肿瘤血管发生调控蛋白及其应用的制作方法

1.本发明涉及肿瘤学、分子遗传学、分子生物学领域，具体涉及肿瘤血管发生调控蛋白及其应用。


背景技术：

肿瘤血管发生是实体瘤进一步生长及转移的一个关键步骤(weinberg ra,2008)。然而，控制肿瘤血管发生的分子及其机制仍然不清楚。肿瘤细胞通过分泌释放一些血管发生相关因子来激活血管内皮细胞，继而在肿瘤组织内部诱导产生丰富的血管网络(husemann y,et al.,2008)，这些新生血管将促进肿瘤的进一步生长及远端器官转移(viallard c et al.,2017)。因此，肿瘤细胞分泌的一系列血管发生因子成为肿瘤细胞-血管内皮细胞间相互交流的纽带(weis sm et al.,2011)，它们决定肿瘤血管发生的开启与否。通常情况下，大多数肿瘤血管发生的开启通过或者增加促血管发生因子基因的表达，或者通过下降抗血管发生因子基因的表达。其平衡与否将决定血管发生被诱导还是被抑制(otrock zk et al.,2007)。虽然最近的进展已经拓展了我们对于肿瘤细胞诱导血管发生机制的理解，然而，肿瘤细胞中通过转录后机制开发形成的控制血管发生基因表达平衡的机制，尤其是rna结合蛋白在控制这个平衡中发挥的作用及机制仍然不清楚。arid5a(at-rich interactive domain-containing protein 5a)是由arid5a基因编码的一种双链rna结合蛋白，属于arid(at-rich interaction domain)家族成员。arid5a与arid5b是同源蛋白，arid5a与arid5b都具有抑制肿瘤的作用，以下以arid5a示例。研究显示，缺失arid5a上调炎性因子il6并引发严重的自身炎性反应。arid5a-/-小鼠可有效抵抗博莱霉素(bleomycin)诱导的肺损伤。arid5a可能通过其n-末端区与rorγt(retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptorγt)结合并抑制th17细胞分化从而参与类风湿性关节炎发生。另外，arid5a可通过特异性稳定stat3的mrna从而调节初始cd4

t细胞分化。研究还发现，arid5a可稳定t-bet的mrna从而加剧ifn-γ介导的感染性休克。值得注意的是，arid5a的细胞浆定位对于其发挥mrna稳定功能是关键的。这些研究表明arid5a具有免疫功能调节功能。除此之外，arid5a还可作为一种细胞静止(cell quiescence)标志分子以及代谢性疾病的潜在治疗靶点。总之，这些报道表明arid5a在疾病发生及细胞进程中发挥重要作用。然而，目前关于arid5a在肿瘤进展中的作用，尤其是arid5a在人类肿瘤细胞中调节的信号通路及其靶基因仍不清楚。因此，阐明arid5a在肿瘤诱导血管发生中的调控作用及其机制对于未来靶向肿瘤血管发生治疗癌症具有非常重要的应用前景。


技术实现要素：

针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种肿瘤血管发生调控蛋白，对于肿瘤血管发生、肿瘤生长和转移的机制研究具有重要的理论价值，并且对于肿瘤治疗具有十分重要的应用价值。
第一方面，本发明提出了一种肿瘤血管发生调控蛋白，所述肿瘤血管发生调控蛋白包括arid5a和/或arid5b，所述arid5a的氨基酸序列如seq id no.1所示。第二方面，如seq id no.2所示，本发明提出了一种编码所述的肿瘤血管发生调控蛋白的基因。第三方面，本发明提出了一种蛋白截短体，所述蛋白截短体为权利要求1中所述arid5a蛋白的arid功能区，和/或，所述蛋白截短体为权利要求1中所述arid5b蛋白的arid功能区。第四方面，本发明提出了编码所述arid5a蛋白截短体或arid5b蛋白截短体的基因。第五方面，本发明提出了所述肿瘤血管发生调控蛋白或、所述的蛋白截短体在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生。第六方面，本发明提出了所述基因制备的生物材料。第七方面，本发明提出了所述基因制备的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生。第八方面，本发明提出了所述的肿瘤血管发生调控蛋白制备的可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白丰度的物质。第九方面，本发明提出了所述的可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用；所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生。第十方面，所述肿瘤血管发生调控蛋白和/或所述的基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。
附图说明
图1为arid5a体内外抑制肿瘤血管发生，其中，mda-mb-231/arid5a-gfp细胞和mda-mb-468/arid5a-gfp细胞均有效表达arid5a-gfp融合蛋白(图1a)；过表达arid5a基因显著抑制肿瘤细胞条件培养液诱导的血管细胞迁移及成管(图1b、图1c)；过表达arid5a基因抑制肿瘤组织中的血管发生(图1d和图1e)；图2为arid5a靶向3’utrs选择性促进肿瘤血管发生抑制基因的mrnas表达。过表达arid5a基因后，抗血管发生基因mrnas被上调，促血管发生基因被下调(图2a、图2b、图2c)；基因本体(gene ontology)数据分析显示
