类似间充质干细胞的制备方法及由此制备的类似间充质干细胞与流程

1.本发明涉及一种从人多能干细胞制备类似间充质干细胞的方法以及通过所述制备方法来制备的类似间充质干细胞。具体地，使用在建立多能细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞(human pluripotent stem cell)来在将其分化诱导的各种形式的胚状体中选择囊性(cystic)胚状体，并通过将囊性胚状体装载到细胞渗透性的三维培养插入物(3d culture unit)上来分离类似间充质干细胞，在所述分离的类似间充质干细胞中仅分离单层(monolayer)形式的细胞群体，并将单层形式的细胞群体均匀化，由此制备类似间充质干细胞。通过上述方法制备的高纯度的类似间充质干细胞具有抗炎功效及免疫抑制特性，并且cd90及sox2表达为95％以上。此外，本发明涉及通过所述制备方法来制备的类似间充质干细胞、包括所述类似间充质干细胞的治疗组合物或递送体及包括从所述类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体的用于预防或治疗疾病的治疗组合物或化妆品组合物。


背景技术：

2.间充质是指一种中胚层组织，该组织属于胚胎发育过程中发生的上皮间质过渡(emt，epithelial to mesenchyme transition)而形成的中间层。人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞是唯一能够解释这种早期体外发育的细胞。由于人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞具有多能性(pluripotency)，因此可以作为具有多种功能的细胞来源。
3.目前，除了成体来源的间充质干细胞外，有关人多能干细胞来源的间充质干细胞或间充质祖细胞的研究也正在积极进行。当人们第一次知道在骨髓中能够形成骨的祖细胞(如间充质干细胞)存在于成体之后，据悉，间充质干细胞可以从骨髓、致密骨、外周血、脂肪组织及脐血和羊膜等胎儿组织中分离。
4.这些成体来源的间充质干细胞具有多种特性，可用于细胞治疗。因此，在实际临床治疗中，这些成体来源的间充质干细胞从骨、软骨和肌腱等骨骼肌系统和心肌梗死和血管损伤疾病等心血管系统，已延伸到急慢性肺损伤等呼吸系统、多发性硬化症、狼疮及类风湿性关节炎等自身免疫系统及肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、帕金森病、脊髓损伤等神经系统治疗。即，人们在各个领域尝试细胞治疗。
5.然而，与胚胎干细胞不同，普通成体间充质干细胞在体外长时间传代时表现出有限制的增殖能力，因此一个细胞的分裂能力不超过40次。在实际细胞治疗应用中，人们只使用第7传代以下的间充质干细胞。此外，由于没有成熟的细胞谱系，因此需要从成体上重复制备细胞，这对研究起到一定的限制。
6.为了克服这些局限性，人们正在进行从人多能干细胞中分离培养间充质干细胞(msc，mesenchymal stem cell)或间充质祖细胞(mesenchymal progenitor)的研究。作为从先前已知的人多能干细胞中获得间充质干细胞或祖细胞的方法，人们通常采用的方法有：通过流式细胞分析仪(facs，fluorescent activated cell sorter)来分离代表所需标记物的细胞；处理大量的及各种的细胞因子(cytokines)和化学物质(chemicals)，以诱导
分化。
7.然而，由于使用流式细胞分析仪的方法需要使用激光，因此存在以下问题：降低细胞存活率；还由于分离后获得的细胞数量少，从而增加培养周期。治疗细胞因子和化学物质的方法在持续高治疗成本和分化增殖后的遗传稳定性方面存在问题。另外，也难以有效地控制胚胎干细胞的多能性。
8.另外，由于间充质干细胞的分离和增殖方法多种多样，且对间充质干细胞的定性方法因组织和细胞来源的不同而不同，因此国际干细胞治疗学会(isct，international society for cell therapy)提出了定义人间充质干细胞的三个标准。第一、当在标准培养条件下保持人间充质干细胞时，必须具有塑料粘附特性(adherent)。第二、在分析人间充质干细胞的表面抗原时，cd90、cd44、cd73及cd105的表达率均为95％以上，而cd45、cd34、cd14及cd19的表达率均为2％以下，而未分化的调节标记物oct3/4、tra-1-60、tra-1-81及免疫排斥抗原hla-dr不应表达。第三、人间充质干细胞必须在体外分化为成骨细胞(osteogenic cell)、脂肪细胞(adipogenic cell)及软骨细胞(chondrogenic cell)。
9.cd90(cluster of differentiation 90)是间充质干细胞的代表性标志物，是与间充质干细胞的免疫调节有关的重要因素。表达cd90的间充质干细胞可以上调shla-g和il-10，从而抑制由植物血凝素(pha，phytohemagglutinin)激活的外周血单个核细胞(pbmcs，peripheral blood mononuclear cells)的增殖。hla-g(人类白细胞抗原g，human leukocyte antigen g)是以细胞膜结合物(hla-g1、-g2、-g3、-g4)和水溶性形式(shla-g5、-g6和g7)存在的非经典mhcⅰ类基因。然而，据悉，对nk细胞、cd81 t细胞的细胞毒性和cd41 t细胞活性起到影响的固有(innate)和适应性(adaptative)细胞反应，它具有免疫耐受功能(tolerogenic functions)。目前，hla-g被认为是一种在免疫耐受中起重要作用的分子。此外，hla-g通过调节细胞因子分泌，具有将单个核细胞转化为th2(t辅助型2)细胞因子谱的功能。转化为th2细胞因子谱与抑制免疫功能有关。il-10是th2细胞因子之一，具有抗炎、免疫抑制等多种生物学功能。据悉，il-10诱导hla-g的表达，而hla-g也刺激il-10的表达。
10.sox2(性别决定区y-box 2)是人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的重要转录因子，在维持细胞多能性中起着重要作用。由于sox2在一些成体干细胞中表达，通过调节作为wnt信号可溶性抑制剂的dkk1和cmyc，对细胞的分化和增殖起到重要作用，因此在人多能干细胞中表达的sox2和在间充质干细胞中表达的sox2的功能被认为具有不同的功能。
11.目前，得益于细胞的免疫抑制和耐受等特性，干细胞治疗在生物学或临床上的应用越来越广泛。本发明的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞具有以下特征：表达95％以上的cd90和sox2，而这一点迄今尚未公开。这不仅满足了相关研究领域的兴趣，而且从临床领域的角度来看，也有着足够的意义。
12.因此有必要开发一种间充质干细胞的制备方法，其可以通过提高细胞存活率来产生高纯度的类似间充质干细胞，有效地控制人多能干细胞，并维持所制备的类似间充质干细胞的遗传稳定性。


技术实现要素：

13.要解决的技术问题
14.本发明涉及一种类似间充质干细胞的制备方法，其满足由世界干细胞治疗协会定义的作为人间充质干细胞的最低标准。本发明涉及一种类似间充质干细胞的制备方法及通过所述制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞，其中，所述方法包括以下步骤：(a)制备在建立细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞；(b)从诱导分化所述人多能干细胞的胚状体中选择囊性胚状体；(c)通过将所述囊性胚状体装载到细胞渗透性的三维培养插入物上来分离类似间充质干细胞；(d)在通过所述细胞渗透性的三维培养插入物的细胞中仅分离单层(monolayer)形式的细胞群体；以及(e)通过将所述单层形式的细胞群体在水平和垂直方向上均匀化至100μm至500μm的大小来培养类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞具有抗炎功效及免疫抑制特性，并且cd90及sox2表达为95％以上。
