经掩蔽的IL12融合蛋白及其使用方法与流程

本公开涉及经掩蔽的il12融合蛋白、包含所述融合蛋白的组合物以及使用所述组合物治疗包括癌症在内的多种疾病的方法。

背景技术：

1、白细胞介素12 (il12)是异二聚体细胞因子家族的第一个公认成员，该家族包括il12、il23、il27、il35和il39。il12和il23是对t辅助细胞1 (th-1)和t辅助细胞17 (th-17) t细胞亚群的发育很重要的促炎细胞因子，而il27和il35是强效的抑制性细胞因子。il39是调节先天性和/或适应性免疫反应的重要细胞因子。l12可以直接增强效应cd4和cd8t细胞以及自然杀伤(nk)和nk t细胞的活性。

2、白细胞介素-12 (il12)是一种异二聚体分子，其由通过二硫键桥共价连接从而形成具有生物活性的70 kda二聚体的一条α链(p35亚基)和一条β链(p40亚基)构成。il23是il12细胞因子家族的成员，并且也由两个亚基：它与il12和pl9共享的p40亚基构成。il12受体或受体复合物由il12rβ1和il12rβ2构成。il23受体复合物(il23r)由与ill2rβl亚基复合的il23r亚基组成，ill2rβl亚基是il12受体的常见亚基并且与酪氨酸激酶2 (tyk2)相互作用。il23r主要在免疫细胞，特别是t细胞(例如，thl7和γδt细胞)、巨噬细胞、树突细胞和nk细胞上表达(duvallet

等人，2011)。最近已证明，未经激活的嗜中性粒细胞表达基础量的il23r，并且细胞激活后il23r表达增加(chen

等人，2016)。

3、在生物学上，il12是包括吞噬细胞、b细胞和经激活的树突细胞在内的多种免疫系统细胞响应于感染而产生的炎性细胞因子(colombo和trinchieri (2002), cytokine andgrowth factor reviews, 13: 155-168和hamza

等人, “interleukin-12 a keyimmunoregulatory cytokine in infection applications”

int. j. mol. sci.11; 789-806 (2010)。il12在介导免疫系统先天性臂和适应性臂的相互作用、作用于t细胞和自然杀伤(nk)细胞、增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和活性以及其他炎性细胞因子(尤其是干扰素-γ(ifn-γ))的产生中发挥重要作用。

4、il12已在人体临床试验中作为用于治疗多种癌症(包括肾癌、结肠癌和卵巢癌、黑色素瘤和t细胞淋巴瘤)的免疫治疗剂(atkins

等人(1997), clin. cancer res., 3: 409-17; gollob

等人(2000), clin. cancer res., 6: 1678-92; hurteau

等人(2001),gynecol. oncol., 82: 7-10; 以及youssoufian,

等人(2013) surgical oncologyclinics of north america, 22(4): 885-901)以及作为癌症疫苗的佐剂(lee

等人(2001), j. clin. oncol. 19: 3836-47)进行了测试。然而，il12在作为重组蛋白全身施用时是有毒的。trinchieri, adv. immunol. 1998; 70:83-243. 为了在最大限度地降低il12的全身毒性的同时最大限度地提高il12的抗肿瘤作用，已提出il12基因疗法方法使肿瘤部位处产生细胞因子，从而在低血清浓度下实现il12的高局部水平。qian

等人, cellresearch (2006) 16: 182-188; us专利公开20130195800.

5、由于il12是由α链(p35亚基)和β链(p40亚基)组成的异二聚体分子，因此具有生物活性的异二聚体的产生需要该两个亚基的同时表达。使用含有p40和p35亚基的双顺反子载体实现了重组il12表达，该p40和p35亚基被ires(内部核糖体进入位点)序列分隔从而允许从单个载体独立表达两个亚基。然而，ires序列的使用可能会损害蛋白质表达。mizuguchi

等人, mol ther (2000); 1: 376-382. 此外，p40和p35亚基的不等表达可导致同二聚体蛋白(例如 p40-p40)形成，这些蛋白可能对il12信号转导产生抑制作用。gillessen

等人eur. j. immunol. 25(1):200-6 (1995).

