一种重组猪α-干扰素融合蛋白、制备方法及应用与流程

本发明涉及兽药生物，特别涉及一种重组猪α-干扰素融合蛋白、制备方法及应用。

背景技术：

1、中国是世界上最大的生猪生产国和消费国，规模化猪场数量也在稳步增长。然而，由猪病毒性感染引发的疾病，如猪瘟、蓝耳病、猪圆环病毒病和流行性腹泻等问题日益严重，每年给生猪养殖业造成巨大的经济损失，并严重制约产业健康发展。因此，如何有效防治病毒性传染病一直是猪病防控研究的重点。

2、干扰素是细胞在特定诱导剂刺激下产生的一类高活性糖蛋白，对同种动物细胞具有广谱抗病毒作用，同时兼具免疫调节、抑制细胞增殖及抗肿瘤等多种生物学功能。依据氨基酸序列、细胞来源及受体结合特性的差异，干扰素可分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型共三类。其中，ⅰ型干扰素主要包括α-干扰素与β-干扰素，以强效抗病毒活性为主要特征；ⅱ型干扰素以γ-干扰素为主，具备独特的免疫调节与抗肿瘤效应。干扰素作为机体免疫应答和清除病原体的关键效应分子，已成为免疫学与临床医学领域的重要研究热点。

3、胸腺肽tα1（thymosin alpha-1, tα1）是一类常见的强免疫混合多肽，由28个氨基酸组成，结构高度保守，具有明确的生物活性。研究证实，tα1可有效调控机体免疫应答，诱导树突状细胞活化，促进多种免疫相关细胞因子分泌，在机体抵抗病原体感染过程中发挥重要作用。胸腺五肽（thymopentin, tp5）为人工合成的五肽免疫调节分子，作为胸腺生成素的核心活性片段，能够诱导t淋巴细胞分化成熟，促进干扰素、白细胞介素等细胞因子的分泌，增强nk细胞活性与细胞免疫功能，并对异常免疫反应发挥双向调节作用。

4、现有单一猪干扰素仅能单独实现抗病毒或免疫调节作用，难以兼顾病毒增殖抑制与感染后免疫紊乱修复，同时单一干扰素分子量小、体内易被蛋白酶降解、半衰期短，临床需频繁注射给药，增加养殖应激与人工成本，且大肠杆菌原核表达产物缺乏糖基化修饰，蛋白热稳定性差；本发明旨在构建兼具强效广谱抗病毒及免疫调节活性的融合猪干扰素，通过优化柔性连接序列保证蛋白正确折叠、提升生物活性，延长体内半衰期以减少给药次数；利用酵母真核表达系统制备高活性、高稳定性、长半衰期融合猪干扰素，弥补现有产品不足，同步实现抗病毒与免疫修复效果，满足规模化猪场病毒性疫病低成本、高效防控的产业需求。

技术实现思路

1、为解决现有技术中猪干扰素存在活性不足、半衰期短、抗病毒效果有限等问题，本发明提供了一种重组猪α-干扰素的制备方法及其应用。通过本技术制备的猪干扰素抗病毒活性强、体内作用周期长，有效满足规模化猪场病毒性疫病防控需求，为规模化猪场病毒性疫病防控提供创新实操方案，具体技术方案如下：

2、第一方面，本发明提供了一种rpoifn-α融合蛋白，所述融合蛋白由胸腺肽tα1、胸腺五肽tp5和猪α-干扰素通过柔性连接肽依次串联连接而成；所述柔性连接肽的氨基酸序列为gggs；所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述rpoifn-α融合蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包含第二方面所述的核酸分子。

5、进一步的，所述重组载体的骨架为ppiczα系列质粒piczαa、ppiczαb或ppiczαc中的任一种，优选为ppiczαc。

6、第四方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有第三方面所述的重组载体。

7、进一步的，所述基因工程菌为毕赤酵母（pichia pastoris）x33菌株。

8、第五方面，基于同一个发明创造，本发明还提供了一种如第一方面所述的rpoifn-α融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

9、将编码所述融合蛋白的基因片段连接至表达载体，构建重组质粒；

10、将所述重组质粒转化至宿主细胞，构建基因工程菌；

11、诱导所述基因工程菌表达目的蛋白，收集表达产物并进行纯化，获得rpoifn-α融合蛋白。

12、进一步的，所述基因片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；

13、所述表达载体为ppiczαc载体；所述转化步骤中，所述宿主细胞为毕赤酵母x33感受态细胞；所述诱导步骤中使用甲醇进行诱导；所述纯化步骤采用镍柱亲和层析进行纯化。

14、具体的，一种rpoifn-α的制备方法，对上述获得的重组菌先经ypd液体培养活化，再于bmgy培养基中扩增；以1.5 od/ml菌密度转接至bmmy诱导培养基，28℃振荡培养，每24h补加1%甲醇进行诱导，培养96 h后离心收集上清液获得rpoifn-α蛋白。

15、更具体的，一种rpoifn-α的纯化方法，取200ml表达液，4℃、10000 rpm 离心 20min，收集上清进行镍柱亲和纯化。依次以去离子水与结合缓冲液平衡层析柱，控制流速上样，结合缓冲液洗除杂蛋白，200 mm咪唑洗脱目的蛋白。纯化产物经12% sdspage 鉴定纯度，0.22 μm 滤膜除菌后于-80℃保存，得到了纯化后的rpoifn-α蛋白。

16、第六方面，本发明提供了如第一方面所述的rpoifn-α融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。

17、第七方面，本发明提供了如第一方面所述的rpoifn-α融合蛋白在制备具有抗病毒和免疫调节双重功能的兽用药物中的应用。

18、本发明具有如下有益效果：

19、本发明提供了一种重组猪α-干扰素蛋白，将去除信号肽的猪α-干扰素基因通过柔性连接肽与胸腺肽tα1基因以及胸腺五肽tp5基因串联，在毕赤酵母载体中表达而成。本发明的重组猪α-干扰素的抗病毒活性可达到3.16×107iu/ml，相较于天然猪α-干扰素效价提升了约30倍，并且大幅延长体内半衰期，提高作用持续时长，减少体内给药频次，提升体内作用持久性与生物利用度。本发明的重组猪α-干扰素具备更强的生物学活性与更优异的体内代谢特性，具备广谱抗病毒作用，在兽用抗病毒药物研发及兽医临床诊疗领域拥有广阔应用前景与极高开发价值。

1.一种重组猪α-干扰素融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由胸腺肽tα1、胸腺五肽tp5和猪α-干扰素通过柔性连接肽依次串联连接而成；所述柔性连接肽的氨基酸序列为gggs；所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述重组猪α-干扰素融合蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求2所述的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架为ppiczα系列质粒piczαa、ppiczαb或ppiczαc中的任一种。

5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求3或4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为毕赤酵母（pichia pastoris）x33菌株。

7.一种如权利要求1所述的重组猪α-干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如seq idno.1所示；

9.如权利要求1所述的重组猪α-干扰素融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。

10.如权利要求1所述的重组猪α-干扰素融合蛋白在制备具有抗病毒和免疫调节双重功能的兽用药物中的应用。