15.然而，本发明要解决的问题并非受限于上述言及的问题，未言及的其他问题能够通过以下记载由本领域普通技术人员所明确理解。
16.发明的效果
17.根据本发明的类似间充质干细胞的制备方法，可以高效、高纯度地分离、培养及增殖类似间充质干细胞。另外，在根据本发明的类似间充质干细胞制备方法的情况下，可以从人多能干细胞获得具有抗炎和免疫抑制特性且表达cd90和sox295％以上的新的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞。
18.根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞可以表现出抗炎功效和免疫抑制作用。
19.根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞可以表现出根据特定标记模式的抗炎功效和免疫抑制作用。
20.根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞中cd90及sox2可以表达95％以上，并可以同时表现出作为人间充质干细胞的最低标准和附加特性。
21.可以适用为包括根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞的治疗剂组合物或递送体。
22.从根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞的分泌的有效成分或外泌体可以适用为用于预防或治疗疾病的组合物或化妆品组合物。
23.然而，本发明的效果并不限于上述效果，并且应当理解为包括可以从本发明的详细描述或权利要求中描述的本发明的配置推导出的所有效果。
附图说明
24.图1为显示根据本发明一实施例的人多能干细胞(human pluripotent stem cell)来源的类似间充质干细胞的制备方法的附图。
25.图2示出在制备根据本发明一实施例的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞时，从人多能干细胞诱导分化的各种形式的胚状体中选择的囊性(cystic)胚状体形式。白色箭头所示的胚状体是囊性胚状体。在图2所示的囊性胚状体中，囊性(cystic)胚状体是指在各种形式的胚状体中含有透明明亮的部分的胚状体。
26.图3为显示根据本发明一实施例的用于分离人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的细胞渗透性的三维培养插入物(3d culture unit)的附图。可以通过将囊性胚状体装载在所述细胞渗透性的三维培养插入物上来分离类似间充质干细胞。通过使用所述细胞渗
透性的三维培养插入物，可以从选定的囊性胚状体中高纯度地分离出类似间充质干细胞。
27.图4为显示根据本发明一实施例的通过细胞渗透性的三维培养插入物并初始分离的类似间充质干细胞群体的图像。另外，该曲线图为在每个群体的初始分离后通过附着至培养皿(p0)上对细胞表面抗原表达的比较测量。通过细胞渗透性的三维培养插入物并初始分离的类似间充质干细胞的群体可以包括多层(multilayer)形式或单层(monolayer)形式中的任一种以上的形式。然而，在本发明的一实施例中，仅分离并培养单层形式的细胞群体。
28.图5为拍摄根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的形状的图像。
29.图6为测量根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的各种表面抗原表达的曲线图。根据本发明的类似间充质干细胞高表达cd90为98.2％、cd44为98.8％、cd73为96.77％及cd105为95.6％。根据本发明的类似间充质干细胞低表达cd45为0.15％、cd34为1.46％、cd14为0.17％及cd19为0.09％，并低表达oct3/4为0.2％、tra-1-60为0.08％、tra-1-81为0.03％。根据本发明的类似间充质干细胞表达hla-dr为0.08％，几乎不表达。因此，根据本发明的类似间充质干细胞是满足由世界干细胞治疗协会定义的作为人间充质干细胞的最低标准的新的间充质干细胞。根据本发明的类似间充质干细胞高表达cd90的同时表达sox2为99.37％。
30.图7为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞分化(differentiation)为脂肪细胞(adipogenic cell)、骨原细胞(osteogenic cell)、软骨细胞(chondrogenic cell)及肌原细胞(myogenic cell)的特征，并通过油红o(oil red o)染色法、茜素红s(alizarin red s)染色法、阿尔新蓝(alcian blue)染色法及免疫细胞化学(immunocytochemistry)染色法来进行染色的图像。
31.图8为与骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc，bone marrow mesenchymal stem cells)的增殖能力及细胞大小相比，显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的增殖能力(cpdl，cumulative pdl)和细胞大小(cell size)的曲线图。
32.图9为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞以高纯度被分离的曲线图。可以确认到类似间充质干细胞(mmsc)，其oct4作为未分化的调节标记物已被去除99％以上。
33.图10a及图10b为显示根据本发明一实施例的通过gtg-显带(banding)和单核苷酸多态性(snp，single nucleotide polymorphisms)分析来确认类似间充质干细胞的遗传稳定性的附图。
34.图11为与骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)相比，确认根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的基于细胞迁移程度的组织再生能力的曲线图及图像。
35.图12为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞(huvec，human umbilical vein endothelial cell)共培养的物质交换能力的附图。
36.图13为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的直接血管生成能力的附图。
37.图14为比较根据本发明一实施例的类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)的免疫抑制能力及抗炎功效的曲线图。
38.图15为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞(bm-msc)的细胞存活、组织
再生及分泌抑制细胞凋亡的功能性物质的能力的曲线图。
39.图16为根据本发明一实施例的显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)高表达的类似间充质干细胞的炎症调节相关基因的附图。
40.图17为根据本发明一实施例的显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)高表达的类似间充质干细胞的免疫抑制相关基因的附图。
41.图18为根据本发明一实施例的通过分析类似间充质干细胞的细胞溶解物(cell lysate)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)高表达的蛋白质组的附图。
42.图19为根据本发明一实施例的通过分析类似间充质干细胞的细胞溶解物(cell lysate)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)低表达的蛋白质组的附图。
