一种用于DEFB126基因矫正的纳米载体组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体地说是一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物及其应用。

背景技术：

1、男性不育是影响育龄人群生殖健康的重要疾病，精子在附睾内成熟及其表面功能重塑对正常受精具有重要作用。defb126属于β-防御素家族，是与附睾生殖功能密切相关的分泌型蛋白，可在精子通过附睾过程中包被于精子表面并参与形成精子糖萼。defb126的糖基化和唾液酸化修饰有助于维持精子表面理化特性、保护精子并促进其在女性生殖道黏液中的运动。研究表明，defb126基因功能异常可导致精子表面糖萼改变，降低精子穿透宫颈黏液替代介质的能力，且与男性生育能力下降相关。

2、针对defb126突变或功能异常，通过基因编辑方式对突变位点进行精确矫正，使附睾相关细胞恢复表达正常功能的defb126蛋白，为相关男性不育提供了潜在干预思路。基于cas9 mrna、靶向sgrna和单链供体寡核苷酸的同源定向修复体系，能够实现特定位点序列修复，但上述核酸分子稳定性差、易降解，且分子尺寸、电荷性质和稳定性不同，直接递送时易出现细胞摄取效率低、胞内释放不足及三组分递送不同步等问题，限制了基因矫正效率。

3、现有非病毒递送体系中，阳离子聚合物可凝聚核酸并促进细胞摄取，但阳离子性过强会带来细胞毒性和非特异性相互作用；脂质纳米载体具有界面调节优势，但对多种基因编辑组分的同步负载和稳定释放仍有不足。基于上述陈述，本发明提供了一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物及其应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中用于defb126基因矫正的基因编辑核酸组分稳定性差、三组分同步递送效率低、附睾局部环境中易发生非特异吸附，以及难以在附睾上皮细胞中实现有效摄取和胞质释放的问题，本发明提供了一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物及其应用。

2、第一方面，本发明提供了一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物，采用如下的技术方案：

3、一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物，包括如下质量份数的原料：杂化纳米颗粒10-15份、冻干保护剂40-60份、渗透压调节剂3-4份、缓冲稳定剂2-4份。

4、优选的，所述杂化纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：

5、a1、在避光条件下，将胺基封端聚(β-氨基酯)加入醋酸钠缓冲液中，搅拌均匀，得到胺基封端聚(β-氨基酯)溶液；在避光条件下，将基因编辑核酸加入到醋酸钠缓冲液中，搅拌均匀，得到基因编辑核酸溶液；

6、a2、将胺基封端聚(β-氨基酯)溶液和基因编辑核酸溶液进行微流控混合，避光静置孵育，得到聚合物内核悬液；

7、a3、将peg化脂质加入到无水乙醇中，搅拌均匀，得到peg化脂质相；将聚合物内核悬液与peg化脂质相进行微流控混合，得到混合液，在无菌条件下，对混合液进行稀释、超滤及浓缩，得到杂化纳米颗粒。

8、优选的，所述步骤a1中胺基封端聚(β-氨基酯)的制备方法为：

9、在氮气保护下，将1,4-丁二醇二丙烯酸酯、n,n'-双(丙烯酰)胱胺与5-氨基-1-戊醇混合，避光搅拌反应，得到丙烯酸酯端基预聚物；将丙烯酸酯端基预聚物加入到无水四氢呋喃中，搅拌均匀，得到预聚物溶液；将1,3-丙二胺加入到无水四氢呋喃中，搅拌均匀，得到1,3-丙二胺溶液；将预聚物溶液滴加至1,3-丙二胺溶液中，避光搅拌反应，得到反应液；在搅拌条件下，将反应液滴加至无水正己烷中进行沉淀处理，经离心、洗涤和无水四氢呋喃复溶，得到聚合物溶液，在搅拌条件下，将聚合物溶液滴加至无水乙醚中进行重沉淀处理，经离心、洗涤和真空干燥，得到胺基封端聚(β-氨基酯)。

