一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌及其构建方法和应用

本发明属于合成生物学与微生物代谢工程领域，具体涉及一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、n-乙酰氨基葡萄糖（n-acetyl-d-glucosamine，glcnac）是一种重要的氨基单糖，广泛应用于医药、食品、化妆品及功能材料等领域。利用大肠杆菌发酵法生产glcnac是当前研究热点，现有技术通常通过以下策略提高glcnac产量：增强glcnac合成途径关键酶的表达；敲除或抑制glcnac分解及再利用相关基因，如

naga、nagb、nage、murq及

manxyz等；优化碳流分配，提高前体物质供应能力。尽管上述策略在一定程度上提高了glcnac产量，但在实际发酵过程中，仍存在糖转化率提升有限、碳源利用效率不高等问题。

2、进一步分析发现，现有研究主要集中于胞内代谢通路的调控，而对细胞表面结构相关代谢负担关注较少。大肠杆菌在生长过程中会合成鞭毛、菌毛等表面结构，这些结构的合成与装配涉及大量蛋白质表达、跨膜转运及能量消耗，需要消耗atp、氨基酸及碳源，同时占用转录和翻译资源。这些结构虽然有利于细胞环境适应，但在工业发酵体系中通常并非目标产物合成所必需，反而可能造成以下问题：增加非必要的能量消耗；消耗蛋白表达资源，影响目标代谢途径效率；促进细胞聚集或生物膜形成，影响发酵体系传质；导致碳源向非目标方向分配，降低糖转化效率。然而，现有关于glcnac生产菌株的研究中，尚缺乏通过系统调控或削弱鞭毛和菌毛相关基因，从细胞结构层面优化资源分配以提高glcnac产量的技术方案。因此，开发一种通过削弱或调控鞭毛及菌毛结构，从而降低非生产性代谢负担、提高碳源利用效率并增强glcnac合成能力的方法，对于构建高效glcnac生产菌株具有重要意义。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌及其构建方法和应用，解决现有乙酰氨基葡萄糖生产菌株中存在的碳源利用效率不高、非目标代谢消耗较大及糖转化率提升受限等问题。通过削弱或去除鞭毛及菌毛相关结构的合成与功能，降低细胞在运动、附着及生物膜形成过程中的能量与物质消耗，从而实现碳流和能量向n-乙酰氨基葡萄糖合成途径的重新分配，进而提高产量及糖转化效率。

2、技术方案：本发明所述的提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的基因工程菌以乙酰氨基葡萄糖生产菌为出发菌，通过对鞭毛和/或菌毛相关基因进行敲除或调控改造获得；所述鞭毛相关基因包括参与鞭毛形成、装配、调控及运动功能的基因，来源于大肠杆菌鞭毛基因系统；所述菌毛相关基因包括参与菌毛形成、装配、黏附及生物膜形成的基因，来源于大肠杆菌菌毛基因系统。

3、所述乙酰氨基葡萄糖生产菌为xrg_0，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学校内，保藏日期是：2026年5月25日，保藏编号为：cctcc no：m20261093，分类命名为 大肠杆菌（escherichia coli）nju-xrg_0 。