43.图20为根据本发明一实施例的通过分析类似间充质干细胞的培养上清液(culture supernatant)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)高表达的蛋白质组的附图。
44.图21为根据本发明一实施例的通过分析类似间充质干细胞的培养上清液(culture supernatant)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc)低表达的蛋白质组的附图。
45.图22为显示当人胚胎干细胞(hesc)的传代培养次数超过70次(p68 7或p68 15)时的类似间充质干细胞的表面抗原的表达减少的附图。尤其，当人胚胎干细胞的传代培养次数超过70次时，类似间充质干细胞的表面抗原cd90的表达显著降低。
46.图23为显示从根据人胚胎干细胞(hesc)的传代培养次数(a(p68)、b(p68 7)、c(p68 15))分离的类似间充质干细胞分化诱导的脂肪细胞和骨原细胞的基因表达的pcr电泳结果的附图。
具体实施方式
47.以下，参照附图对本发明的实施例进行详细说明。可以对以下实施例进行多种变更，因此本技术的权利范围并非受到以下实施例的限制或限定。对所有实施例的全部更改、其等同物乃至其替代物均包括在权利要求范围。
48.实施利中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定实施例。在内容中没有特别说明的情况下，单数表达包括复数含义。在本说明书中，“包括”或者“具有”等术语用于表达存在说明书中所记载的特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，并不排除还具有一个或以上的其他特征、数字、步骤、操作、构成要素、配件或其组合，或者附加功能。
49.在没有其他定义的情况下，包括技术或者科学术语在内的在此使用的全部术语，都具有本领域普通技术人员所理解的通常的含义。通常使用的与词典定义相同的术语，应理解为与相关技术的通常的内容相一致的含义，在本技术中没有明确言及的情况下，不能过度理想化或解释为形式上的含义。
50.并且，在参照附图进行说明的过程中，与附图标记无关，相同的构成要素赋予相同的附图标记，并省略对此的重复的说明。在说明实施例的过程中，当判断对于相关公知技术的具体说明会不必要地混淆实施例时，省略对其详细说明。
51.并且，在对实施例的构成要素进行说明时，可以使用第一、第二、a、b、(a)、(b)等术语。然而，上述术语的使用仅作为将该构成要素区别于其他构成要素，并非用于限定相应构
成要素的本质、排列或顺序。
52.与任何一个实施例中的构成要素具有相同功能的构成要素在其他实施例中使用相同的名称进行说明。在未言及反例时，记录在任何一个实施例的说明能够适用于其他实施例，由此，在重复范围内省略具体说明。
53.根据本发明的一实施例，提供一种类似间充质干细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备在建立细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞；(b)从诱导分化所述人多能干细胞的胚状体中选择囊性胚状体；(c)通过将所述囊性胚状体装载到细胞渗透性的三维培养插入物上来分离类似间充质干细胞；(d)在通过所述细胞渗透性的三维培养插入物的细胞中仅分离单层形式的细胞群体；以及(e)通过将所述单层形式的细胞群体在水平和垂直方向上均匀化至100μm至500μm的大小来培养类似间充质干细胞，并且，所述类似间充质干细胞具有抗炎功效及免疫抑制特性，并且cd90及sox2表达为95％以上。
54.根据一侧，所述细胞渗透性的三维培养插入物可以由尼龙、纤维、聚乙烯、聚丙烯、石墨烯、钛、铜、镍、银、金及铂组成的群组中的任何一种以上组成。
55.根据本发明的另一实施例，提供一种根据类似间充质干细胞的制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞比骨髓来源的间充质干细胞高表达mmp-1蛋白质及hgf蛋白质，比骨髓来源的间充质干细胞低表达cd95，并且cd90及sox2表达为95％以上。
56.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞表达的所述mmp-1蛋白质比骨髓来源的间充质干细胞高15倍以上，表达的hgf蛋白质比骨髓来源的间充质干细胞高2倍以上。
57.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞表达的cd95比骨髓来源的间充质干细胞低15倍以上。
58.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞表达的炎症调节基因比骨髓来源的间充质干细胞高2倍至100倍以上，并且，所述炎症调节基因是由gata3、adora2a、gps2、psma1、pbk、lrfn5、cdh5、apoe、foxf1、tek、cx3cl1、ptger4、acp5、bcr、socs5及mdk组成的群组中的任一种以上。
59.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞同时表达gata3、adora2a及gps2基因。
60.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞表达的免疫抑制基因比骨髓来源的间充质干细胞高2倍至100倍以上，并且，所述免疫抑制基因是gata3、gps2、psma1、apoe、foxf1、tek、cx3cl1、ptger4、bcr、socs5及mdk中的任一种以上。
61.根据一侧，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞同时表达gata3、gps2及psma1基因。
62.根据本发明的又另一实施例，提供一种包括根据类似间充质干细胞的制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的治疗组合物，所述治疗组合物是细胞治疗组合物、细胞基因治疗组合物、组织工程治疗组合物、抗炎治疗组合物、免疫治疗组合物及用于预防或治疗癌症的组合物中的任一种。
63.根据一侧，提供一种治疗组合物，所述治疗组合物还包括从所述类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。
64.根据一侧，提供一种治疗组合物，所述治疗组合物用于预防或治疗由多发性硬化症、全身性硬化症、急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、慢性肺病、急性肺病、克罗恩病、大便失禁、移植物抗宿主病、下肢缺血病、伯杰氏病、足部溃疡、狼疮、类风湿关节炎、急慢性肾盂炎、炎性膀胱炎、间质性膀胱炎、膀胱活动低下症、膀胱过度活动症、冻结肩、肩袖损伤及破裂、各种运动引起的肌肉骨骼系统损伤、膝关节软骨损伤、耳鸣、特应性皮炎、牛皮癣、烧伤引起的皮肤损伤、紫外线等引起的皮肤损伤、预防包括视网膜病变的炎症和免疫系统疾病、缺血性痴呆、阿尔茨海默氏症、脊髓损伤、帕金森氏症及中枢神经系统疾病组成的群组中的任一种以上的疾病。
65.根据本发明的又另一实施例，提供一种包括根据类似间充质干细胞的制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的递送体，所述递送体负载药物组合物。
66.根据本发明的又另一实施例，提供一种用于预防或治疗疾病的组合物，其包括从根据类似间充质干细胞的制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。
67.根据一侧，所述疾病可以是由多发性硬化症、全身性硬化症、急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、慢性肺病、急性肺病、克罗恩病、大便失禁、移植物抗宿主病、下肢缺血病、伯杰氏病、足部溃疡、狼疮、类风湿关节炎、急慢性肾盂炎、炎性膀胱炎、间质性膀胱炎、膀胱活动低下症、膀胱过度活动症、冻结肩、肩袖损伤及破裂、各种运动引起的肌肉骨骼系统损伤、膝关节软骨损伤、耳鸣、特应性皮炎、牛皮癣、烧伤引起的皮肤损伤、紫外线等引起的皮肤损伤、预防包括视网膜病变的炎症和免疫系统疾病、缺血性痴呆、阿尔茨海默氏症、脊髓损伤、帕金森氏症及中枢神经系统疾病组成的群组中的任一种以上。