10、优选的，所述步骤a1中胺基封端聚(β-氨基酯)的具体制备方法为：

11、在氮气保护下，按质量比3-5：1：2-3，将1,4-丁二醇二丙烯酸酯、n,n'-双(丙烯酰)胱胺与5-氨基-1-戊醇混合，避光，于85-95℃，300-500rpm搅拌反应18-24h，得到丙烯酸酯端基预聚物；按质量比1：5-10，将丙烯酸酯端基预聚物加入到无水四氢呋喃中，于20-25℃，200-400rpm搅拌15-25min，得到预聚物溶液；按质量比1：10-20，将1,3-丙二胺加入到无水四氢呋喃中，于20-25℃，200-400rpm搅拌15-25min，得到1,3-丙二胺溶液；按质量比1：1-3，将预聚物溶液滴加至1,3-丙二胺溶液中，控制滴加时长为40-60min，避光，于20-25℃，300-500rpm搅拌反应12-18h，得到反应液；于20-25℃，300-500rpm搅拌条件下，按质量比1：8-12，将反应液滴加至无水正己烷中沉淀处理2-4h，于4-6℃、8000-10000rpm离心10-15min，收集沉淀，用无水正己烷洗涤2-4次，按质量比1：5-10，将洗涤后的沉淀加入到无水四氢呋喃中，于20-25℃，200-400rpm搅拌15-25min复溶，得到聚合物溶液；于20-25℃，300-500rpm搅拌条件下，按质量比1：8-12，将聚合物溶液加入到无水乙醚中重沉淀处理2-4h，于4-6℃、8000-10000rpm离心10-15min，收集沉淀，用无水乙醚洗涤2-4次，再于25-35℃真空干燥36-48h，得到胺基封端聚(β-氨基酯)。

12、优选的，所述步骤a1中基因编辑核酸由投料摩尔比为1：3-5：3-6的编码cas9核酸酶的mrna、靶向defb126突变位点的sgrna与单链供体寡核苷酸（ssodn）组成。

13、优选的，所述编码cas9核酸酶的mrna包含cas9编码区；所述cas9编码区由seq idno:1所示dna编码序列转录获得；所述靶向defb126突变位点的sgrna的核苷酸序列如seqid no:2所示；所述单链供体寡核苷酸（ssodn）的核苷酸序列如seq id no:3所示。

14、优选的，所述步骤a1中胺基封端聚(β-氨基酯)与醋酸钠缓冲液的质量比为1：500-800；所述基因编辑核酸与醋酸钠缓冲液的质量比为1：1000-1500。

15、优选的，所述步骤a1中醋酸钠缓冲液的浓度为20-30mm，ph值为5.0-5.5。

16、优选的，所述步骤a1中搅拌转速为300-500rpm，搅拌时间为15-25min。

17、优选的，所述步骤a2中胺基封端聚(β-氨基酯)溶液和基因编辑核酸溶液的质量比为1：0.8-1.2；所述微流控混合流速比为1：0.8-1.2，总流速为4-6ml/min；所述孵育温度为20-25℃，孵育时间为10-20min。

18、优选的，所述步骤a3中peg化脂质由摩尔比为30-35：30-35：20-25：2-3：2-4的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺（dope）、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（dopc）、胆固醇、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸-rac-甘油钠盐（dopg）和dspe-mpeg2000组成。

19、优选的，所述步骤a3中peg化脂质与无水乙醇的质量比为1：20-40；所述搅拌转速为300-500rpm，搅拌时间为10-20min。

20、优选的，所述步骤a3中聚合物内核悬液与peg化脂质相的质量比为2.5-3.5：1；所述微流控混合流速比为2.5-3.5：1，总流速为6-8ml/min。

21、优选的，所述冻干保护剂由质量比为3-5：2：1的d-海藻糖二水合物、蔗糖和甘露醇组成；所述渗透压调节剂选自氯化钠和氯化钾中的一种或两种；所述缓冲稳定剂由质量比为4-5：1：1.5-2的l-组氨酸、l-组氨酸盐酸盐一水合物和l-肉碱组成。

22、第二方面，本发明提供了一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物的制备方法，采用如下的技术方案：