6、作为il12亚基的双顺反子表达的替代，已通过将p40和p35亚基与(gly4ser)3或gly6ser接头联接产生功能性单链il12融合蛋白。lieschke

等人, (1997), naturebiotechnology 15, 35-40; lode

等人, (1998), pnas 95, 2475-2480. (这些形式的p40-接头-p35或p35-接头-p40 il12构型在本文中可称为“单链il12 (scil12)”)。

7、人il12 p70(即p35和p40的二聚体)具有已报道的5-19小时的体内半衰期，在作为治疗性化合物施用时可导致显著的全身毒性。参见例如，car

等人"the toxicology ofinterleukin-12: a review"

toxicologic path.27:1, 58-63 (1999); robertson

等人"immunological effects of interleukin 12 administered by bolus intravenousinjection to patients with cancer"

clin. cancer res.5:9-16 (1999); atkins

等人"phase i evaluation of intravenous recombinant human interleukin 12 inpatients with advance malignancies"

clin. cancer res.3:409-417 (1997)。鼠类肿瘤治疗模型的临床前研究表明，全身施用il12后具有强大的抗肿瘤作用。然而，在人中，尝试全身施用重组il12则导致包括患者死亡在内的严重毒性和有限的功效。因此，本领域仍然需要改进对il12的

体内递送形式的治疗性控制。

技术实现思路

1、本公开的一个方面提供了经掩蔽的白细胞介素12(il12)融合蛋白，其包含：a)包含第一fc多肽和第二fc多肽的fc结构域；b)掩蔽部分(mm)；和c) il12多肽；其中所述掩蔽部分通过第一接头融合至所述第一fc多肽；并且任选地，其中所述掩蔽部分进一步包含第二接头；其中所述il12多肽通过第三接头融合至所述第二fc多肽；其中所述第一接头、第二接头或第三接头中的至少一者是蛋白酶可切割的；并且其中所述经掩蔽的il12融合蛋白的il12活性如与在所述至少一个蛋白酶可切割接头被切割后释放的含il12的多肽的il12活性相比减弱。在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一接头是蛋白酶可切割的，并且任选地，所述第二接头是蛋白酶可切割的。在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一接头任选地是蛋白酶可切割的，并且所述第二接头是蛋白酶可切割的。在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第三接头是蛋白酶可切割的，并且任选地，所述第一接头或第二接头是蛋白酶可切割的，或者两者都是蛋白酶可切割的。在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一接头包含选自由表3和表24中列出的切割位点组成的组的切割序列。在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一接头包含具有氨基酸序列msgrsana (seq id no:10)的切割序列。在一些实施方案中，所述蛋白酶可切割接头是被选自由基质金属蛋白酶(mmp)、蛋白裂解酶(matriptase)、组织蛋白酶、激肽释放酶、半胱天冬酶、丝氨酸蛋白酶、凝血酶、糜蛋白酶、羧肽酶a、类胰蛋白酶(tryptase)、组织蛋白酶g、组织蛋白酶l、adam金属蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组的蛋白酶切割。在一个实施方案中，所述第一接头、第二接头和第三接头是被相同的蛋白酶切割。

2、在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述掩蔽部分是单链fv(scfv)抗体片段、il12受体β2亚基(il12rβ2)或其il12结合片段，或il12受体β1亚基(il12rβ1)或其il12结合片段。在某些实施方案中，所述scfv包含：具有分别在seq id no: 13-15中列出的氨基酸序列的vhcdr1-3和具有分别在seq id no: 16-18中列出的氨基酸序列的vlcdr1-3。在一些实施方案中，所述scfv包含：包含分别在seq id no: 11和12中列出的氨基酸序列的vh和vl；或包含分别在seq id no 255和256中列出的氨基酸序列的vh和vl。在一些实施方案中，所述scfv包含具有seq id no: 11中所列出的氨基酸序列的vh的变体，其中所述变体选自由根据kabat编号的h_y32a、h_f27v、h_y52av、h_r52e、h_r52e_y52av、h_h95d、h_g96t和h_h98a组成的组；和具有seq id no: 12中所列出的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，所述掩蔽部分选自人il12rβ2的ecd、人il12rβ2的氨基酸24-321 (il12rβ224-321)、人il12rβ2的氨基酸24-124 (il12rβ24-124)、人il12rβ1的氨基酸24-240(il12rβ124-240)和il23r ecd。

3、在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述il12多肽包含seq idno: 22或23中所列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述il12多肽包含seq id no: 22中所列出的p40多肽氨基酸序列，并且所述p35 il12多肽非共价结合至p40多肽。在一些实施方案中，所述il12多肽包含seq id no: 23中所列出的p35多肽氨基酸序列，并且所述p40il12多肽非共价结合至p40多肽。