‘
angiogenesis’术语显著富集在arid5a调节的基因中(图2d)；arid5a蛋白可靶向结合抗血管发生基因的mrnas，但是不结合促血管发生基因的mrnas(图2e)；arid5a蛋白可靶向结合抗血管发生基因的3’utr上调其mrnas表达(图2f和图2g)；图3为arid5a的arid功能区负责稳定血管发生抑制基因的mrnas。对血管发生抑制基因mrnas半衰期的检测发现过表达arid5a基因显著增加它们的半衰期(图3a、图3b、图3c和图3d)；arid5a功能区结构示意图及不同突变体的制备策略(图3e)；免疫印迹法鉴定arid5a不同突变体的表达(图3f)；过表达t1截短体基因或t3截短体基因后，血管发生抑制
基因mrnas被上调(图3g)；t1截短体或t3截短体可靶向结合血管发生抑制基因的3’utr稳定它们的mrnas(图3h)；过表达t1截短体基因或t3截短体基因抑制肿瘤细胞条件培养液诱导的血管发生(图3i)；图4为体内过表达arid5a基因抑制肿瘤生长及转移，其中，表达arid5a基因的重组腺病毒可显著抑制裸鼠体内肿瘤生长和转移(图4a、图4b、图4c和图4d)，表达arid5a基因的重组腺病毒可以显著抑制肿瘤组织内血管发生(图4e)。
具体实施方式
本发明的目的在于，提供了arid5a、arid5b蛋白以及arid5a、和/或arid5b基因的一种新用途，更具体地，本发明涉及arid5a、arid5b蛋白以及arid5a、arid5b基因在制备肿瘤治疗药物中的新用途以及作为靶标物在抗肿瘤血管发生药物研发中的新用途。本发明首先保护arid5a和/或arid5b蛋白在制备抗肿瘤血管发生治疗药物中的应用。本发明还保护arid5a和/或arid5b基因或具有arid5a和/或arid5b基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明还保护可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白丰度的物质可以为arid5a和/或arid5b蛋白本身，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b蛋白上游的可以促进arid5a和/或arid5b蛋白生成的其他蛋白质或基因序列，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b蛋白下游的可以减少arid5a和/或arid5b蛋白降解的其他蛋白质，也可以是促进生物体中arid5a和/或arid5b蛋白水平增加的化合物或其他小分子。本发明还保护可以上调生物体中arid5a和/或arid5b基因丰度的物质在制备肿瘤治疗药物中的应用。所述可以上调生物体中arid5a和/或arid5b基因丰度的物质可以为arid5a和/或arid5b基因本身，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b基因上游的可以促进arid5a和/或arid5b基因表达的其他蛋白或核酸分子，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b基因下游的可以减少arid5a和/或arid5b基因降解的其他蛋白或核酸分子，也可以是促进生物体中arid5a和/或arid5b基因表达的化合物或其他小分子。本发明还保护arid5a和/或arid5b蛋白或arid5a和/或arid5b基因作为靶标物在抗肿瘤血管发生药物研发中的应用。arid5a和/或arid5b蛋白作为靶标物可被上调。可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白的物质可以为arid5a和/或arid5b蛋白本身，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b蛋白上游的可以促进arid5a和/或arid5b蛋白生成的其他蛋白质，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b蛋白下游的可以减少arid5a和/或arid5b蛋白降解的其他蛋白质，也是可以促进生物体中arid5a和/或arid5b蛋白水平增加的化合物或其他小分子。arid5a和/或arid5b基因作为靶标物具体可为arid5a和/或arid5b基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中arid5a和/或arid5b基因的物质可以为arid5a和/或arid5b基因本身，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b基因上游的可以促进arid5a和/或arid5b基因表达的其他蛋白或核酸分子，也可以是生物体中位于arid5a和/或arid5b基因下游的可以减少arid5a和/或arid5b基因降解的其他蛋白或核酸分子，也是可以促进生物体中arid5a和/或arid5b基因表达的化合物或其他小分子。
