一种透明质酸的生产方法与流程

1.本发明属于透明质酸发酵生产领域，具体涉及一种透明质酸的生产方法。


背景技术：

2.透明质酸(ha)是由n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和葡萄糖醛酸(glca)为双糖单位重复串联而成的直链酸性黏多糖，广泛存在于高等动物的结缔组织和微生物荚膜中。透明质酸具备优异的保湿性、粘弹性以及润滑作用，可广泛应用于医药、化妆品、美容等多个领域，具有极高的商业价值。
3.透明质酸的制备方法有传统提取法和微生物发酵法。在传统提取法中，透明质酸是从鸡冠、人脐带和牛眼玻璃体中提取得到，此方法提取率较低，成本较高。目前透明质酸的生产主要以微生物发酵法为主，虽然微生物发酵法可以克服传统提取法的缺陷，但是微生物发酵法生产透明质酸还存在产量有待提高的问题。因此，需要开发一种透明质酸的发酵新工艺，以提高透明质酸的发酵产量。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种能够提高透明质酸产量的生产方法。
5.本发明的发明人经过深入和广泛的研究之后发现，在透明质酸发酵过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12～20mmol/l
·
h时补加乙偶姻能够促进透明质酸的合成，所得发酵产物中透明质酸的含量能够得以明显提高。基于此，完成了本发明。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种透明质酸的生产方法，该方法包括在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到12～20mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。
7.在一种优选实施方式中，在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到14～18mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。
8.在一种优选实施方式中，所述乙偶姻的添加比例为透明质酸发酵液的0.1～0.5wt％。
9.在一种优选实施方式中，所述透明质酸的生产菌株为兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)。
10.在一种优选实施方式中，当发酵液中残糖含量≤5g/l时结束发酵。
11.在一种优选实施方式中，所述透明质酸的生产方法包括以下步骤：
12.(1)菌种活化：在无菌条件下，将透明质酸生产菌株划线于平板培养基中，在温度32～38℃下培养18～24h；
13.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入摇瓶培养基，然后放置于摇床中，在温度32～38℃、转速160～220rpm条件下培养8～18h，得到种子培养液；任选地，将所得种子培养液以0.5～5％接种量接入装有摇瓶培养基的种子罐中并在温度32～38℃、通气比0.3～1vvm、转速150～300rpm、罐压0.03～0.05mpa条件下培养5～10h，得到种子
液；
14.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液或种子液以1～10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在温度32～38℃、通气比0.5～1.5vvm、转速80～300rpm、罐压0.04～0.06mpa和ph 6.5～8.0条件下进行发酵培养，当发酵液中氧消耗速率首次达到预定值时，往发酵液中添加乙偶姻，继续培养，当发酵液中残糖含量≤5g/l时结束发酵。
15.在一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述平板培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
16.在一种优选实施方式中，步骤(2)中，所述摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
17.在一种优选实施方式中，步骤(3)中，所述发酵培养基的ph值为6.5～7.5，且每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖60～80g、蛋白胨5～15g、酵母浸膏2～6g、谷氨酸钠0.5～2g、磷酸二氢钾0.1～1g、硫酸镁0.1～1g、泡敌0.1～1g。
18.在一种优选实施方式中，所述发酵培养所采用的发酵罐容积为30l～100m3。
19.采用本发明提供的方法制备透明质酸，所得发酵产物中透明质酸的含量能够得以明显提高。
具体实施方式
20.本发明在透明质酸的发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次达到12～20mmol/l
·
h(如12、13、14、15、16、17、18、19、20mmol/l
·
h)时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。优选地，在发酵培养过程中，当透明质酸发酵液中氧消耗速率首次达到14～18mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加乙偶姻。本发明中，所述氧消耗速率(our)通过质谱分析仪检测发酵尾气测得。本发明通过在发酵过程中当our首次达到12～20mmol/l
·
h、优选达到14～18mmol/l
·
h时添加乙偶姻，能够促进透明质酸的合成，提高发酵产物中透明质酸的含量。此外，所述乙偶姻的添加比例优选为透明质酸发酵液的0.1～0.5wt％，如0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％等。
21.本发明的主要改进之处在于在发酵培养过程中添加乙偶姻，而透明质酸生产菌株的具体种类及获取方式、各阶段的培养条件等均可以为本领域的常规选择，例如，所述透明质酸的生产菌株可以为兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)。
22.在本发明中，一般地，当发酵液中残糖含量≤5g/l时结束发酵。
23.本发明的一些具体实施方式中，所述透明质酸的生产方法包括以下步骤：
24.(1)菌种活化：在无菌条件下，将透明质酸生产菌株划线于平板培养基中，在温度32～38℃下培养18～24h；
25.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入摇瓶培养基，然后放置于摇床中，在温度32～38℃、转速160～220rpm条件下培养8～18h，得到种子培养液；任选地，将所得种子培养液以0.5～5％接种量接入装有摇瓶培养基的种子罐中并在温度32～38℃、通气比0.3～1vvm、转速150～300rpm、罐压0.03～0.05mpa条件下培养5～10h，得到种子液；
26.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液或种子液以1～10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，在温度32～38℃、通气比0.5～1.5vvm、转速80～300rpm、罐压0.04～0.06mpa和ph 6.5～8.0条件下进行发酵培养，当发酵液中氧消耗速率首次达到预定值时，
往发酵液中添加乙偶姻，继续培养，当发酵液中残糖含量≤5g/l时结束发酵。
27.本发明对于平板培养基、摇瓶培养基、发酵培养基的种类均没有特别的限定，可以为现有的各种适合菌体各个阶段生长的培养基。例如，所述平板培养基和摇瓶培养基均可以各自独立地为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。在一种优选实施方式中，所述发酵培养基的ph值为6.5～7.5，且每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖60～80g、蛋白胨5～15g、酵母浸膏2～6g、谷氨酸钠0.5～2g、磷酸二氢钾0.1～1g、硫酸镁0.1～1g、泡敌0.1～1g。此外，在发酵培养过程中用于调节ph值的试剂具体可以选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。此外，所述发酵培养所用的发酵罐容积可以为30l～100m3。
28.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
29.以下实施例和对比例中使用兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus，菌种编号：atcc39920)作为生产菌株来进一步阐述发酵透明质酸的生产方法。
30.以下实施例和对比例中涉及的相关设备包括：50l发酵罐、1m3发酵罐、15m3发酵罐和100m3发酵罐。
31.以下实施例和对比例中：
32.(1)氧消耗速率(our)通过质谱分析仪检测发酵尾气得到；
33.(2)透明质酸含量采用bitter-muir的咔唑法进行测定；
34.(3)发酵液中残糖含量通过西尔曼生物传感分析仪进行测定。
35.实施例1：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
36.(1)菌种活化：在无菌条件下，将兽疫链球菌种子冻存液划线于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，在温度35℃下培养22h；
37.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2l摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液；