68.根据本发明的又另一实施例，提供一种化妆品组合物，其包括从根据类似间充质干细胞的制备方法来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。
69.具有增强抗炎功效和免疫抑制作用的类似间充质干细胞的制备
70.图1示出根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：(a)制备在建立细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞；(b)从诱导分化所述人多能干细胞的胚状体中选择囊性胚状体；(c)通过将所述囊性胚状体装载到细胞渗透性的三维培养插入物上来分离类似间充质干细胞；(d)在通过所述细胞渗透性的三维培养插入物的细胞中仅分离单层形式的细胞群体；以及(e)通过将所述单层形式的细胞群体在水平和垂直方向上均匀化至100μm至500μm的大小来培养类似间充质干细胞，其中，所述类似间充质干细胞具有抗炎功效及免疫抑制特性，并且cd90及sox2表达为95％以上。
71.图1的第一个图像显示培养(culture)和维持(maintenance)人类多能干细胞(human pluripotent stem cell)的步骤。所述人多能干细胞是在建立细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞。图1的第二个图像显示形成胚状体(eb，embryoid body)后，选择囊性(cystic)胚状体的步骤及通过将所选的囊性胚状体使用细胞渗透性的三维培养插入物(3d culture unit)来进行分化的步骤。将所选的囊性胚状体通过装载到细胞渗透性的三维培养插入物上，从而使其通过细胞渗透性的三维培养插入物。图1的第三个图像显示囊性胚状体通过细胞渗透性的三维培养插入物，并移动到细胞渗透性的三维培养插入物的下侧面。图1的第四个图像显示采集已通过细胞渗透性的三维培养插入物的细胞数目的步骤及
均匀化群体的大小的步骤。在从所采集的细胞群体中，机械(mechanically)地移除多层(multilayer)形式的群体(cluster)，并使用微移液管(pipette tip)仅将单层(monolayer)形式的群体切割成均匀的大小来进行选择性的培养。图1的第五个图像显示建立表达cd90 及sox2 的类似间充质干细胞。
72.本文所使用的术语“人多能干细胞”是指作为未分化状态的细胞，可以分化为构成人体的所有细胞的干细胞。所述人多能干细胞可以是人胚胎干细胞(hesc，human embryonic stem cell)、通过体细胞核移植的人多能干细胞(scnt-hpsc，human pluripotent stemcells via somatic cell nuclear transfer)及诱导多能干细胞(ipsc，induced pluripotent stem cell)中的任一种以上。
73.本文所使用的术语“人胚胎干细胞类似间充质干细胞”是指能够分化为包括骨、软骨、脂肪和肌肉细胞的各种细胞的多潜能间充质干细胞(mmsc，multipotent mesenchymal stemcell)。换言之，“类似间充质干细胞”是指具有与存在于由受精卵分裂产生的中胚层分化的骨髓基质、软骨、骨组织和脂肪组织中的间充质干细胞(mscs，mesenchymal stem cells)的功能相似的细胞。即本发明的类似间充质干细胞是指通过高表达cd90及ox2等来提高免疫抑制能力、抗炎功效或多潜能维持能力等的新型间充质干细胞。因此，在本说明书中，分别使用类似间充质干细胞和间充质干细胞来进行区分。
74.在本说明书中，n传代或传代n(传代(passage)n或pn)表示母细胞株传代培养n次。例如，70传代或p70是指将母细胞株传代70次而获得的细胞株。所述n是整数。
75.用于制备本发明的类似间充质干细胞的人多能干细胞的特征在于，使用在建立人多能干细胞株后传代培养70次以下的人多能干细胞。通常，在使用人多能干细胞来制备间充质干细胞的过程中，人多能干细胞的使用不受传代限制。当人多能干细胞不受传代限制的情况下，所制备的间充质干细胞表面抗原大部分表达不均且低表达，分化效率也很低。并且，所制备的间充质干细胞无法表达cd90或sox2为95％以上。然而，在使用如本发明的70传代以下的人多能干细胞的情况下，所制备的类似间充质干细胞的所有表面抗原以一定的比率高表达95％以上。尤其，可以制备出表达cd90及sox2为95％以上的类似间充质干细胞。参见图22，当人多能干细胞(如，人胚胎干细胞(hesc))的传代培养次数超过70(p68 7或p68 15)时，在类似间充质干细胞的表面抗原中cd90的表达量迅速降低。即，基于68传代，随着传代培养次数越增加，cd90的表达降低到25％以下，并且cd44、cd73及cd105的表达降低到90％以下。另外，当人多能干细胞传代培养次数超过70(p68 7或p68 15)时，类似间充质干细胞表达cd44、cd73及cd105不规则。相反地，从传代培养不超过70次的人多能干细胞制备的类似间充质干细胞高表达cd90为98.2％、cd44为98.8％、cd73为96.77％及cd105为95.6％(参见图6)。参照图23，a、b、c分别表示p68、p68 7、p68 15，是从人多能干细胞(如，人胚胎干细胞(hesc))被分离的间充质干细胞分化诱导的脂肪细胞及骨原细胞的基因表达的pcr电泳结果。如图23所示，在传代培养次数为70以下的a(p68)中，具有优越的向脂肪细胞(adepogenic)及骨原细胞(osteogenic)的分化能力。相反地，在传代培养次数超过70次的b(p68 7)和c(p68 15)中，向脂肪细胞及软骨细胞的分化效率会降低。即，与骨髓来源的间充质干细胞相比，使用70传代以下的人多能干细胞来制备的类似间充质干细胞可以更优越地维持增殖能力、分化能力、遗传稳定性、组织再生能力、物质交换能力、血管生成能力、免疫抑制能力及抗炎功效等。此外，与骨髓来源的间充质干细胞相比，使用70传代以下的人多能
干细胞来制备的类似间充质干细胞能够维持优越的细胞存活、组织再生及分泌抑制细胞凋亡的功能性物质。
76.优选地，可以制备出一种类似间充质干细胞，其在使用70传代以下的人多能干细胞并通过细胞渗透性的三维培养插入物的被分化的细胞群体中，通过去除多层(multilayer)形式的群体并仅选择单层(monolayer)形式的群体，并以一定的大小进行机械均匀化及培养来表达间充质干细胞的表面抗原。尤其，在间充质干细胞的表面抗原中，各表达cd90及sox2为95％以上。
77.图2示出在制备根据本发明一实施例的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞时，从人多能干细胞诱导分化的各种形式的胚状体中选择的囊性(cystic)胚状体形式。白色箭头所示的胚状体是囊性胚状体。在图2所示的囊性胚状体中，囊性(cystic)胚状体是指在各种形式的胚状体中含有透明明亮的部分的胚状体。
78.图3示出细胞渗透性的三维培养插入物，其通过装载从分化诱导人多能干细胞的胚状体中所选的囊性胚状体来用于分离类似间充质干细胞。
79.本文所使用的术语“细胞渗透性的三维培养插入物”是指细胞渗透性装置。即是指一种装置，其当从胚胎干细胞、诱导多能干细胞或体细胞核替代干细胞来源的类胚体诱导分化培养为类似间充质干细胞时，允许自然地发生在胚胎发育过程中产生的上皮-间质转化(emt，epithelial-mesenchymal transition)。即，可以使用细胞渗透性的三维培养插入物来高纯度、高效地分离类似间充质干细胞，并将其进行培养及增殖。
80.所述细胞渗透性的三维培养插入物是保证细胞渗透性的人工插入物，如用于细胞培养的培养板、用于三维细胞培养的插入物(insert)或尼龙或纤维材料制成的网(mesh)等。所述细胞渗透性的三维培养插入物可以由尼龙、纤维、聚乙烯、聚丙烯、石墨烯、钛、铜、镍、银、金、铂中的任何一种以上组成。然而，只要可以保证细胞的渗透性，所述细胞渗透性的三维培养插入物并不局限于上述材料。