4、所述鞭毛相关基因包括参与鞭毛形成、装配、调控及运动功能的基因，其来源于大肠杆菌鞭毛基因系统。包括但不限于以下功能模块：

5、（1）鞭毛主调控模块，包括

flhdc调控系统及其调控因子，如

ydiv等；

6、（2）鞭毛装配调控模块，包括

flhe、flha、flhb等基因；

7、（3）鞭毛结构蛋白模块，包括fli基因簇相关基因，如

flia、flic、flid、flif、flig、

flih、flii、flij、flik、flil、flim、flin、flio、flip、fliq、flir等；

8、（4）鞭毛钩及连接结构模块，包括flg基因簇相关基因，如

flga、flgb、flgc、flgd、

flge、flgf、flgg、flgh、flgi、flgj、flgk、flgl等；

9、（5）运动及能量驱动模块，包括

mota、motb等相关基因。

10、所述菌毛相关基因包括参与菌毛形成、装配、黏附及生物膜形成的基因，其来源于大肠杆菌菌毛基因系统。包括但不限于：

11、（1）i型菌毛系统，包括

fimb、fime、fima、fimi、fimc、fimd、fimf、fimg、fimh等；

12、（2）usher-chaperone装配系统，包括

yfcu、yfcs、ybgq、yraj等；

13、（3）黏附相关蛋白系统，包括

yadk、yadc、yadl等；

14、（4）共通菌毛系统（ecp），包括

ecpc、ecpd及相关蛋白；

15、（5）其他菌毛或表面附着相关基因，包括

sfm、csg等与细胞黏附或生物膜相关的基因。

16、上述鞭毛或菌毛相关基因的调控方式包括但不限于：基因敲除、插入或缺失突变、框移突变、无义突变、启动子或调控元件改造、基因表达抑制。

17、本发明提供若干代表性基因工程菌，用于验证所述技术方案的有效性，包括但不限于：

18、（1）xrg_3f：对鞭毛系统进行调控获得的基因工程菌；

19、（2）xrg_3p：对菌毛系统进行调控获得的基因工程菌；

20、（3）xrg_3fp：同时对鞭毛与菌毛系统进行调控获得的基因工程菌。

21、本发明提供的基因工程菌通过对大肠杆菌鞭毛系统和/或菌毛系统相关基因进行调控，实现了乙酰氨基葡萄糖合成能力的提升。其可能作用机制包括但不限于以下方面：

22、（1）降低细胞非必要能量消耗

23、鞭毛的合成与运动过程需要消耗大量atp及质子驱动力；菌毛的组装与分泌亦依赖复杂的分泌系统。通过削弱或去除上述结构的合成过程，可减少细胞在运动与附着相关过程中的能量消耗，从而使更多代谢资源用于产物合成途径。

24、（2）优化碳代谢流分配

25、鞭毛及菌毛相关蛋白的合成需要消耗氨基酸及碳源前体。对相关基因进行调控后，可减少碳源向结构蛋白的流动，提高碳源向乙酰氨基葡萄糖合成路径（f6p → glcnac）的转化效率，从而提高糖转化率。

26、（3）改善细胞表面性质与代谢状态

27、菌毛及相关结构与细胞表面疏水性、生物膜形成能力及细胞间相互作用密切相关。通过调控这些结构，可改变细胞的表面物理化学性质及群体行为，降低细胞聚集或附着导致的传质限制，从而有利于发酵体系中底物利用和产物积累。

28、（4）调节全局调控网络

29、鞭毛和菌毛系统受到多种全局调控因子（如flhdc、csgd等）调控，其变化可能进一步影响细胞的转录调控网络及代谢状态。本发明通过调控相关基因，间接影响细胞代谢平衡，从而促进目标产物合成。

30、（5）提高发酵过程稳定性

31、通过降低生物膜形成和自凝集能力，可减少发酵过程中细胞状态不均一性，提高体系稳定性及可重复性，从而有利于工业放大。

32、本发明还提供了一种通过调控大肠杆菌鞭毛和菌毛相关基因提高乙酰氨基葡萄糖合成能力的方法，对宿主菌中的鞭毛和/或菌毛相关基因进行调控，以降低非目标代谢消耗并优化碳流分配。通过削弱细胞运动结构及附着结构的合成，降低细胞在非产物相关过程中的资源消耗，从而提高碳源向乙酰氨基葡萄糖合成途径的分配比例。

33、所述方法适用于：摇瓶发酵体系；发酵罐分批或补料分批体系。

34、本发明还提供上述基因工程菌在乙酰氨基葡萄糖生产中的应用。

35、在一种实施方式中：将所述基因工程菌接种于含碳源的培养基中进行培养，从而实现乙酰氨基葡萄糖的积累。

36、（1）培养条件：在一种实施方式中：碳源为葡萄糖或其他可利用碳源；培养温度为30-37℃；发酵方式为摇瓶发酵或补料分批发酵；

37、（2）关键结果：在优选实施方式中，与出发菌株相比：乙酰氨基葡萄糖产量由 3.26g/l 提高至 4.53 g/l；糖转化率由 26.9% 提高至 35.3%。表明本发明提供的基因工程菌在产量及底物利用效率方面均具有显著提升。

38、本发明还提供所述基因工程菌或所述方法在以下方面的应用：乙酰氨基葡萄糖生产、氨基糖类化合物生产、生物发酵制造领域。

39、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

40、（1）本发明通过削弱鞭毛及菌毛相关结构，降低了细胞在运动及黏附过程中的能量消耗，提高了细胞资源利用效率；

41、（2）本发明通过减少非必要结构蛋白的合成，使碳源更多流向乙酰氨基葡萄糖合成途径，从而提高产物积累；

42、（3）本发明的基因工程菌生物膜形成能力及自凝集能力降低，有利于改善发酵体系传质条件；

43、（4）本发明构建的基因工程菌与出发菌株xrg_0相比，乙酰氨基葡萄糖产量由3.26 g/l 提高至 4.53 g/l，糖转化率由 26.9% 提高至 35.3%，显著提升了生产性能；

44、（5）本发明提供了一种从细胞表面结构层面优化代谢的新策略，可与传统代谢工程方法协同应用，具有良好的通用性。