23、一种用于defb126基因矫正的纳米载体组合物的制备方法，包括以下步骤：

24、s1、将冻干保护剂、渗透压调节剂和缓冲稳定剂混合，得到混合物a，将混合物a加入到无酶无菌水中，搅拌均匀，调节ph，过滤除菌，得到无菌基础赋形液；

25、s2、在无菌条件下，将杂化纳米颗粒加入无菌基础赋形液中，搅拌均匀，得到纳米载体组合物料液；

26、s3、将纳米载体组合物料液冷冻干燥，得到用于defb126基因矫正的纳米载体组合物。

27、优选的，所述步骤s1中混合物a与无酶无菌水的质量比为1：10-20；所述搅拌转速为300-500rpm，搅拌时间为20-30min；所述调节ph至7.0-7.4。

28、优选的，所述步骤s2中搅拌转速为100-200rpm，搅拌时间为10-20min。

29、优选的，所述步骤s3中冷冻干燥包括预冻、一次干燥和二次干燥；所述预冻温度为-70℃至-80℃，预冻时间为2-4h；所述一次干燥温度为-45℃至-55℃，真空度为10-20pa，时间为24-48h；所述二次干燥温度为20℃至30℃，真空度为10-20pa，时间为2-4h。

30、第三方面，本发明提供了一种上述的用于defb126基因矫正的纳米载体组合物在制备用于体外纠正携带defb126突变的附睾上皮细胞、附睾组织模型或附睾类器官中defb126突变位点的试剂中的应用。

31、综上所述，本发明具有以下有益效果：

32、1.本发明的杂化纳米颗粒是以胺基封端聚(β-氨基酯)为内核，能够通过静电作用压缩并包载编码cas9核酸酶的mrna、sgrna和单链供体寡核苷酸；同时以peg化脂质为外层包覆结构，能够通过空间位阻屏蔽聚合物内核的部分正电荷，降低颗粒表面阳离子暴露程度，改善纳米颗粒在体外模拟生理环境中的稳定性；聚合物内核对核酸的紧密压缩作用与脂质外层的物理屏障作用协同，有利于降低核酸与外界核酸酶接触而发生降解的风险，提高杂化纳米颗粒在附睾相关细胞或模型中的核酸递送有效性。

33、2.本发明采用含二硫键的胺基封端聚(β-氨基酯)作为聚合物内核材料，使纳米载体具有还原响应性释放特征。胺基封端聚(β-氨基酯)中引入n,n'-双(丙烯酰)胱胺形成二硫键结构，在细胞内还原性环境中有利于发生断裂并促进聚合物降解，从而促进所包载基因编辑核酸的释放；同时，聚合物中的胺基结构在内涵体酸性环境中可部分质子化，并与聚合物降解及膜扰动作用协同，促进基因编辑组分的胞内释放和利用。

34、3.本发明将编码cas9核酸酶的mrna、靶向defb126突变位点的sgrna与单链供体寡核苷酸共同包载于同一纳米颗粒中，实现了基因切割组分与修复模板的协同递送。该共递送方式有利于基因编辑组分同步进入同一靶细胞，降低分别递送导致的组分分布不均或作用时序不一致的问题，从而提高defb126突变位点发生同源定向修复的概率。

35、4.本发明采用两步微流控组装工艺制备杂化纳米颗粒，先通过水相混合形成包载基因编辑核酸的聚合物内核，再通过水相与脂质有机相混合实现脂质外层包覆。该工艺有利于提高纳米颗粒的粒径、分散性和包封效果的可控性，降低传统混合法制备过程中粒径分布宽、重复性差的问题，从而提高产品制备的均一性。

36、5.本发明中的冻干保护剂由d-海藻糖二水合物、蔗糖和甘露醇复配形成，其能够在冷冻干燥过程中降低纳米颗粒聚集、融合或破裂的风险，提高冻干后产品的储存稳定性和复溶性能；通过在缓冲稳定剂中创新地引入了l-肉碱（附睾微环境及精子成熟过程中天然存在的关键功能分子），这不仅维持了复溶后料液的理化性质，更进一步提升了纳米载体组合物对附睾上皮细胞的生物相容性，可以通过附睾天然的肉碱转运机制促进纳米载体组合物的靶向识别与结合。