81.此外，作为使用所述细胞渗透性的三维培养插入物的人多能干细胞来源的胚状体的培养基，可以使用egm2-mv、mcdb、dmem、mem-α、stempro-msc、mesocult-msc培养基。优选地，培养基可以是egm2-mv、mcdb、dmem或mem-α培养基，但并不限于此。在使用所述细胞渗透性的三维培养插入物的人多能干细胞来源的胚状体的培养基中，可以包括从由胎牛血清(fbs，fetal bovine serum)、血清替代物(sr，serum replacement)、人血清(human serum)及人血小板裂解物(hpl，human platelet lysate)组成的群组中选择的一种以上的添加物。具体地，所述添加物可以是1～20％的fbs、1～20％的sr、1～20％的人血清或1～20％的hpl。优选地，所述添加物可以是5％fbs或2.5％～5％hpl，但并不限于此。
82.图4为显示在分离人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的步骤中，通过细胞渗透性的三维培养插入物并从细胞渗透性的三维培养插入物下方采集的每个细胞群体的特征的图像及曲线图。如图4所示，从细胞渗透性的三维培养插入物下方采集的细胞群体可以是多层(multilayer)形式的群体或单层(monolayer)形式的群体。通过同时培养多层和单层形式的细胞群体，或分别培养多层和单层形式的细胞群体，可以确认到在仅分离出单层形式的群体的培养细胞中，持续地高表达代表间充质干细胞的主要表面抗原cd90、cd73及cd105。
83.图5为拍摄根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的形状的图像。
84.图6为测量根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的表面抗原表达的曲线图。参照图6，类似间充质干细胞的表面抗原中cd90、cd44、cd73、cd105及sox2表达为95％以上。与此相反，类似间充质干细胞的表面抗原中cd45、cd34、cd14及cd19表达为2％以下。并且，未分化的调节标记物oct3/4、tra-1-60、tra-1-81和免疫排斥抗原hla-dr均未表达。因此，本发明的类似间充质干细胞可以高表达与免疫调节有关的标记物cd90和与维持细胞多能性有关的标记物sox2为95％以上。可以确认本发明的类似间充质干细胞是一种具有提高免疫抑制能力和多潜能维持性的新型间充质干细胞。
85.图7为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞分化(differentiation)为各种间充质细胞的能力的结果的附图。参照图7，在适当的分化环境中，类似间充质干细胞可以分化为脂肪细胞(adipogenic cell)、骨原细胞(osteogenic cell)、软骨细胞(chondrogenic cell)和肌原细胞(myogenic cell)。这符合世界干细胞治疗协会定义的间充质干细胞分化能力的条件。
86.图8为将根据本发明一实施例的类似间充质干细胞(mmsc)的增殖能力和细胞大小与骨髓来源的间充质干细胞(bm-msc，bone marrow msc)进行比较的曲线图。在图8中，累积pdl(cpdl，cumulative pdl)代表细胞增殖能力。类似间充质干细胞在传代4次时平均分裂16.13次。此时，类似间充质干细胞的大小为13.6μm。与骨髓来源的间充质干细胞相比，类似间充质干细胞的细胞增殖速度快约1.6倍，细胞大小比骨髓来源的间充质干细胞小于约0.8倍。类似间充质干细胞具有较高的细胞增殖能力和较小的细胞体积，因此当其用作干细胞治疗组合物时，可以减少在体内产生副作用的可能性，并提高治疗效果。
87.图9为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞以高纯度被分离的曲线图。参照图9，可以确认，类似间充质干细胞的未分化的调节标记物oct4被移除99％以上。因此，当根据本发明的制备方法来分离并培养在建立细胞株后培养70传代以下的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞时，可以确认，类似间充质干细胞以外的未分化细胞没有被混合，以高纯度被分离并培养。
88.图10a及图10b为根据本发明一实施例的通过gtg-显带(banding)和snp分析来确认类似间充质干细胞的遗传安全性的附图。参照图10，可以确认，以msp-0005、msp-0006及msp-0007三个批号制备的所有类似间充质干细胞的染色体均正常，并未观察到snp异常。
89.图11为确认根据本发明一实施例的基于细胞迁移程度的类似间充质干细胞的组织再生能力的曲线图。参照图11，通过体外伤口愈合(in vitro wound healing)分析来确认了类似间充质干细胞根据细胞迁移的组织再生能力约为骨髓来源的间充质干细胞(成体干细胞)的3.5倍以上。
90.图12为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的物质交换能力的附图。参照图12，通过将人脐静脉内皮细胞(huvec)与类似间充质干细胞共培养来确认了细胞间物质交换能力。
91.图13为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的血管生成能力的附图。参照图13，通过在基质胶(matrigel)上培养类似间充质干细胞来确认了自发血管生成能力。
92.图14为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的免疫细胞增殖抑制能力及抗炎功效的附图。参照图14，通过将单个核细胞(免疫细胞)和类似间充质干细胞进行共培养来确认了免疫细胞较强的增殖抑制作用。这说明类似间充质干细胞的免疫抑制能力及
抗炎功效优于骨髓来源的间充质干细胞。
93.图15为显示根据本发明一实施例的类似间充质干细胞的细胞存活、组织再生及分泌抑制细胞凋亡的功能性物质的能力的曲线图。
94.如图15所示，提供一种根据本发明一实施例来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞，所示类似间充质干细胞比骨髓来源的间充质干细胞高表达mmp-1蛋白质及hgf蛋白质，比骨髓来源的间充质干细胞低表达cd95，并且cd90及sox2表达为95％以上。此外，根据本发明的一实施例，所述类似间充质干细胞表达的所述mmp-1蛋白质可以比骨髓来源的间充质干细胞高15倍以上，表达的所述hgf蛋白质可以比骨髓来源的间充质干细胞高2倍以上。另外，根据本发明的一实施例，所述类似间充质干细胞表达的cd95可以比骨髓来源的间充质干细胞低15倍以上。
95.如图15所示，在根据本发明一实施例来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞中与组织再生相关的基质金属蛋白酶-1(mmp-1，matrix metalloproteinase-1)蛋白的分泌量比骨髓来源的间充质干细胞高约16.9倍以上。并且，在类似间充质干细胞中与细胞生存和增殖有关的肝细胞生长因子(hgf，hepatocyte growth factor)蛋白的分泌量比骨髓来源的间充质干细胞高约2.5倍以上。相反地，在类似间充质干细胞中与细胞凋亡相关的cd95(cluster differentiation 95)的表达比骨髓来源的间充质干细胞低约15倍以上。
96.所述“cd95(cluster differentiation 95)”是一种死亡受体(death receptor)，也被称为fas受体(fasr，fas receptor)、凋亡抗原-1(apo-1，apoptosis antigen 1)或肿瘤坏死因子受体超家族-6(tnfrsf6，tumor necrosis factor receptor superfamily member 6)。cd95位于细胞表面，通过与cd95配体(cd95l，cd95 ligand)的相互作用来诱导细胞凋亡。具体地，当一种被称为fas配体(fasl，fas ligand)或cd95配体(cd95l，cd95 ligand)的配体结合到所述cd95时，将会通过死亡诱导信号复合物(disc，death-inducing signaling complex)来促进细胞凋亡。即，当所述cd95在干细胞或祖细胞中过度表达时，由cd95l引起的细胞凋亡信号被激活。另外，所述cd95表达相对较低的干细胞可以通过抑制细胞凋亡信号来表现出良好的细胞存活率。