本发明还保护一种arid5a和/或arid5b蛋白截短体，即arid5a和/或arid5b蛋白的arid功能区。arid5a和/或arid5b蛋白的arid功能区为arid5a和/或arid5b蛋白第55-148位氨基酸残基。编码所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护arid5a和/或arid5b蛋白截短体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明还保护编码所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因或具有编码所述arid5a蛋白截短体的基因的生物材料在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明还保护arid5a和/或arid5b蛋白截短体或编码所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因作为靶标物在抗肿瘤药物研发中的应用。arid5a蛋白截短体作为靶标物具体可为arid5a和/或arid5b蛋白截短体作为靶标物被上调。可以上调生物体中arid5a和/或arid5b蛋白截短体的物质可以为arid5a和/或arid5b蛋白截短体本身，也是可以促进生物体中arid5a和/或arid5b蛋白截短体水平增加的其他蛋白质、肽段、化合物或其他小分子。编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因作为靶标物具体可为编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因作为靶标物被上调。可以上调生物体中编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因的物质可以为编码arid5a蛋白截短体的基因本身，也可以是促进编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因表达的其他蛋白、多肽、核酸分子、化合物或其他小分子。以上任一所述药物的功能为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)：(a1)治疗肿瘤；(a2)抑制肿瘤生长和/或转移；(a3)抑制肿瘤血管发生。以上任一所述arid5a和/或arid5b蛋白可为人arid5a和/或arid5b蛋白。以上任一所述arid5a和/或arid5b蛋白具体可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：(b1)序列表中seq id no.1所示的蛋白质；(b2)在(b1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；(b3)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a3)中任一功能的蛋白质；(b4)来源于人且与(b1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a3)中任一功能的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列
所述arid5a和/或arid5b蛋白还可为其它物种中的具有(a1)至(a3)中任一功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。arid5a和/或arid5b基因即编码arid5a和/或arid5b蛋白的基因。以上任一所述arid5a和/或arid5b基因具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)编码区如序列表中seq id no.2所示的dna分子；(c2)来源于人且与(c1)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；(c3)在严格条件下与(c1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。所述arid5a和/或arid5b基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。arid5a和/或arid5b蛋白截短体具体可为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：(d1)序列表的seq id no.1中第55-148位氨基酸残基所示的蛋白质；(d2)在(d1)的氨基末端或羧基末端连接标签得到的融合蛋白；(d3)将(d1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有(a1)至(a3)中任一功能的蛋白质；(d4)来源于人且与(d1)具有98％以上同一性且具有(a1)至(a3)中任一功能的蛋白质。标签具体如表1所示。所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体还可为其它物种中的具有(a1)至(a3)中任一
