治疗B细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用与流程

治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及医药生物领域，涉及治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用。


背景技术：

2.b-cell maturation antigen(bcma)是b细胞成熟抗原(cd269)tumor necrosisfactor(tnf)受体超家族的成员，含有184个氨基酸，是i型跨膜蛋白。bcma主要表达于晚期成熟b细胞亚群中，比如浆细胞中。在造血干细胞及早期b细胞中不表达，在非造血组织中也不表达。另外在非小细胞肺癌中异常表达。该靶点相关通路目前主要应用于治疗系统性红斑狼疮(benlysta靶向blys，2011年获批)和多发性骨髓瘤(mm)。bcma的配体为b细胞活化因子(baff)和增殖诱导配体(april)。配体blys与bcma结合后，激活bcma的下游nf-kappab和mapk8/jnk通路，促进b细胞的增殖、分化和促进抗体的产生。配体april与bcma结合后，可促进mm细胞生长及产生骨髓中免疫抑制微环境。
3.在多发性骨髓瘤患者中，血清中游离性bcma浓度升高，竞争性结合baff，导致浆细胞激活受到影响。因此bcma在mm疾病进展中起到重要作用。bcma rna在mm细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面可检测到bcma蛋白。bcma缺乏的小鼠看上去一切正常，似乎很健康，而且b细胞数量正常，但浆细胞却不能长期存活。因此，bcma将是用具有chimeric antigen receptor(car)表达细胞治疗mm的合适靶抗原。


