用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针及其制备的制作方法

1.本发明涉及一种小分子荧光探针化合物，更具体地说是一种基于扭曲分子内电荷转移机制的双光子化合物对线粒体中二氧化硫和粘度实现双重检测的荧光探针，属于荧光传感器探针化合物领域。


背景技术：

2.线粒体作为细胞中的“动力工厂”，是生物体内物质交换和能量转换的重要场所，参与了许多生理过程，如信号传递、细胞分化、生长和死亡。线粒体的功能是基于许多重要的生物分子来实现的，包括各种金属离子、活性氧/氮/硫物种（ros/rns/rss）等。此外，线粒体黏度的增加会导致线粒体网状组织发生突变，表现为线粒体形态恶化，严重阻碍物质运输。据研究表明，二氧化硫（so2）通常与神经系统疾病、心血管疾病甚至肺癌的症状有关。同时，在众多细胞微环境因素中，粘度是反映蛋白质、脂质和多糖等物质流动状态的重要参数，粘度影响细胞功能的执行，如细胞凋亡和自噬。因此，异常的细胞粘度与各种疾病密切相关，如阿尔茨海默病、糖尿病和癌症。此外，研究表明线粒体粘度异常与氧化还原稳态失衡密切相关，而so2可有效调节氧化应激。这表明线粒体粘度与so2浓度密切相关。因此，开发一种可以同时检测线粒体中so2水平和粘度的传感器至关重要。
3.迄今为止，分光光度法、色谱检测、电化学分析、化学发光和荧光探针等多种检测方法已被应用于检测so2或其衍生物。在这些方法中，荧光探针因其高选择性和灵敏度、实时检测和易于操作而被认为是检测活性分子的有力工具。此外，细胞粘度的测量仍然是化学生物学中的一个重要挑战。传统的粘度测量工具，如毛细管粘度计、落球粘度计和旋转粘度计无法应用于活细胞。随着荧光检测技术和成像技术的发展，荧光探针逐渐成为检测细胞内微环境的理想工具。荧光探针具有天然优势，可以很好地指示细胞内粘度的变化。并且，还开发了靶向亚细胞器的荧光探针，用于可视化区分不同细胞器的粘度变化。然而，这些荧光探针仍然存在一些棘手的问题，它们通常通过单光子（op）模式进行检测，这种模式具有短的发射偏移，容易产生自猝灭和测量偏差。相比之下，双光子（tp）染料不仅克服了上述不足，而且具有组织穿透更深、三维分辨率更高，尤其是巨斯托克斯位移更大等优点。据我们所知，目前还没有开发出一种用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针。
4.本发明公开了一种用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针及其制备方法，所述的荧光探针化合物结构如化合物pvs所示。该荧光探针利用吲哚盐和咔唑之间的扭曲分子内电荷转移（tict）机制来实现对粘度的双光子激发响应。同时，与吲哚盐相连的碳碳双键可以通过亲核加成反应，实现对二氧化硫的响应。优势在于，pvs可以同时跟踪二氧化硫和粘度的波动，具有两个容易区分的发射。pvs还可以精确地可视化线粒体形态，成功实现了双光子激发下线粒体中二氧化硫和粘度的实时准确监测。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题：一是提供用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探
针及其制备方法，所述探针化合物对检测二氧化硫和粘度具有灵敏度高、选择性强、检测速度快，低细胞毒性的优点。二是在于提供同时检测二氧化硫和粘度的方法，操作方法简单，效果明显。
6.为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下：本发明提供用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针，具有如下分子结构式：化合物pvs本发明还提供用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针的制备方法，步骤包括：（1）(a)将2,3,3-三甲基-3h-吲哚（1 eq）和碘乙烷（1-1.2 eq）溶于乙腈溶液中，将混合物在80℃下回流搅拌22-26小时，反应结束后冷却至室温，将反应液滴加到冷乙醚中，析出化合物1，过滤后得固体化合物1；（2）(b)将溴乙烷（1 eq）、koh（1-1.1 eq）和ki（0.06-0.08 eq）的混合物溶于乙腈溶液加热至60℃，反应1-2小时后，缓慢加入咔唑，回流10-15小时，冷却至室温后，混合物用二氯甲烷（20 ml
×
3）萃取，柱纯化（石油醚/二氯甲烷）得到固体化合物2；(c)将化合物2（1 eq）溶解在三氟乙酸中，加入六亚甲基四胺（1-1.25 eq）并将溶液回流5-8小时，然后将混合物冷却至室温并用naoh中和（ph 7~8），过滤后得粗产物，柱纯化（石油醚/二氯甲烷）得到固体化合物3；（3）(d)将化合物1（1 eq）和化合物3（1-1.2 eq）溶于无水乙醇中，溶液在氮气下回流10-14小时，旋转蒸发除去溶剂，所得残余物用饱和盐水洗涤（20 ml
