的质量浓度为15～35 μg/ml。

10、优选地，上述体外酶催化合成低聚乳果糖的反应体系的ph为7.4，反应温度为40℃，mg2+浓度为1 mm，反应时间为3 h；其中：蔗糖和乳糖在反应体系中的质量浓度分别为30%（w/v）和20%（w/v），所述突变体m4-ftase在反应体系中的质量浓度为25μg/ml。

11、本发明通过分子对接与理性设计获得β-呋喃果糖苷酶多点组合突变体m4-ftase，具备更大的催化活性口袋及拓宽的产物通道，有效克服了现有同类酶活性中心底物与产物通道狭窄、空间位阻过大的缺陷，进而解决现有酶催化活性不足、低聚乳果糖合成产量偏低的技术问题。相较于野生型酶，m4-ftase在相同催化条件下催化活性显著提升，低聚乳果糖合成产量提升近51%，同时有效降低了反应能耗与生产成本，具有良好的工业应用前景。

1.一种β-呋喃果糖苷酶突变体，其特征在于，通过对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列进行如下四个位点的定点突变后得到：w195g、y453a、f439s和r142a；所述野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列如seq id no: 2所示，编码所述野生型β-呋喃果糖苷酶的核苷酸序列如seq id no: 1所示。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于：氨基酸序列如seq id no: 4所示，编码所述突变体的核苷酸序列如seq id no: 3所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于包含如seq id no: 3所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pet-22b载体。

5.一种工程菌，其特征在于包含如权利要求3所述的重组表达载体。

6.一种工程菌，其特征在于：所述工程菌以大肠杆菌作为宿主细胞，且包含如权利要求4所述的重组表达载体。

7.如权利要求1所述的突变体在催化合成低聚乳果糖中的应用。

8.一种利用如权利要求1所述的突变体进行体外酶催化合成低聚乳果糖的方法，其特征在于：将突变体加入到含有蔗糖和乳糖的反应体系中，反应体系中还包含浓度0.5～2 mm的mg2+；在ph7.0～8.0、35～45 ℃条件下反应3～4h，反应结束后灭活酶，离心取上清，即得含有低聚乳果糖的产物；

9.如权利要求8所述的体外酶催化合成低聚乳果糖的方法，其特征在于：反应体系ph为7.4，反应温度为40℃，反应时间为3 h，mg2+浓度为1 mm；所述蔗糖和乳糖在反应体系中的质量浓度分别为30%和20%，所述突变体在反应体系中的质量浓度为25μg/ml。