技术实现要素：

4.本发明提供了特异性结合bcma的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下氨基酸序列的重链可变区：
5.1)seq id no.1所示的序列；
6.2)与seq id no.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
7.3)与seq id no.1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
8.和/或
9.选自以下氨基酸序列的轻链可变区：
10.4)seq id no.2所示的序列；
11.5)与seq id no.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
12.6)与seq id no.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
13.进一步，所述抗体或其抗原结合片段包括scfv、di-scfv、(scfv)2、fab、fab’、(fab’)2、(fab’)3、fv片段、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白、单结构域抗体。
14.在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体的抗原结合片段是scfv，所述scfv还包括连接重链可变区和轻链可变区的linker。
15.优选地，所述linker序列包括seq id no.3所示的序列。
16.本发明提供了特异性结合bcma的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域为特异性结合bcma的scfv，所述scfv限定如前面所述。所述scfv的序列如seq id no.12所示。
17.进一步，所述跨膜结构域包含选自下列蛋白的跨膜区：t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd137、cd152、cd154、pd1；优选地，所述跨膜结构域包含cd8α的跨膜区；更优选地，所述cd8α的跨膜区序列包括以下任一项所述的序列：
18.1)seq id no.4所示的序列；
19.2)与seq id no.4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
20.3)与seq id no.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
21.进一步，所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间，所述间隔结构域包含选自铰链结构域和/或免疫球蛋白的ch2和ch3区；优选地，所述铰链结构域包含cd8α、pd1、cd152或cd154的铰链区；优选地，所述铰链结构域包含cd8α的铰链区；更优选地，所述cd8α的铰链区序列包括以下任一项所述的序列：
22.1)seq id no.5所示的序列；
23.2)与seq id no.5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
24.3)与seq id no.5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
25.进一步，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
26.优选地，所述胞内信号传导结构域从n端到c端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。
27.优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。
28.优选地，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序。
29.优选地，所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域：cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cds、cd22、cd79a、cd79b或cd66d；更优选地，所述初级信号传导结构域包含cd3ζ的胞内信号传导结构域；更优选地，所述cd3ζ的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列：
30.1)seq id no.6所示的序列；
31.2)与seq id no.6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
32.3)与seq id no.6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
33.优选地，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域：card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd134、4-1bb、cd150、cd270、cd278或dap10；更优选地，所述共刺激信号传导结构域包含4-1bb的胞内信号传导结构域；更优选地，所述4-1bb的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列：
34.2)seq id no.7所示的序列；
35.2)与seq id no.7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
36.3)与seq id no.7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
37.进一步，所述嵌合抗原受体进一步在其n端包含信号肽；优选地，所述信号肽包含重链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽，或cd8α信号肽；更优选地，所述信号肽是cd8α信号肽。cd8α信号肽包括以下任一项所述的序列：
38.1)seq id no.8所示的序列；
39.2)与seq id no.8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
40.3)与seq id no.8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
41.本发明的所述嵌合抗原受体包含以下任一项所述的氨基酸序列：
42.1)seq id no.9所示的序列；
43.2)与seq id no.9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
44.3)与seq id no.9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
45.本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，或者编码前面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
46.进一步，所述核酸分子进一步包含编码自杀开关多肽和/或自裂解肽的核苷酸序列。
47.进一步，所述自裂解肽包括p2a，e2a，f2a或t2a；优选地，所述自裂解肽是t2a，优选地，t2a的氨基酸序列包括seq id no.10所示的序列。
48.进一步，所述自杀开关多肽包括caspase-9、egfr中的含胞外结构域iii和胞外结
构域iv的片段或rqr8，优选地，egfr中的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段的氨基酸序列包括seq id no.11所示的序列。
49.本发明提供了载体，其包含前面所述的核酸分子。
50.进一步，所述载体包括dna载体，rna载体，质粒，转座子载体，crispr/cas9载体，或病毒载体；优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。
51.本发明提供了宿主细胞，其包含前面所述的核酸分子，或前面所述的载体。
52.进一步，所述宿主细胞包括大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
53.进一步，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、nk细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
54.本发明提供了制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养前面所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
55.本发明提供了制备表达前面所述的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞；其中步骤(2)包括将前面所述的核酸分子或前面所述的载体引入步骤(1)所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
56.本发明提供了宿主细胞群体，其包含前面所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞群体进一步包含不包含前面所述的核酸分子，或前面所述的载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、nk细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
57.本发明提供了试剂盒，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体，前面所述的宿主细胞，或前面所述的宿主细胞群体。
58.本发明提供了缀合物，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段，以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分；优选地，所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂；优选地，可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素；优选地，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
59.本发明提供了药物组合物，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体，前面所述的宿主细胞，前面所述的宿主细胞群体，或前面所述的缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
60.进一步，本发明的药物组合物还包括另外的药学活性剂；优选地，所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物(如抗肿瘤药物，如用于放疗的药物或化疗药物)。
61.本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗b细胞相关病况的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前面所述的宿主细胞、前面所述的宿主细胞群体，或前面所述的药物组合物。
62.本发明提供了用于诊断受试者是否患有表达bcma的肿瘤的方法，其包括使用前面所述的抗体或其抗原结合片段检测bcma在来自所述受试者的样品中的量；
63.优选地，所述方法还包括：将所述bcma在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较，并确定来自所述受试者的样品的bcma水平是否落入
与肿瘤相关的bcma水平内；
64.优选地，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物；
65.优选地，所述表达bcma的肿瘤包括b细胞恶性肿瘤，优选地，所述b细胞恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
66.本发明提供了应用，其包含以下任一项所述的应用：
67.1)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备特异性结合bcma的嵌合抗原受体中的应用；优选地，所述嵌合抗原受体包括前面所述的嵌合抗原受体。
68.2)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗b细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
69.3)前面所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的缀合物在制备诊断受试者是否患有表达bcma的肿瘤的试剂盒中的应用；
70.4)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备前面所述的缀合物中的应用；
71.5)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备表达嵌合抗原受体的宿主细胞中的应用；优选地，所述宿主细胞是前面所述的宿主细胞；
72.6)前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备前面所述的试剂盒中的应用；
73.7)前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备预防和/或治疗b细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
74.8)前面所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗b细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
75.9)前面述的宿主细胞群体在制备预防和/或治疗b细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物。
76.本发明的所述b细胞相关病况包括b细胞恶性肿瘤或与b细胞相关的自身免疫疾病。
77.本发明的所述b细胞相关病况包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不确定的恶性潜能的b细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生性病症、免疫调节病症、风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合症、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、斯耶格伦氏综合症、寻常天胞疮、硬皮病、多发性硬化、抗磷脂综合症、anca相关性小血管炎、古德帕斯彻病、川崎病、自身免疫性溶血性贫血以及急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或者意义未明的单克隆丙种球蛋白血症、系统性红斑狼疮。
78.如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(例如scfv，di-scfv，(scfv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体包括任何类型的抗体，例如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定的类型。取决于抗体重链恒
定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的类型。有五种主要类型的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。重链恒定区由4个结构域(ch1、hinge region、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。
79.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，raven press,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼ig、ig nar、fab片段、fab'片段、f(ab)'2片段、f(ab)'3片段、fd、fv、scfv、di-scfv、(scfv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；nat biotechnol,23:1126-1136中。
80.如本文中所使用的，术语“骆驼ig”或“骆驼vhh”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(koch-nolte等人,faseb j.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼抗体”是指含有两个vh结构域并且不含轻链的抗体(riechmann l.等人,免疫学方法杂志(j.immunol.methods)231:25-38(1999)；wo94/04678；wo94/25591；美国专利第6,005,079号)。
81.如本文中所使用的，术语“ignar”或“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫组库的由一个可变新抗原受体(vnar)结构域和五个恒定新抗原受体(cnar)结构域的同源二聚体组成的一类抗体。
附图说明
82.图1显示利用流式细胞仪检测t细胞表面car的表达情况的结果图；
83.图2显示利用流式细胞仪检测car-t细胞杀伤效果第一次结果图；
84.图3显示利用流式细胞仪检测car-t细胞杀伤效果的第二次结果图。
具体实施方式
85.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
86.实施例
87.1、t细胞纯化
88.人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的t细胞分离试剂盒获得纯化的cd3