4、在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述il12是单链il12多肽，该单链il12多肽选自具有p35-接头-p40或p40-接头-p35取向的单链il12多肽。在一些实施方案中，所述融合蛋白选自变体29243、29244、31277、32039、32042、32045、33507、35425、32041、35436、35437、32862和32454。在一些实施方案中，所述单链il12多肽是在p40多肽处融合至所述第二fc多肽的p40-接头-p35多肽。在一些实施方案中，所述单链il12多肽是在p35多肽处融合至所述第二fc多肽的p35-接头-p40多肽。在一些实施方案中，所述单链il12多肽融合至所述第二fc多肽的c末端。在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述单链il12多肽融合至所述第二fc多肽的c末端，并且所述掩蔽部分融合至所述第一fc多肽的c末端。在一些实施方案中，所述单链il12多肽融合至所述第二fc多肽，并且所述第三接头是蛋白酶可切割的。在一些实施方案中，所述il12多肽的p40结构域已被修饰为如与未经修饰的p40结构域相比具有更强的蛋白水解切割抗性。在一些实施方案中，所述掩蔽部分是单链fv (scfv)抗体片段；并且所述il12融合蛋白还包含第二掩蔽部分，所述第二掩蔽部分包含通过第四接头融合至所述il12多肽的p35结构域的另外的scfv。在一些实施方案中，所述第一接头和第四接头是蛋白酶可切割的。在一些实施方案中，所述掩蔽部分包含通过第四接头融合至第二scfv的第一scfv。在一些实施方案中，所述第一接头和第四接头是蛋白酶可切割的。在一些实施方案中，所述掩蔽部分处于以下取向：第一fc多肽-l1-vh-vl-l4-vh-vl；或第一fc多肽-l1-vh-vl-l4-vl-vh。在一些实施方案中，所述第一接头和第四接头是蛋白酶可切割的。

5、在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述掩蔽部分包含il12受体β2亚基(il12rβ2)或其il12结合片段，以及通过所述第二接头融合的il12受体β1亚基(il12rβ1)或其il12结合片段。在一些实施方案中，所述掩蔽部分包含融合至所述第一fc多肽的c末端的il12rβ2-ig结构域以及通过所述第二接头融合至所述il12rβ2-ig结构域的c末端的il12rβ1。在一些实施方案中，所述第一和第二接头是蛋白酶可切割的。在一些实施方案中，所述掩蔽部分是il12rβ1或其il12结合片段；并且其中所述il12融合蛋白还包含第二掩蔽部分，所述第二掩蔽部分包含通过第四接头融合至所述il12多肽的p35结构域的il12rβ2或其il12结合片段。在一些实施方案中，所述第一接头和所述第四接头是蛋白酶可切割的。

6、在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述融合蛋白还包含靶向结构域。在一些实施方案中，所述靶向结构域特异性地结合肿瘤相关抗原。

7、在本文的经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一fc多肽包含第一ch3结构域并且所述第二fc多肽包含第二ch3结构域。

8、在本文中经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述il12活性是通过测量对il12敏感的细胞或细胞系的相对细胞丰度或细胞因子产量来确定的。在一些实施方案中，所述细胞或细胞系选自pbmc、cd8+ t细胞、ctll-2细胞系和nk细胞系。在一些实施方案中，所述il12活性是通过测量cd8+ t细胞的ifnγ释放来确定。在一些实施方案中，所述il12活性是通过测量nk细胞的相对细胞丰度来确定。

9、在经掩蔽的il12融合蛋白的一些实施方案中，所述第一ch3结构域或所述第二ch3结构域或两者包含不对称氨基酸修饰，其中所述第一和第二ch3结构域优先配对从而形成异二聚体而不是同二聚体。

10、本公开的一个方面提供了经掩蔽的白细胞介素12(il12)融合蛋白，其包含：a) fc结构域，其包含第一fc多肽和第二fc多肽；b)掩蔽部分(mm)；和c) il12多肽；其中所述掩蔽部分通过第一接头融合至所述第一fc多肽；并且任选地，其中所述掩蔽部分进一步包含第二接头；其中所述il12多肽通过第三接头融合至所述第二fc多肽；任选地，其中所述第一接头、第二接头或第三接头中的至少一者是蛋白酶可切割的；并且其中所述经掩蔽的il12融合蛋白的il12活性如与对照il12多肽的il12活性相比减弱。

11、本公开的一个方面提供了经掩蔽的il12融合蛋白，其包含：a) fc结构域，其包含第一fc多肽和第二fc多肽；b)第一mm和第二mm；和c) il12多肽；其中所述il12多肽包含p35多肽和p40多肽；其中所述第一mm通过第一接头融合至所述第一fc多肽；其中所述p35多肽通过第二接头融合至所述第一mm；其中所述第二mm通过第三接头融合至所述第二fc多肽；并且其中所述p40多肽非共价结合至所述p35多肽；并且其中所述第一接头、第二接头或第三接头中的至少一者是蛋白酶可切割的；并且其中所述经掩蔽的il12融合蛋白的il12活性与在所述至少一种蛋白酶可切割接头被切割后释放的含il12的多肽的il12活性相比减弱。

