FGF2-III型胶原蛋白的融合蛋白、生物材料、培养介质及其制备方法与应用与流程

本发明属于干细胞制备，尤其涉及一种fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白、生物材料、培养介质及其制备方法与应用。

背景技术：

1、间充质干细胞（msc）体外培养需依赖培养板包被材料提供细胞粘附支撑及生长信号，现有常用包被材料主要包括单一胶原蛋白（如i型、iii型胶原）、基质胶或游离生长因子（如fgf2）组合使用。胶原蛋白可模拟细胞外基质环境，促进msc贴壁；fgf2能显著提升msc增殖效率、维持细胞干性。

2、目前msc及其他干细胞培养板包被的主流方式为“胶原蛋白单独包被”或“胶原蛋白包被+游离fgf2添加”，广泛应用于基础科研、细胞治疗相关的msc扩增培养场景，其核心需求是兼顾msc的高粘附率、高效增殖能力及长期干性维持。传统的干细胞培养板包被方案需分步操作：先包被胶原，后续培养过程中添加游离fgf2，流程繁琐且易导致fgf2浪费。且游离fgf2热稳定性差、易降解，在培养体系中活性维持时间短，需反复补加，增加培养成本。此外，胶原蛋白与fgf2无协同作用，仅能分别提供粘附和生长信号，无法实现“粘附-增殖”信号的精准协同，导致msc粘附率不足、增殖速度慢，或长期传代后干性下降；现有包被材料难以同时满足msc“高粘附、长效增殖刺激、干性维持”的一体化需求，限制了msc培养效率及细胞质量。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白、生物材料、培养介质及其制备方法与应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白，所述fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示。

4、本发明提供了一种上述融合蛋白的编码基因，所述fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.12所示。

5、本发明提供了一种含有上述融合蛋白或编码基因的生物材料，为以下至少一种：

6、（1）含有上述融合蛋白或编码基因的重组表达质粒；

7、（2）含有上述融合蛋白或编码基因的重组菌；

8、（3）含有（1）所述重组表达质粒的重组菌；

9、（4）含有上述融合蛋白或编码基因的重组细胞；

10、（5）含有（1）所述重组表达质粒的重组细胞。

11、优选的，所述重组表达质粒的骨架载体包括pcdna3.4；所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌，所述重组细胞的宿主细胞包括hek293细胞。

12、本发明提供了一种用于干细胞培养的培养介质，所述培养介质含有上述融合蛋白或编码基因。

13、优选的，所述融合蛋白或编码基因的终浓度为5~40μg/ml。

14、本发明提供了一种上述培养介质的制备方法，包括以下步骤：

15、将所述融合蛋白或编码基因置于培养介质中，于2~6℃下恒温包被孵育14~16h。

16、本发明提供了一种上述融合蛋白、编码基因或培养介质在制备干细胞中的应用。

17、优选的，所述干细胞包括间充质干细胞；所述述融合蛋白、编码基因或培养介质能够促进干细胞粘附、促进干细胞增殖和维持干细胞干性中的一种或多种。

18、本发明提供了一种干细胞的制备方法，包括：

19、通过在上述融合蛋白、编码基因或培养介质中培养干细胞，以促进干细胞粘附、促进干细胞增殖和维持干细胞干性中的至少一种的步骤。

20、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

21、本发明提供了一种fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白、生物材料、培养介质及其制备方法与应用，研究发现，利用fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白培养干细胞后，干细胞的粘附数量、细胞形态明显优于单独ⅲ型胶原蛋白。而且fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白培养细胞后的细胞数量分别是单独游离fgf2对照组与单独ⅲ型胶原对照组的2.4倍和2.0倍。此外，利用该融合蛋白对干细胞连续培养传代20代，仍能能够稳定维持干细胞干性，且该融合蛋白的热稳定性高。表明利用所述融合蛋白或其编码基因能够促进干细胞粘附、干细胞增殖以及维持干细胞干性。

22、本发明利用上述融合蛋白或其编码基因包被的培养介质，在后续干细胞培养后无需额外添加fgf2，简化了干细胞的制备方法。

1.一种fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11所示。

2.一种权利要求1所述融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述fgf2-iii型胶原蛋白的融合蛋白的核苷酸序列如seq id no.12所示。

3.一种含有权利要求1所述融合蛋白或权利要求2所述编码基因的生物材料，其特征在于，为以下至少一种：

4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，所述重组表达质粒的骨架载体包括pcdna3.4；所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌，所述重组细胞的宿主细胞包括hek293细胞。

5.一种用于干细胞培养的培养介质，其特征在于，所述培养介质含有权利要求1所述融合蛋白或权利要求2所述编码基因。

6.根据权利要求5所述培养介质，其特征在于，所述融合蛋白或编码基因的终浓度为5~40μg/ml。

7.一种权利要求5或6所述培养介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2所述编码基因或权利要求5或6所述培养介质在制备干细胞中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述干细胞包括间充质干细胞；所述述融合蛋白、编码基因或培养介质能够促进干细胞粘附、促进干细胞增殖和维持干细胞干性中的一种或多种。

10.一种干细胞的制备方法，其特征在于，包括：