功能的同源蛋白。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。以上任一所述编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因具体可为如下(e1)或(e2)或(e3)：(e1)序列表中seq id no.2所示的dna分子中编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的dna分子；(e2)来源于人且与(e1)具有95％以上同一性且编码所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体的dna分子；(e3)在严格条件下与(e1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述arid5a和/或arid5b蛋白截短体的dna分子。所述编码arid5a蛋白截短体的基因还可为其它物种中的同源基因。所述其它物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猴子、猩猩、猿类、牛、羊、猪、马、绵羊、山羊、猫等。以上任一所述具有arid5a和/或arid5b基因的生物材料可为具有arid5a和/或arid5b基因的表达载体。以上任一所述具有编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因的生物材料可为具有编码arid5a和/或arid5b蛋白截短体的基因的表达载体。所述表达载体能够携带核苷酸序列，并将这个序列整合到细胞基因组中，并能够在细胞中复制。“表达载体”包括质粒、黏端质粒、病毒(噬菌体、动物病毒、植物病毒等)以及人工染色体(比如yacs)。当前可能适用于临床基因治疗的作为表达载体的病毒(又称病毒载体)如下：腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、嵌合病毒载体以及其它病毒载体。以上任一所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。以上任一所述肿瘤细胞包括但不限于乳腺癌细胞。本发明的发明者发现arid5a和/或arid5b蛋白具有显著的肿瘤抑制功能，可抑制肿瘤血管发生，其机制在于选择性稳定抗血管发生基因转录本的表达(包括endostatin、restin、bai1、timp3等)。本发明的发明者发现在乳腺癌组织及细胞中arid5a和/或arid5b基因表达是被抑制的，这可能方便肿瘤细胞诱导血管发生。过表达arid5a和/或arid5b基因可抑制乳腺癌细胞诱导的肿瘤血管发生，然而，通过使用shrna进一步抑制arid5a和/或arid5b基因表达可增强肿瘤血管发生。与这些体外观察相一致，在生物体内过表达arid5a和/或arid5b基因可显著抑制肿瘤生长及转移。通过分析人肿瘤组织样本数据库，发明者发现低表达水平的arid5a和/或arid5b强烈的与差的乳腺癌患者存活相关联。并且，在癌症患者组织中arid5a基因的表达水平与其靶基因endostatin、restin、bai1的表达水平呈显著负相关。这些结果表明arid5a和/或arid5b是一个潜在的抑癌基因，参与调节血管发生信号通路，通过增加抗血管发生基因表达。基于此，利用该肿瘤抑制性蛋白arid5a和/或arid5b提高临床肿瘤治疗效果具有非常重要的应用前景。本发明首次鉴定人arid5a和/或arid5b基因是一种肿瘤抑制基因，肿瘤细胞中过表达arid5a和/或arid5b基因可显著抑制肿瘤血管发生并抑制肿瘤转移。本发明对于肿瘤血管发生、肿瘤生长和转移的机制研究具有重要的理论价值。本发明对于肿瘤治疗具有十分重要的理论及实际意义。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置3次以上重复实验，结果取平均值。pegfp-n1载体：clontech公司；pegfp-n1载体表达egfp蛋白，egfp蛋白又称为gfp蛋白。mda-mb-468细胞(人乳腺癌细胞)：htb-132
tm
。mda-mb-231细胞(人乳腺癌细胞)：htb-26
tm
。实施例1、arid5a抑制肿瘤诱生血管发生新功能的鉴定1、将arid5a基因(arid5a基因如序列表的seq id no.2所示，插入序列去除了终止密码子)插入pegfp-n1载体的ecor i和agei酶切位点之间，得到重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp。重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp已进行测序验证。重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp中，插入的dna分子与载体中的egfp基因形成融合基因，表达arid5a-egfp融合蛋白(简称a5a-gfp融合蛋白)。2、将重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp导入mda-mb-468细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-468/a5a-gfp细胞。3、将pegfp-n1载体导入mda-mb-468细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-468/gfp细胞。4、将重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp导入mda-mb-231细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-231/a5a-gfp细胞。