转氨酶突变体、重组细胞及其生产1,4-丁二胺的应用的制作方法

本发明属于基因工程和酶工程，具体涉及一种转氨酶突变体、重组细胞及其生产1,4-丁二胺的应用。

背景技术：

1、现阶段，1,4-丁二胺的生产主要依赖化学合成，先由高毒性的苯烯腈和氢氰酸在价格昂贵的碱性催化剂作用下发生反应得到易燃的丁二腈，再经过反应条件苛刻的氢化反应将丁二腈转化为1,4-丁二胺，整个化学合成路线对人体和环境都有巨大危害，而且反应途径中的化学原料来源于不可再生的石油资源。石油化工原料短缺，环境污染日益加重，寻找一条低耗能、环保、可持续的高效生产1,4-丁二胺的途径迫在眉睫。随着生物工程的发展，生物合成在生物基化学产品生产、生物能源、生物医药、污染治理等众多领域逐渐显示出应用价值。

2、1,4-丁二胺生物合成途径主要分为以鸟氨酸直接脱羧、精氨酸两步转化和γ-氨基丁酸/谷氨酸衍生路径。如图1所示，γ-氨基丁酸路径具体包括两步酶催化反应：（1）γ-氨基丁酸在羧酸还原酶的催化下转化为4-氨基丁醛，反应过程消耗atp和nadph；（2）4-氨基丁醛在转氨酶的催化下转化为1,4-丁二胺，反应过程消耗l-丙氨酸。

3、相比于鸟氨酸和精氨酸脱羧法，γ-氨基丁酸（gaba）来源更广泛，反应条件温和，发酵工艺成熟、成本低；产物反馈抑制作用更弱，gaba转化所依赖的羧酸还原酶、转氨酶对产物的耐受性更强，可减少反馈抑制对转化效率的影响。但仍需通过优化酶系组合、改造表达菌株来进一步提升实际转化效率，因此，开发高活性的羧酸还原酶和转氨酶对实现1,4-丁二胺的高效生物合成尤为重要。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明目的是提供一种转氨酶突变体及其在生产1,4-丁二胺方面的应用。

2、本发明技术方案概述如下：

3、本发明提供一种转氨酶突变体，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

4、本发明还提供上述转氨酶突变体的编码基因。

5、本发明还提供包含上述编码基因的载体、重组载体或表达载体。

6、本发明还提供包含上述编码基因或重组载体的宿主细胞。

7、本发明还提供制备上述转氨酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述转氨酶突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。

8、本发明还提供上述转氨酶突变体在生产1,4-丁二胺方面的应用。

9、本发明还提供一种生产1,4-丁二胺的方法，包括以下步骤：

10、在适宜的反应条件下，利用酶系统催化底物γ-氨基丁酸生成1,4-丁二胺；

11、所述酶系统包含：本发明所述转氨酶突变体，或表达所述转氨酶突变体的重组细胞，或其细胞处理物；

12、催化γ-氨基丁酸转化为4-氨基丁醛的羧酸还原酶，或表达所述羧酸还原酶的重组细胞，或其细胞处理物；以及

13、修饰所述羧酸还原酶的泛酰巯基乙胺基转移酶，或表达所述泛酰巯基乙胺基转移酶的重组细胞，或其细胞处理物；

14、所述方法包括将所述底物与上述三种酶或其重组细胞或其细胞处理物混合接触的步骤。

15、本发明的有益效果如下：

16、本发明以来源于假单胞菌

pseudomonas的转氨酶spuc为基础，利用ai预测平台筛选获得高活性突变体，该突变体是所述转氨酶spuc第298位的甲硫氨酸突变为精氨酸（即spuc-m298r），评估突变体酶对1,4-丁二胺合成效率的影响。本发明提供的spuc-m298r突变体酶（氨基酸序列如seq id no.2所示）替代原始酶应用于1,4-丁二胺生产工程菌，具有显著增强1,4-丁二胺合成效率、促使1,4-丁二胺产量提升的作用。

1.一种转氨酶突变体，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

2.权利要求1所述转氨酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述编码基因，其核苷酸序列如seqidno:7所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因或权利要求4所述重组载体。

6.权利要求1所述转氨酶突变体的应用，其特征在于，所述转氨酶突变体用于催化4-氨基丁醛转化为1,4-丁二胺。

7.一种制备权利要求1所述转氨酶突变体的方法，其特征在于，该方法通过利用所述转氨酶突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。

8.一种生产1,4-丁二胺的方法，包括以下步骤：

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述羧酸还原酶的氨基酸序列如seqidno:5所示。