12、本公开的一个方面提供了经掩蔽的il12融合蛋白，其包含：a) fc结构域，其包含第一fc多肽和第二fc多肽；b)第一mm和第二mm；和c) il12多肽；其中所述il12多肽包含p35多肽和p40多肽；其中所述p35多肽通过第一接头融合至所述第一fc多肽；其中所述第一mm通过第二接头融合至所述p35多肽；其中所述第二mm通过第三接头融合至所述第二fc多肽；并且其中所述p40多肽非共价结合至所述p35多肽；并且其中所述第一接头、第二接头或第三接头中的至少一者是蛋白酶可切割的；并且其中所述经掩蔽的il12融合蛋白的il12活性与在所述至少一种蛋白酶可切割接头被切割后释放的含il12的多肽的il12活性相比减弱。在一些实施方案中，所述第一mm融合至所述第一fc多肽的c末端，并且其中所述第二mm融合至所述第二fc多肽的c末端。在一些实施方案中，所述p35多肽融合至所述第一fc多肽的n末端，并且其中所述第二mm融合至所述第二fc多肽的n末端。

13、本公开的一个方面提供了组合物，其包含本文描述的任何经掩蔽的il12融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

14、本公开的一个方面提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的任何经掩蔽的il12融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

15、本公开的一个方面提供了经分离的核酸，其编码如本文所述的经掩蔽的il12融合蛋白。

16、本公开的一个方面提供了表达载体，其包含编码如本文所述的经掩蔽的il12融合蛋白的经分离的核酸。

17、本公开的一个方面提供了经分离的宿主细胞，其包含编码如本文所述的经掩蔽的il12融合蛋白的经分离的核酸或包含此种经分离的核酸的表达载体。

18、本公开的一个方面提供了制备经掩蔽的il12融合蛋白的方法，其包括在适合于使所述经掩蔽的il12融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码如本文所述的经掩蔽的il12融合蛋白的经分离的核酸或包含此类经分离的核酸的表达载体；以及任选地，从所述宿主细胞培养基中回收所述经掩蔽的il12融合蛋白。

19、本公开的一个方面提供了经掩蔽的白细胞介素23(il23)融合蛋白，其包含：a)fc结构域，其包含第一fc多肽和第二fc多肽；b)掩蔽部分；c)第一蛋白酶可切割接头；和d)il23多肽；其中所述掩蔽部分通过所述第一蛋白酶可切割接头融合至所述第一fc多肽；并且任选地，其中所述掩蔽部分还包含第二蛋白酶可切割接头；其中所述il23多肽融合至所述第二fc多肽；并且其中所述经掩蔽的il23融合蛋白的il23活性如与在所述蛋白酶可切割接头被切割后释放的含il23的多肽的il23活性相比减弱。在一些实施方案中，所述il23是单链il23多肽，其选自具有p19-接头-p40或p40-接头-p19取向的单链il23多肽。在一些实施方案中，所述单链il23多肽是在所述p40多肽处融合至所述第二fc多肽的p40-接头-p19多肽。在一些实施方案中，所述单链il23多肽是在所述p19多肽处融合至所述第二fc多肽的p19-接头-p40多肽。在一些实施方案中，所述单链il23多肽融合至所述第二fc多肽的c末端。在一些实施方案中，所述单链il23多肽融合至所述第二fc多肽的c末端，并且所述掩蔽部分融合至所述第一fc多肽的c末端。

20、本公开的一个方面提供了包含蛋白酶可切割接头(pcl)的重组多肽，其中所述蛋白酶可切割接头包含氨基酸序列msgrsana (seq id no:10)。在一些实施方案中，所述重组多肽包含两种异源多肽：位于所述pcl的氨基(n)末端的第一多肽和位于pcl的羧基(c)末端的第二多肽。在一些实施方案中，所述两种异源多肽选自细胞因子多肽、抗体、抗体的抗原结合片段和fc结构域。在一些实施方案中，所述重组多肽包含细胞因子多肽、mm和fc结构域。在一些实施方案中，所述mm是结合至所述细胞因子或细胞因子受体多肽或其细胞因子结合片段的单链fv (scfv)抗体片段。在一些实施方案中，所述重组多肽包含结合靶标的抗体或其抗原结合片段，以及结合至所述抗体或其抗原结合片段并阻断所述抗体或其抗原结合片段结合至靶标的mm。

21、本公开的一个方面提供了包含pcl的经分离的多肽，其中所述pcl包含seq id no:10的氨基酸序列，其中所述pcl是用于蛋白酶的底物，其中所述经分离的多肽包含至少一个选自由以下组成的组的部分(m)：位于所述pcl的氨基(n)末端的部分(mn)、位于所述pcl的羧基(c)末端的部分(mc)以及它们的组合，并且其中所述mn或mc选自由抗体或其抗原结合片段；细胞因子或其功能片段；mm；细胞因子受体或其功能片段；免疫调节受体或其功能片段；免疫检查点蛋白或其功能片段；肿瘤相关抗原；靶向结构域；治疗剂；抗肿瘤剂；毒剂；药物；以及可检测标记组成的组。