×
3），然后用二氯甲烷萃取（20 ml
×
3），柱纯化（二氯甲烷/甲醇）得到产物pvs。
7.本发明的优点:本发明的荧光探针，具有同时对二氧化硫和微环境粘度进行检测的优势。
8.本发明的荧光探针，具有低背景荧光，高响应速率的优势。
9.本发明的荧光探针，稳定性好、灵敏度高、生物相容性好，可对线粒体进行实时原位成像。
10.本发明的荧光探针，对二氧化硫表现出出色的选择性，具有较大的斯托克斯位移。
11.本发明的荧光探针，通过双光子成像可以用作区分正常细胞和病变细胞。
12.因此，本发明是一种非侵入性，可同时对二氧化硫和微环境粘度进行原位、实时监测，且应用范围广泛的检测试剂。在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
14.实施例1用于二氧化硫和粘度双检测的双光子荧光探针的制备方法，步骤包括：1）化合物1的合成：将2,3,3-三甲基-3h-吲哚（0.96 g，6 mmol）和碘乙烷（561 μl，6.6 mmol）溶于乙腈溶液（20 ml）中，将混合物在80℃下回流搅拌22小时，反应结束后冷却至室温，将反应液滴加到冷乙醚中，析出化合物1，过滤后得固体化合物1，产率85％。
15.2）化合物2的合成：将溴乙烷（1.47 g，13.5 mmol）、koh（0.76 g，13.5 mmol）和ki（0.18 g，1.08 mmol）的混合物溶于乙腈溶液（15 ml）加热至60℃，反应1.5小时后，缓慢加入咔唑（1.5 g，9 mmol），回流13小时，冷却至室温后，混合物用二氯甲烷（20 ml
×
3）萃取，柱纯化（石油醚/二氯甲烷=60/1）得到固体化合物2，产率70％。
16.化合物3的合成：将化合物2（0.59 g，3 mmol）溶解在三氟乙酸（15 ml）中，加入六亚甲基四胺（0.5 g，3.6 mmol）并将溶液回流6小时，然后将混合物冷却至室温并用naoh中和（ph 7~8），过滤后得粗产物，柱纯化（石油醚/二氯甲烷=5/1）得到固体化合物3，产率65％。
17.3）化合物pvs的合成：将化合物1（0.11 g，0.6 mmol）和化合物3（0.16 g，0.72 mmol）溶于无水乙醇（15 ml）中，溶液在氮气下回流14小时，旋转蒸发除去溶剂，所得残余物用饱和盐水洗涤（20 ml
×
3），然后用二氯甲烷萃取（20 ml
×
3），柱纯化（二氯甲烷/甲醇=50/1）得到产物pvs，产率45％。
18.实施例2探针pvs对二氧化硫和粘度响应的光谱测定通过将二甲基亚砜(dmso)加入到含有探针的10 ml离心管中，制备储备溶液。将储备溶液稀释到3 ml不同溶剂中得到不同的测试液，每种测试液的终浓度为10 μm。随后采用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪研究了探针检测水相中so2的能力（so
32-作为so2供体）。随着so2（0-100 μm）的加入，探针pvs在475 nm处的紫外吸收峰逐渐减小，并在530 nm处显示出明显的荧光发射峰。并且随着so2浓度的增加，pvs在530 nm的荧光强度增强了42倍，检测限为0.55 μm（lod = 3sb/k），表明了探针对so2具有高灵敏度。随后，在pbs-甘油体系中对pvs的粘度响应进行了测试。随着粘度的增加，探针pvs的tict（扭曲分子内电荷转移）过
程受到有效限制，在690 nm处的荧光强度显著增强。根据forster-hoffmann方程（log (i) = c x log η），log(η)和log(i)之间显示出良好的线性关系（r
2 = 0.9898）。结果表明探针pvs对粘度的变化非常敏感。
19.实施例3探针pvs对高粘度环境中二氧化硫的响应在pbs缓冲溶液（含50%甘油）中用不同浓度的so2对探针pvs进行荧光滴定。结果显示，随着so2浓度的增加，相应的荧光强度在530 nm处逐渐增加。这表明探针pvs在粘性环境中可以灵敏地响应so2。
20.实施例4探针pvs的细胞毒性和线粒体靶向性研究首先，探针的毒性分别在不同的细胞系中进行测试，例如hela、4t1和raw 264.7细胞。当细胞用不同浓度的探针（0、5、10、20和30 μm）处理12小时后，通过标准mtt法测试细胞活力。mtt结果表明，pvs在30 μm浓度下对各种细胞没有明显的细胞毒性，细胞存活率接近90%，因此，探针pvs适用于细胞成像。然后，对探针在细胞中的靶向位置进行了研究。将hela细胞分别与市售的线粒体示踪剂mito red和探针pvs共同培养。成像结果表明，深红色和红色通道的强度图显示出较强的相关性，说明pvs具有优异的线粒体靶向性。因此，探针pvs可以进一步应用于线粒体成像。
21.上述仅为本发明的优选具体实施方式，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。