97.图16示出比骨髓来源的间充质干细胞高表达的根据本发明一实施例来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的炎症调节相关基因。
98.如图16所示，提供一种类似间充质干细胞，其在根据本发明一实施例来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞中，表达的炎症调节基因比骨髓来源的间充质干细胞高2倍至100倍以上，所述炎症调节基因是由gata3、adora2a、gps2、psma1、pbk、lrfn5、cdh5、apoe、foxf1、tek、cx3cl1、ptger4、acp5、bcr、socs5及mdk组成的群组中的任一种以上。另外，根据本发明的一实施例，提供一种类似间充质干细胞，其同时表达gata3、adora2a及gps2基因。所述炎症调节基因是一种与抑制炎症有关的基因，所述类似间充质干细胞高表达所述炎症调节基因，由此其抗炎功效等比骨髓来源的间充质干细胞胞高2倍至100倍以上。
99.如图16所示，gata3基因在类似间充质干细胞中的表达量比骨髓来源的间充质干细胞高出约100倍以上。另外，在类似间充质干细胞中，adora2a及gps2基因的表达量是骨髓来源的间充质干细胞的约10倍以上。此外，psma1、pbk、lrfnhm、cdh5及apoe基因在类似间充质干细胞中的表达量是骨髓来源的间充质干细胞的约5倍以上。此外，类似间充质干细胞可
以同时表达所述炎症调节基因gata3、adora2a及gps2基因。
100.图17示出比骨髓来源的间充质干细胞高表达的根据本发明一实施例来制备的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞的免疫抑制相关基因。
101.如图17所示，提供一种类似间充质干细胞，所述类似间充质干细胞表达的免疫抑制基因比骨髓来源的间充质干细胞高2倍至100倍以上，所述免疫抑制基因是gata3、gps2、psma1、apoe、foxf1、tek、cx3cl1、ptger4、bcr、socs5及mdk中的任一种以上。另外，提供一种类似间充质干细胞，其同时表达gata3、gps2及psma1基因。
102.如图17所示，gata3基因在类似间充质干细胞中的表达量比骨髓来源的间充质干细胞高出约50倍至100倍以上。此外，gps2基因在类似间充质干细胞中的表达量比骨髓来源的间充质干细胞高出约5倍至10倍以上。此外，psma1和apoe基因在类似间充质干细胞中的表达量是骨髓来源的间充质干细胞的5倍以上。此外，类似间充质干细胞可以同时表达所述免疫抑制基因gata3、gps2及psma1基因。
103.图18为根据本发明的一实施例的通过分析类似间充质干细胞的细胞溶解物(cell lysate)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞高表达的蛋白质组的附图。参照图18，类似间充质干细胞中血管生成素-4(angpt4，angiopoietin-4)、骨形态发生蛋白受体-ib(bmpr-1b，bone morphogenic protein receptor 1b)、激活素-b(activin b)、激活素rii(activin rii)、ccr1、人趋化因子受体cram-a亚型(hcr，human chemokine receptor cram-a isoform)、细胞间粘附分子-2(icam-2，intracellular adhesion molecule 2)的表达量是骨髓来源的间充质干细胞的约2倍以上。所述类似间充质干细胞可以同时表达血管生成素-4和bmpr-1b。优选地，所述类似间充质干细胞可以比骨髓来源的间充质干细胞高表达血管生成素-4和bmpr-1b约3倍以上。更优选地，所述类似间充质干细胞表达的angpt4、bmpr-1b、激活素-b、激活素-rii、ccr1、hcr及icam-2中的任一种以上蛋白质组可以比骨髓来源的间充质干细胞高出约2倍以上。
104.图19为根据本发明的一实施例的通过分析类似间充质干细胞的细胞溶解物(cell lysate)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞低表达的蛋白质组的附图。参照图19，所述类似间充质干细胞中血管生长素(angiogenin)、血管生成素-2(angiopoietin-2)、ccr8、eda-a2及il-20的分泌量可以比骨髓来源的间充质干细胞低约2倍以上。所述类似间充质干细胞可以同时分泌血管生长素及血管生长素-2，其分泌量可以比骨髓来源的间充质干细胞低约2倍以上。
105.图20为根据本发明的一实施例的通过分析类似间充质干细胞的培养上清液(culture supernatant)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞高表达的蛋白质组的附图。参照图20，所述类似间充质干细胞的gro-a、il-15rα、fasl、激活素-rii、bmp-2、ccr2、cxcl14、fgfr4、upa及mmp-20的分泌量可以比骨髓来源的间充质干细胞高约2倍以上。所述类似间充质干细胞可以同时分泌gro-a及il-15rα，其分泌量可以比骨髓来源的间充质干细胞高约2倍以上。所述间充质干细胞的gro-a、il-15rα、fasl、激活素-rii、bmp-2、ccr2、cxcl14、fgfr4中的任一种蛋白质组的分泌量可以比骨髓来源的间充质干细胞高约2倍以上。
106.图21为根据本发明的一实施例的通过分析类似间充质干细胞的培养上清液(culture supernatant)蛋白质组来显示比骨髓来源的间充质干细胞低表达的蛋白质组的
附图。参照图21，所述类似间充质干细胞中timp-2、激活素-a、vegf-a、卵泡抑素样蛋白-1(follistantin-like1)、erbb4m及血小板反应素-1(thrombospondin-1)的分泌量比骨髓来源的间充质干细胞低约4倍以上。所述类似间充质干细胞可以同时分泌timp-2及激活素-a，其分泌量比骨髓来源的间充质干细胞低约5倍以上。
107.本发明的类似间充质干细胞在与人类外周血来源的单个核细胞共培养时可以抑制增殖能力。更详细地，当与人类外周血来源的单个核细胞共培养时，与骨髓来源的间充质干细胞相比，本发明的类似间充质干细胞可以抑制约5倍至8倍以上的增殖。
108.在评估细胞迁移和修复能力时，本发明的类似间充质干细胞可以比骨髓来源的间充质干细胞表现出约3.5倍以上的高修复能力。
109.本发明的类似间充质干细胞分泌的与细胞存活有关的基因mmp-1蛋白可以比骨髓来源的间充质干细胞高出约15倍至16倍以上。此外，所述类似间充质干细胞分泌的hgf蛋白(与细胞生长及组织再生相关的基因)可以比骨髓来源的间充质干细胞高出约2倍以上。
110.在本发明的类似间充质干细胞中，细胞凋亡受体cd95的表达量可以比骨髓来源的间充质干细胞低约15倍以上。
111.本发明提供一种包括根据本发明的一实施例的制备方法来制备的类似间充质干细胞的治疗组合物，其特征在于，所述治疗组合物是细胞治疗组合物、细胞基因治疗组合物、组织工程治疗组合物、抗炎治疗组合物、免疫治疗组合物及用于预防或治疗癌症的组合物中的任一种。另外，所述治疗组合物还可以包括从所述类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。另外，所述治疗组合物可以用于预防或治疗多发性硬化症、全身性硬化症、急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、慢性肺病、急性肺病、克罗恩病、大便失禁、移植物抗宿主病、下肢缺血病、伯杰氏病、足部溃疡、狼疮、类风湿关节炎、急慢性肾盂炎、炎性膀胱炎、间质性膀胱炎、膀胱活动低下症、膀胱过度活动症、冻结肩、肩袖损伤及破裂、各种运动引起的肌肉骨骼系统损伤、膝关节软骨损伤、耳鸣、特应性皮炎、牛皮癣、烧伤引起的皮肤损伤、紫外线等引起的皮肤损伤、预防包括视网膜病变的炎症和免疫系统疾病、缺血性痴呆、阿尔茨海默氏症、脊髓损伤、帕金森氏症及中枢神经系统疾病中的任一种以上的疾病。