5、将pegfp-n1载体导入mda-mb-231细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-231/gfp细胞。6、分别取mda-mb-468/a5a-gfp细胞、mda-mb-231/a5a-gfp细胞以及mda-mb-468/gfp细胞和mda-mb-231/gfp细胞，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液进行免疫印迹。免疫印迹采用arid5a抗体的结果见图1a。endo-arid5a代表细胞内源的arid5a蛋白。7、取mda-mb-231/gfp细胞条件培养上清液(在图中标注为mda-mb-231/con-cm)和mda-mb-231/a5a-gfp细胞条件培养上清液(在图中标注为mda-mb-231/arid5a-cm)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，72h后收集细胞培养上清液，过滤离心，加入到划痕过的脐静脉内皮细胞(huvecs)中，培养24h后，观测内皮细胞迁移(如图1b左)，计算划痕面积，以检测过表达arid5a基因对血管内皮细胞迁移的影响。同样的操作在mda-mb-468/gfp细胞和mda-mb-468/arid5a-gfp细胞中开展，划痕面积定量结果见图1b右。8、取mda-mb-231/gfp细胞条件培养上清液(在图中标注为mda-mb-231/con-cm)和mda-mb-231/a5a-gfp细胞条件培养上清液(在图中标注为mda-mb-231/arid5a-cm)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，72h后收集细胞培养上清液，过滤离心，与huvecs细胞(1x104)加入铺有基质胶的96-孔板中，培养12h后，观测内皮细胞成管能力(如图1c左)，计算成管的分支点数目，以检测过表达arid5a基因对血管内皮细胞成管能力的影响。同样的操作在mda-mb-468/gfp细胞和mda-mb-468/arid5a-gfp细胞中开展，成管能力定量结果见图1c右。9、取mda-mb-231/gfp细胞及mda-mb-231/arid5a-gfp细胞成瘤的组织(在图中分别标注为con和arid5a-gfp)进行cd31免疫组化染色，以检测过表达arid5a基因对肿瘤组织内血管发生的影响。典型免疫组化染色结果如图1d左，cd31染色阳性的微血管数量定量结
果如图1d右。10、取mda-mb-468/gfp细胞及mda-mb-468/arid5a-gfp细胞成瘤的组织(在图中分别标注为con和arid5a-gfp)进行cd31免疫组化染色，以检测过表达arid5a基因对肿瘤组织内血管发生的影响。典型免疫组化染色结果如图1e左，cd31染色阳性的微血管数量定量结果如图1e右。图1的结果表明：mda-mb-231/a5a-gfp细胞和mda-mb-468/a5a-gfp细胞均有效表达arid5a-gfp融合蛋白(图1a)；体内外过表达arid5a基因显著抑制肿瘤细胞诱导的血管发生(图1b、图1c、图1d和图1e)。以上结果表明：过表达arid5a基因从而提高arid5a蛋白水平，可以抑制肿瘤细胞诱导的血管发生，即过表达arid5a基因从而提高arid5a蛋白水平具有治疗肿瘤的效果。arid5a蛋白/arid5a基因的上述功能是本发明的发明人首次发现的。实施例2、arid5a特异性稳定血管发生抑制基因mrnas一、arid5a特异性结合血管发生抑制基因mrnas为了进一步检测arid5a蛋白抑制肿瘤血管发生的机制，对调节肿瘤血管发生相关基因进行检测分析。1、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞和mda-mb-468/a5a-gfp细胞及其对照细胞mda-mb-231/gfp细胞和mda-mb-468/gfp，培养36小时后分别提取总rna并反转录为cdna，然后进行rna-seq检测血管发生相关基因表达，结果见图2a。2、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞及其对照细胞mda-mb-231/gfp细胞，培养36小时后分别提取总rna并反转录为cdna，然后进行pcrarray(qiagen公司)检测血管发生相关基因表达，结果见图2b。3、取mda-mb-231/a5a-gfp细胞及其对照细胞mda-mb-231/gfp细胞，进行如下步骤：不同培养时间(0h、24h、36h、48h)收集细胞，提取总rna并反转录为cdna，然后进行qpcr以检测目标基因的表达量。结果见图2c。4、对rna-seq数据中被arid5a调节的基因进行基因本体(gene ontology)分析，检测发现arid5a调节的基因显著富集在“血管发生(angiogenesis)”术语，表明arid5a调控血管发生活动，结果见图2d红色箭头标示。5、取mda-mb-231/a5a-gfp细胞，进行如下步骤：培养36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液；将gfp抗体(或同型igg)与protein a/g beads(santa cruz公司)孵育2h,然后加入上述裂解液并继续孵育2h，然后4℃、2000rpm离心，充分洗涤beads，然后用trizol收集总rna；进行rt-pcr以检测目的基因的富集。