t细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量的cd3/cd28磁珠活化2天。2天后，敲除tcr。2天后，进行tcr阴性分选，之后加入病毒上清与polybrene(6μg/ml)孵育。6小时后，离心清洗t细胞1次后，加入含250u il-2的cts
tm aim v
tm t细胞扩增无血清培养基扩增t细胞。
89.2、car表达载体构建
90.构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中嵌合抗原受体各个元件的组合顺序(从n端到c端)如下：
91.cd8α信号肽-scfv-人cd8a分子柔性片段-人cd8分子跨膜区-4-1bb胞内段-cd3ζ(氨基酸序列如seq id no.9所示)。
92.另外，载体中还插入编码t2a的核苷酸序列和编码egfr中的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段的核苷酸序列。各个元件的组合顺序(从n端到c端)如下：
93.cd8α信号肽-scfv-人cd8a分子柔性片段-人cd8分子跨膜区-4-1bb胞内段-cd3ζ-t2a-egfr中的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段(t2a的氨基酸序列如seq id no.10所示，egfr中的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段的氨基酸序列如seq id no.11所示)。
94.3、慢病毒包装
95.4、慢病毒转导
96.5、car-t细胞扩增
97.6、t细胞car表达效率检测
98.t细胞感染3天后，利用流式细胞术对t细胞表面car的表达情况进行检测。结果显示car表达阳性率达到～65％(如图1所示)。
99.7、car-t细胞杀伤效果评价
100.t细胞感染3天后，计数t细胞与靶细胞，然后按照效靶比(效应细胞：靶细胞，e:t)2：1，1：1，1：2的比例，将t细胞(效应细胞)与cd269高表达靶细胞(h929)分别共孵育20小时、36小时、48小时。共孵育结束后，离心收集细胞，利用细胞燃料(apc)对靶细胞进行标记，然后流式细胞术分析靶细胞占比(如图2，表1所示)。结果显示，car-t细胞对表达cd269的肿瘤细胞具有很强的杀伤能力，说明该car-t细胞具有很强的特异性杀伤能力。48小时car-t细胞将靶细胞杀光后(2：1，1：1)，继续按照效靶比(效应细胞：靶细胞，e:t)2：1，1：1的比例，将t细胞(效应细胞)再次与cd269高表达靶细胞(h929)分别共孵育24小时、36小时。共孵育结束后，离心收集细胞，利用细胞燃料(apc)对靶细胞进行标记，然后流式细胞术分析靶细胞占比(如图3，表2所示)。结果显示，car-t细胞对表达cd269的肿瘤细胞仍然具有很强的杀伤能力，说明该car-t细胞具有非常强的特异性杀伤能力。
101.表1第一次杀伤
102.第一次杀伤0h20h36h48h2：115.2％0.5％0.1％0％1：127％4.1％0.2％0.4％
1：244.5％28.3％1.8％4.4％
103.表2第二次杀伤
104.第二次杀伤0h24h36h2：112.1％0.3％0％1：120.8％0.6％0％
105.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。