112.从所述类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体包括与免疫抑制、抗炎功效、细胞存活、组织再生或细胞凋亡抑制有关的所有功能物质。然而，只要是具有作为所述治疗组合物的功能性的材料，本发明并不限于此。
113.本发明提供一种包括根据本发明的一实施例的制备方法来制备的类似间充质干细胞的递送体，其特征在于，所述递送体负载药物组合物。
114.本发明提供一种用于预防或治疗疾病的组合物，其包括从根据本发明一实施例的制备方法来制备的类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。另外，所述疾病可以是多发性硬化症、全身性硬化症、急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、慢性肺病、急性肺病、克罗恩病、大便失禁、移植物抗宿主病、下肢缺血病、伯杰氏病、足部溃疡、狼疮、类风湿关节炎、急慢性肾盂炎、炎性膀胱炎、间质性膀胱炎、膀胱活动低下症、膀胱过度活动症、冻结肩、肩袖损伤及破裂、各种运动引起的肌肉骨骼系统损伤、膝关节软骨损伤、耳鸣、特应性皮炎、牛皮癣、烧伤引起的皮肤损伤、紫外线等引起的皮肤损伤、预防包括视网膜病变的炎症和免疫系统疾病、缺血性痴呆、阿尔茨海默氏症、脊髓损伤、帕金森氏症及中枢神经系统疾病中的任一种以上。
115.本发明提供一种化妆品组合物，其包括从根据本发明一实施例的制备方法来制备的类似间充质干细胞分泌的有效成分或外泌体。
116.与骨髓来源的间充质干细胞相比，本发明的人多能干细胞来源的类似间充质干细胞具有更好的抗炎功效、免疫抑制能力及组织再生能力。
117.实施例1：具有增强抗炎功效和免疫抑制作用的类似间充质干细胞的分离及培养
118.图1为示出根据本发明的一实施例的从人多能干细胞中分离并培养类似间充质干细胞的过程的示意图。使用了在建立细胞株后传代培养70次以下的作为人多能干细胞。并在37℃和5％co2的条件下，在细胞培养基中维持培养了建立细胞株后传代培养70次以下的人多能干细胞。通过简单的酶处理，从培养板中分离了维持培养的人多能干细胞。之后，通过胚状体的形成，只选择了囊性(cystic)胚状体。在将细胞渗透性的三维培养插入物结合到新的培养板(6孔板)之前，仅在培养期间首次向新的培养板添加了2ml的培养液。之后，将细胞渗透性的三维培养插入物结合到包括2ml的培养液的培养板。随后，在细胞渗透性的三维培养插入物中再添加2ml的培养液后，将所选的囊性胚状体装载到被结合的细胞渗透性的三维培养插入物上。使用了egm-2mv作为添加到新的培养板的培养液及细胞渗透性的三维培养插入物中的培养液。不更换装载囊性胚状体的细胞渗透性三维培养插入物中的培养液两天，并培养了胚状体。之后，取出培养液，仅在细胞渗透性的三维培养插入物中额外添加4ml的培养液，并每天更换培养液，由此诱导分化为类似间充质干细胞。
119.实施例2：具有增强抗炎功效和免疫抑制作用的类似间充质干细胞的分离及增殖
120.在上述实施例1中被分离的类似间充质干细胞中，分离了通过细胞渗透性的三维培养插入物并移动到细胞渗透性的三维培养插入物下方的群体形式的细胞。并机械地(mechanically)去除了被分离的群体中多层(multilayer)形式的群体。在被分离出的群体中，使用微移液管仅将单层(monolayer)形式的群体切割成宽度500μm以下，长度500μm以下的大小，进行均匀化并选择性地培养。优选地，通过将单词形式的群体均匀化为宽度及长度各100μm～00μm的大小来培养了类似间充质干细胞。培养5至7天后，只分离出了以单细胞形式从群体中突出的类似间充质干细胞，并传代培养且进行了增殖。在分离出单细胞之前，用移液管完全清除了非单细胞形式的群体及上皮细胞。将分离的单细胞转移到新的培养板上，并通过传代培养诱导了增殖。此时，培养基采用了egm-2mv。
121.具体地，如图4所示，当群体形式的类似间充质干细胞移动到细胞渗透性的三维培养插入物的下方时，从培养板分离了细胞渗透性的三维培养插入物。随后，获得移动到被分离的细胞渗透性的三维培养插入物下方的群体形式的类似间充质干细胞后，机械去除多层(multilayer)形式的群体，将单层(monolayer)形式的群体的大小均匀化，并进行了选择性培养。对于从单层形式的群体增殖的类似间充质干西部，即使对其进行连续传代培养也可维持细胞的形态及增殖能力，因此并未观察到对细胞的形态及增殖等造成的负面变化。
122.实施例3：类似间充质干细胞的表面抗原表达分析
123.为了对根据实施例1和2制备的类似间充质干细胞进行特性分析，使用荧光激活细胞分选技术(facs，fluorescence activated cell sorting)来对干细胞特定标记物的表达进行了分析。
124.具体地，使用tryple将诱导增殖的类似间充质干细胞转化为单细胞，并以5x105cells/ml的浓度悬浮在磷酸盐缓冲生理盐水(pbs，phosphate buffered saline)中。
将sox2、cd44、cd73、cd90、cd105、cd146、ng2、hla-abc、cd11b、cd11c、cd14、cd19、cd34、cd45、cd40、cd40l、cd80、cd86、cd95、cd133、kdr、flt-1、tie-2、hla-dr、oct3/4、tra-1-81及tra-1-60抗体添加到每个细胞，在室温下反应了45分钟。之后，对每个细胞进行了流式细胞分析。核内蛋白sox2和oct3/4在室温下5分钟内处理了0.1％的triton x-100，从而诱导了细胞膜透化(permeabilization)过程。然后，添加抗体来进行了流式细胞分析。其结果如下表1和图6所示。
125.表1.类似间充质干细胞的表面抗原表达率
[0126][0127]
参照上述表1和图6，根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞均表达了95％以上的间充质干细胞特异性标记物cd44、cd73、cd90及cd105。与此相反，cd45、cd34、cd14及cd19的表达量为2％以下。并且，几乎没有表达未分化的调节标记物oct3/4、tra-1-60、tra-1-81及免疫排斥抗原hla-dr。因此可以确认，根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞具有世界干细胞治疗协会定义的间充质干细胞的所有特性。此外，也确认了世界干细胞治疗协会未定义为成体间充质干细胞特性的sox2和cd146的表达为90％以上，而cd95的表达明显偏低。由于其分化诱导，因此可以预测其具有表1所示的表面抗原表达特性。此外，由于在分化诱导人多能干细胞的胚状体中，仅对囊性胚状体使用细胞渗透性的三维培养插入物来进行分离，并通过单层形式的细胞群体进行均匀化及培养，因此表1的表面抗原表达特征保持不变。尤其，通过本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞表达sox2为90％以上，其不同于普通间充质干细胞。
[0128]
实施例4：类似间充质干细胞的分化能力分析
[0129]
为了确认通过上述实施例1和2制备的类似间充质干细胞的多能性，诱导分化为在世界干细胞治疗协会中定义为间充质干细胞特征的成骨、脂肪及软骨细胞和分化为肌原细
胞。
[0130]
具体地，将所制备的类似间充质干细胞培养在含10％fbs、5μg/ml胰岛素、1μm地塞米松、0.5mm异丁基甲基黄嘌呤及60μm吲哚美辛的低浓度葡萄糖dmem培养基中。另外，在含10％fbs、1μm地塞米松、10mmβ-甘油磷酸及60μm抗坏血酸-2-磷酸的低浓度葡萄糖dmem培养基中进行了培养。并且，确认了分别是否分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。通过茜素红s(alizarin red s)染色来确认由所述分化而生成的成骨细胞是否已分化。通过油红o(oil red o)染色来确认了由所述分化而生成的脂肪细胞是否已分化。此外，通过阿尔新蓝(alcian blue)染色来确认由所述分化而生成的软骨细胞是否已分化。
[0131]