结果见图2e。gapdh作为阴性对照，stat3作为阳性对照。6、荧光素酶报告子试验供试质粒分别为：重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp(在图中标注为arid5a)或pegfp-n1载体(在图中标注为control)。报告子载体构建分别为：具有β-actin基因3’utr的报告子载体、具有col18a1基因3’utr的报告子载体、具有timp3基因3’utr的报告子载体、具有bai1基因3’utr的报告子载体、具有bai2基因3’utr的报告子载体或具有timp2基因3’utr的报告子载体，示意图如图2f所示。在hek293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用dual-luciferasereporter assay system
(promega)检测荧光素酶活性，结果见图2g。步骤一的结果表明：过表达arid5a基因后，血管发生抑制基因mrnas被上调，部分血管发生促进基因被下调(图2a、图2b、图2c)；而且arid5a调节的基因显著富集在“angiogenesis(血管发生)”术语中(图2d)，这进一步表明其对肿瘤血管发生的调控作用；arid5a蛋白可靶向结合血管发生抑制基因的mrnas，但是不结合血管发生促进基因的mrnas(图2e)；arid5a蛋白可靶向结合血管发生抑制基因的3’utr(图2f和图2g)，这表明arid5a特异性结合血管发生抑制基因mrnas的3’utr并促进其表达。综上结果表明：本发明的发明人首次发现了arid5a蛋白的一个新功能，即可以通过靶向结合3’utr选择性结合血管发生抑制基因mrnas并促进其表达，该新功能解释了过表达arid5a基因可以阻止肿瘤血管发生的本质原因。二、arid5a蛋白的arid功能区稳定血管发生抑制基因mrnas及肿瘤血管发生1、取mda-mb-231/a5a-gfp细胞(在图中标注为arid5a-gfp)和mda-mb-231/gfp细胞(在图中标注为empty vector)，分别进行如下步骤以检测血管发生抑制基因mrnas的半衰期：用actd和drb处理细胞(actd的工作浓度为5μg/ml，drb的工作浓度为5μg/ml)，分别于0min、30min、60min、90min和120min后提取总rna，然后进行qrt-pcr以检测目的基因的半衰期。结果见图3a、图3b、图3c和图3d。arid5a蛋白的结构域示意图见图3e。第55-148位氨基酸残基为arid结构域，其结构分析如图3e右。制备若干重组质粒如下(各个重组质粒均已进行测序验证)：将序列表的seq id no.2中编码截短体1的dna分子插入pegfp-n1载体，得到重组质粒pegfp-n1-t1-gfp；重组质粒pegfp-n1-t1-gfp表达t1-egfp融合蛋白。截短体1用t1表示，如序列表的seq id no.1中第1-148位氨基酸残基所示。将序列表的seq id no.2中编码截短体2的dna分子插入pegfp-n1载体，得到重组质粒pegfp-n1-t2-gfp；重组质粒pegfp-n1-t2-gfp表达t2-egfp融合蛋白。截短体2用t2表示，如序列表的seq id no.1中第149-594位氨基酸残基所示。将序列表的seq id no.2中编码截短体3的dna分子插入pegfp-n1载体，得到重组质粒pegfp-n1-t3-gfp；重组质粒pegfp-n1-t3-gfp表达t3-egfp融合蛋白。截短体3用t3表示，如序列表的seq id no.1中第55-148位氨基酸残基所示。2、将重组质粒pegfp-n1-t1-gfp导入mda-mb-231细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-231/t1-gfp细胞。将重组质粒pegfp-n1-t2-gfp导入mda-mb-231细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-231/t2-gfp细胞。将重组质粒pegfp-n1-t3-gfp导入mda-mb-231细胞，得到重组细胞，命名为mda-mb-231/t3-gfp细胞。3、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞(在图中标注为wt)，取步骤2制备的mda-mb-231/t1-gfp细胞(在图中标注为1-148)、mda-mb-231/t2-gfp细胞(在图中标注为149-594)和mda-mb-231/t3-gfp细胞(在图中标注为55-148)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液采用gfp抗体进行免疫印迹。结果见图3f。4、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞(在图中标注为arid5a)和mda-mb-231/gfp细胞(在图中标注为empty vector)，取步骤2制备的各个重组细胞(根据截短体，在
