一种适用于RNA定点编辑的蝙蝠胞苷脱氨酶RaA3Z1bV1及其突变体

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种适用于rna定点编辑的蝙蝠胞苷脱氨酶raa3z1bv1及其突变体。

背景技术：

1、当前，基因编辑技术已由传统的crispr/cas9介导的双链断裂逐步发展到碱基编辑（base editing, be）与引导编辑（prime editing, pe）等不依赖双链断裂的新策略。其中，dna碱基编辑器通常通过融合脱氨酶与dcas9或ncas9，实现特定位点的c→t或g→a编辑。相比之下，rna碱基编辑可瞬时纠正致病突变，无dna水平永久性改变，兼具安全性与可调控性。目前已报道的rna碱基编辑工具主要包括两大类：一类为腺苷脱氨酶（adar）介导的a→i编辑，如repair系统；另一类为胞苷脱氨酶（如apobec1）介导的c→u编辑，如cure系统。这些系统通常通过将脱氨酶与识别靶rna序列的效应蛋白（如dcas13或rfxcas13d）融合，从而实现靶向rna碱基的精确修饰。

2、尽管c→u的rna编辑工具已被开发，但目前已知的脱氨酶如apobec1在靶向性、活性、序列偏好性上仍存在一定局限。例如，apobec1易产生脱靶编辑，其编辑窗口较宽，限制了其在精确rna编辑中的广泛应用。

3、因此，开发来源新颖、天然具备rna c→u的高效脱氨能力的胞苷脱氨酶，是rna编辑领域的重要发展方向之一。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种适用于rna定点编辑的蝙蝠胞苷脱氨酶raa3z1bv1及其突变体。本发明的胞苷脱氨酶raa3z1bv1及其突变体在rna水平上具有较强的脱氨活性。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种胞苷脱氨酶，所述胞苷脱氨酶包括raa3z1bv1和/或其突变体，所述raa3z1bv1的氨基酸序列如seq id no：2所示。

4、本发明在埃及果蝠组织中克隆到

raa3z1bv1基因，及其编码的胞苷脱氨酶，在rna水平上具有强脱氨活性，所述胞苷脱氨酶在哺乳动物细胞中表达后，能够介导内源转录本rna发生c→u编辑，而对应检测位点的基因组dna未检测到可识别的胞苷脱氨编辑事件，表明所述胞苷脱氨酶介导的编辑主要发生于rna水平。

5、进一步地，所述raa3z1bv1突变体包括raa3z1bv1第97位酪氨酸突变为色氨酸和/或raa3z1bv1（y97w突变）第98位苏氨酸突变为丝氨酸（t98s）。

6、作为本发明优选实施方式，所述raa3z1bv1突变体为raa3z1bv1-ws，其氨基酸序列如seq id no：5所示，同时具有y97w突变和t98s突变。

7、所述raa3z1bv1-ws具有高于raa3z1bv1的rna编辑活性，在哺乳动物细胞中能够介导更多的内源转录本rna c→u编辑事件，而对应检测位点的基因组dna未检测到可识别的胞苷脱氨编辑事件。

8、进一步地，所述raa3z1bv1及其突变体还能够介导外源导入rna底物发生rna c→u编辑，所述外源导入rna底物包括马尔堡病毒编码序列。

9、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的胞苷脱氨酶。

10、进一步地，编码raa3z1bv1的核酸分子的核苷酸序列如seq id no：1所示。

11、进一步地，编码raa3z1bv1突变体raa3z1bv1-ws的核苷酸序列如seq id no：6或seq id no：7所示。

12、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有所述的核酸分子，并适用于在哺乳动物细胞系中表达所述胞苷脱氨酶。

13、第四方面，本发明提供所述胞苷脱氨酶、所述核酸分子或所述表达载体在rna编辑中的应用。

14、进一步地，所述rna编辑为催化rna中胞苷脱氨（c）转变为尿苷（u）。

15、进一步地，所述rna包括哺乳动物细胞内源转录本rna和外源导入rna底物。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

17、本发明提供了一种来源于埃及果蝠的胞苷脱氨酶raa3z1bv1及其突变体raa3z1bv1-ws。能够在哺乳动物细胞中介导rna发生c→u编辑，在对应检测位点的基因组dna中未检测到可识别的胞苷脱氨编辑事件，表明其编辑主要发生于rna水平。其中，raa3z1bv1能够介导内源转录本rna编辑，且raa3z1bv1-ws进一步提高了rna编辑活性，在内源转录本rna编辑评价体系中，其rna编辑活性高于人源胞苷脱氨酶hsa3a。同时，raa3z1bv1及raa3z1bv1-ws均能够介导外源导入rna底物发生rna c→u编辑。因此，本发明提供的来源于埃及果蝠的胞苷脱氨酶raa3z1bv1及其突变体raa3z1bv1-ws可作为rna碱基编辑工具开发的候选编辑酶。

1.一种胞苷脱氨酶，其特征在于，所述胞苷脱氨酶包括raa3z1bv1和/或其突变体，所述raa3z1bv1的氨基酸序列如seq id no：2所示。

2.如权利要求1所述的胞苷脱氨酶，其特征在于，所述raa3z1b突变体包括raa3z1bv1第97位酪氨酸突变为色氨酸和/或raa3z1bv1第98位苏氨酸突变为丝氨酸。

3.如权利要求2所述的胞苷脱氨酶，其特征在于，所述raa3z1b突变体为raa3z1b-ws，其氨基酸序列如seq id no：5所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的胞苷脱氨酶。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码raa3z1bv1的核苷酸序列如seq idno：1所示。

6.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码raa3z1bv1-ws的核苷酸序列如seqid no：6或seq id no：7所示。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4~6任一项所述的核酸分子。

8.权利要求1~3任一项所述的胞苷脱氨酶、权利要求4~6任一项所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体在rna编辑中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述rna编辑为催化rna中胞苷脱氨转变为尿苷。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述rna为哺乳动物细胞的内源转录本或导入所述哺乳动物细胞中的外源rna。