38.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至12mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。其中，每升发酵培养基中含有如下组分：葡萄糖70g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、谷氨酸钠1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.5g、泡敌0.5g，使用氢氧化钠溶液调节ph值至7.0。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.8g/l。
39.实施例2：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
40.(1)菌种活化：同实施例1；
41.(2)种子培养：同实施例1；
42.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，
发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至14mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基中的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.0g/l。
43.实施例3：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
44.(1)菌种活化：同实施例1；
45.(2)种子培养：同实施例1；
46.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至18mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基中的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.7g/l。
47.实施例4：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
48.(1)菌种活化：同实施例1；
49.(2)种子培养：同实施例1；
50.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至20mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。其中，每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.3g/l。
51.实施例5：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
52.(1)菌种活化：同实施例1；
53.(2)种子培养：同实施例1；
54.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.1wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为12.9g/l。
55.实施例6：一种透明质酸的生产方法，发酵使用50l发酵罐，包括如下步骤：
56.(1)菌种活化：同实施例1；
57.(2)种子培养：同实施例1；
58.(3)发酵培养：将培养好的种子培养液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐
中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在200～300rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.5wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.7g/l。
59.实施例7：一种透明质酸的生产方法，发酵使用1m3发酵罐，包括如下步骤：
60.(1)菌种活化：同实施例1；
61.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的500ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入50l装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05mpa和通气比0.8vvm条件下培养6h，得到扩培种子液；
62.(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在1.0～1.5vvm，转速控制在150～200rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为14.3g/l。
63.实施例8：一种透明质酸的生产方法，发酵使用15m3发酵罐，包括如下步骤：
64.(1)菌种活化：同实施例1；
65.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2000ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入1m3装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05mpa和通气比0.6vvm条件下培养6h，得到扩培种子液；
66.(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在0.8～1.2vvm，转速控制在100～150rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
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h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为14.0g/l。
67.实施例9：一种透明质酸的生产方法，发酵使用100m3发酵罐，包括如下步骤：
68.(1)菌种活化：同实施例1；
69.(2)种子培养：从培养好的平板培养基上挑取单菌落，接入装有牛肉膏蛋白胨培养基的2000ml摇瓶内，然后放置于摇床中，在温度35℃、转速200rpm条件下培养12h，得到种子培养液。将所述种子培养液以0.5％接种量接入500l装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速200rpm、罐压0.05mpa和通气比0.8vvm条件下培养6h，得到一级扩培种子液，培养好后以1％接种量接入5m3装有牛肉膏蛋白胨培养基的种子罐中，在温度35℃、转速
150rpm、罐压0.05mpa和通气比0.5vvm条件下培养5h，得到二级扩培种子液；
70.(3)发酵培养：将培养好的种子液以5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为35℃，发酵全程使用氢氧化钠溶液控制ph值在6.6～7.6，发酵全程监测发酵液的our数值，发酵过程中通气比控制在0.6～1.0vvm，转速控制在80～120rpm，罐压控制在0.04～0.05mpa。当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时，往透明质酸发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，继续培养至残糖≤5g/l时放罐。每升发酵培养基的组分同实施例1。当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为13.4g/l。
71.实施例10
72.按照实施例5的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时往发酵液中添加比例为0.05wt％的乙偶姻，其他条件同实施例5，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.3g/l。
73.实施例11
74.按照实施例6的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至16mmol/l
·
h时往发酵液中添加比例为0.55wt％的乙偶姻，其他条件同实施例6，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.5g/l。
75.对比例1
76.按照实施例1的方法制备透明质酸，不同的是，发酵培养过程中不添加乙偶姻，其他条件同实施例1，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为9.5g/l。
77.对比例2
78.按照实施例1的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至10mmol/l
·
h时往发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，其他条件同实施例1，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为11.0g/l。
79.对比例3
80.按照实施例4的方法制备透明质酸，不同的是，当透明质酸发酵液中氧消耗速率(our)首次至22mmol/l
·
h时往发酵液中添加比例为0.3wt％的乙偶姻，其他条件同实施例4，当发酵培养周期达到20h时，发酵液中残糖≤5g/l，停止发酵，发酵液中透明质酸含量为10.9g/l。
81.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。