图中分别标注为1-148、149-594、55-148)，分别进行如下步骤：在平行条件下进行培养，36小时后取细胞，提取总rna并反转录为cdna，然后进行qpcr以检测血管发生抑制基因的表达量。结果见图3g。5、荧光素酶报告子试验在hek293细胞中共转染供试质粒和报告子载体，转染36小时后进行细胞裂解，然后收集裂解液，利用dual-luciferasereporter assay system(promega)检测荧光素酶活性，结果见图3h。供试质粒分别为：重组质粒pegfp-n1-arid5a-gfp(在图中标注为arid5a)或pegfp-n1载体(在图中标注为empty vector)或重组质粒pegfp-n1-t1-gfp(在图中标注为1-148)或重组质粒pegfp-n1-t2-gfp(在图中标注为149-594)或重组质粒pegfp-n1-t3-gfp(在图中标注为55-148)。报告子载体分别为：具有β-actin基因3’utr的报告子载体、具有col18a1基因3’utr的报告子载体、具有timp3基因3’utr的报告子载体、具有bai1基因3’utr的报告子载体或具有timp2基因3’utr的报告子载体。6、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞的条件培养上清液(在图中标注为a5a cm)和mda-mb-231/gfp细胞的条件培养上清液(在图中标注为con cm)，取步骤2制备的mda-mb-231/t1-gfp细胞的条件培养上清液(在图中标注为1-148cm)，mda-mb-231/t2-gfp细胞的条件培养上清液(在图中标注为149-594cm)和mda-mb-231/t3-gfp细胞的条件培养上清液(在图中标注为55-148cm)，分别进行如下步骤：在平行条件下与huvecs细胞(1x104)进行培养，12小时后检测内皮细胞成管能力。结果见图3i。步骤二的结果表明：过表达t1截短体基因或t3截短体基因后，血管发生抑制基因mrnas被上调(图3g)；t1截短体或t3截短体可靶向结合血管发生抑制基因的3’utr稳定它们的mrnas(图3h)；过表达t1截短体基因或t3截短体基因抑制肿瘤诱导的血管发生(图3i)。以上结果表明：arid5a蛋白的arid功能区在特异性稳定血管发生抑制基因及抑制肿瘤血管发生中发挥重要作用。实施例3、过表达arid5a基因(提高arid5a蛋白水平)抑制肿瘤生长及转移1、取实施例1中的mda-mb-231/a5a-gfp细胞(在图中标注为arid5a-gfp)和mda-mb-468/gfp细胞(在图中标注为control vector)，分别进行如下步骤：背部皮下注射balb/c裸鼠(每只小鼠注射：1
×
108个细胞/100μl pbs缓冲液)，从注射开始计天数。第14天至第36天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图4a(5只小鼠的平均值)，注射36天后小鼠原位肿瘤的照片见图4b。第36天处死小鼠并进行解剖，除了原位肿瘤外，所有小鼠都发生了肺转移。取肺脏并拍照，见图4c的左图。统计肺脏中的白色结节数量，见图4c的右图(5只小鼠的平均值)。2、取mda-mb-231细胞，背部皮下注射balb/c裸鼠(每只小鼠注射：1
×
108个细胞/100μl pbs缓冲液)。从注射mda-mb-231细胞开始计天数。第48天时，各小鼠的原位肿瘤均直径》5mm。第48天开始每隔一天注射一次重组腺病毒(每次每只小鼠注射1
×
10
10
pfu)，共注射5次。设置两个处理组，分别给予表达arid5a基因的重组腺病毒(arid5a基因如序列表的seq id no.2所示，表达arid5a基因的重组腺病毒用arid5a adenovirus或ad-arid5a表示)或对照腺病毒(用control adenovirus或ad-con表示，与表达arid5a基因的重组腺病毒相比对照腺病毒的差异仅在于不具有所述arid5a基因)。第24天至第64天每天测量原位的肿瘤体积，原位肿瘤体积随时间的变化见图4a(5只小鼠的平均值)。第64天，处死小鼠，取肿瘤块，
对比肿瘤大小，见图4b。肿瘤组织内arid5a-gfp融合蛋白的表达通过免疫印迹法检测，结果见图4c(其中c1,c2表示使用表达gfp的ad-con处理的肿瘤；t1,t2表示使用ad-arid5a处理的肿瘤)。取肺脏制作病理切片并进行he染色，见图4d左。根据he染色的结果统计转移灶数量，结果见图4d右(5只小鼠的平均值)。使用ad-control和ad-arid5a处理的肿瘤组织(在图中分别标注为ad-control和ad-arid5a)进行cd31免疫组化染色结果如图4e左，cd31染色阳性的微血管数量定量结果如图4e右。结果发现arid5a可在体内显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤细胞肺转移以及肿瘤血管发生。综上实验结果表明，过表达arid5a基因(提高arid5a蛋白水平)可显著抑制肿瘤生长、转移及肿瘤血管发生。在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88
……
以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本技术中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。