另外，为了确认是否已分化为肌原细胞，将所制备的类似间充质干细胞在含有20％fbs、1％非必需氨基酸、1％硫酸青霉素及0.1mmβ-巯基乙醇的dmem培养基中进行分化。在所述分化的肌原细胞中，确认了平滑肌特异性标志物αsma的表达。
[0132]
因此，如图7所示，由于根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞的一定的分化能力，因此已满足由世界干细胞治疗协会提出的间充质干细胞的特征。
[0133]
实施例5：类似间充质干细胞的增殖能力及细胞大小分析
[0134]
为了确认通过上述实施例1和2产生的类似间充质干细胞的增殖能力，确认了从第3代到第7代的细胞分裂总数。并对作为成体干细胞的骨髓来源的间充质干细胞的细胞分裂总数一起进行了比较。其结果如下表2和图8所示。
[0135]
表2.类似间充质干细胞的增殖能力
[0136][0137]
如表2和图8所示，在类似间充质干细胞中，一个细胞在传代3-7期间平均分裂16.13次。相比之下，骨髓来源的间充质干细胞平均分裂10.17次。可见，类似间充质干细胞具有更良好的增殖能力。
[0138]
另外，对增殖的类似间充质干细胞的细胞大小进行了调查，其结果如下表3和图6所示，由此可以看出，类似间充质干细胞的平均细胞大小为13.6
±
0.3μm。相反地，骨髓来源的间充质干细胞的平均细胞大小为17.7
±
0.4μm。因此可以确认，与骨髓来源的间充质干细胞相比，类似间充质干细胞的大小相对较小。由于类似间充质干细胞的大小相对较小，因此当应用细胞治疗并将其注入到血管内时，可以降低由血管阻塞而导致的肺栓塞(pulmonary embolism)的可能性。因此，根据本发明的类似间充质干细胞可以提供为治疗组合物、细胞治疗组合物、细胞基因治疗组合物、组织工程治疗组合物、抗炎治疗组合物、免疫治疗组合物及用于预防或治疗癌症的组合物，由此可以提高治疗效率，减少副作用的可能性。
[0139]
表3.类似间充质干细胞的细胞大小
[0140][0141]
实施例6：类似间充质干细胞的高纯度分离
[0142]
已确认了通过实施例1和2来制备的类似间充质干细胞是没有混合未分化细胞的高纯度细胞。即，通过qpcr方法确认了类似间充质干细胞在维持及增殖中的未分化的调节标记物oct4的表达。并且，对作为未分化的多能干细胞的人胚胎干细胞株与人皮肤成纤维细胞(hff)进行了比较分析。其结果如图9所示，未分化的调节标记物oct4仅在人胚胎干细胞中表达。可以确认根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞中未分化细胞并未混合，如人皮肤成纤维细胞(hff)一样。可以确认，根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞是以高纯度被分离的细胞，且未检测到未分化细胞的表达。
[0143]
实施例7：类似间充质干细胞的遗传安全性分析
[0144]
另外，为了确认类似间充质干细胞的遗传安全性，进行了染色体分析和单核苷酸多态性(snp，single nucleotide polymorphism)分析。
[0145]
具体地，为了进行染色体分析，将类似间充质干细胞添加到含有20μl秋水仙碱溶液(浓度为100μg/μl)的10ml的培养基中，然后在37℃下放置2小时。此后，在以500rpm离心5分钟后，去除了上清液。然后，将细胞悬浮在0.075m的kcl储备溶液中后，将其放置在37℃的恒温水浴中25分钟。之后，添加了5滴固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1，v/v)，然后以1200rpm离心8分钟。此后，去除了上清液，并额外添加固定液，并将在室温下保持10分钟的过程进行了两次。此后，将一滴细胞悬液滴在浸有70％冷乙醇的载玻片上。随后，用酒精灯诱导了载玻片干燥。之后，在5％的gimesa溶液中进行了12分钟的染色。然后，通过蒸馏去除染色液，然后在空气中诱导干燥，并在光学显微镜下进行了观察。委托专业检测机构进行了snp分析，并使用illumina snp芯片来确认染色体的异常与否。如图10所示，以msp-0005、msp-0006及msp-0007三个批号(batch number)制备的所有类似间充质干细胞的染色体均正常，并未观察到snp异常。由此证明，根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞具有遗传安全性。
[0146]
实施例8：类似间充质干细胞的组织再生能力分析
[0147]
为了对通过实施例1和2制备的类似间充质干细胞的功能性进行评估，进行了各种个分析。为了分析组织再生能力，进行了体外细胞迁移实验(in vitro cell migration assay)。在组织再生能力分析中，使用骨髓来源的间充质干细胞作为对照细胞。
[0148]
具体地，在每个35mm的μ-皿中，以3
×
104cells/孔的浓度向类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞分别注入70μl。然后，在37℃、5％co2培养基中培养了24小时。此
后，移除培养插入物(culture-insert)，并添加了2ml的10％dmem培养基。然后一边在显微镜下进行观察，一边测定了细胞迁移的数量。
[0149]
如图11所示，所制备的类似间充质干细胞的迁移率平均为67.51％。根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞的迁移率比骨髓来源的间充质干细胞高350％。即，已确认根据本发明的一实施例来制备的类似间充质干细胞在体内施用时可以进行快速细胞迁移和增殖。由此可见，所制备的类似间充质干细胞具有很高的组织再生能力。
[0150]
实施例9：类似间充质干细胞的物质交换能力和血管生成能力分析
[0151]
作为评估通过上述实施例1和2制备的类似间充质干细胞的功能性的另一种方法，对物质交换能力和血管生成能力进行了分析。
[0152]
具体地，使用用于分析细胞之间的相互作用的钙黄绿素(calcein)来分析了物质交换能力，其中，所述钙黄绿素是一种荧光材料，可以移动到缝隙连接(gap-junction)。首先，对血管细胞之一的人脐静脉内皮细胞(huvec)进行了钙黄绿素染色。并且，与标记有dil的类似间充质干细胞一起在37℃的培养基中共培养了1小时。然后在荧光显微镜下进行了分析。如图12所示，可以确认，荧光显示的huvec细胞和红色显示的dil-类似间充质干细胞通过共培养实现快速物质转移。进行了48小时的流式细胞分析，由此确认进行物质交换的细胞数为46.15％。即，根据本发明的制备方法的类似间充质干细胞可以通过与血管细胞的快速缝隙连接耦合来促进细胞间的相互作用，包括有用物质的供应。
[0153]
另外，为了分析血管生成能力，将室温下将解冻的基质凝胶按50μl分别注入到96孔板中。然后，在37℃静置30分钟后，将1-2
×
104个被单细胞化的类似间充质干细胞接种(seeding)于基质凝胶上，然后在37℃下培养了24小时。然后，添加10％的甲醛固定液并额外培养了10分钟。在10倍的显微镜下随机观察了3～5个部位，由此观察到了自发性血管生成(sponteneous tubule formation)。如图13所示，可以确认，3个批号的类似间充质干细胞在基质凝胶上均有自发性血管生成。这表明通过实施例1和2制备的类似间充质干细胞具有自发性血管生成能力。即，上述特性表明，根据本发明的制备方法来制备的类似间充质干细胞可以促进损伤部位的新血管的生成和物质交换。
[0154]
实施例10：类似间充质干细胞的免疫细胞的增殖抑制及抗炎功效分析
[0155]
作为通过实施例1和2来制备的类似间充质干细胞的功能分析之一，对通过与免疫细胞的共培养来表达与细胞增殖抑制和抗炎有关的蛋白质组进行了分析。
[0156]
具体地，分别准备了1000、2000、5000及10000个根据实施例1及2来制备的类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞。并且，将从外周血中采集的2x105cell/孔的单个核细胞(pbmc，peripheral blood mononuclear cell)在96孔板中共培养了5天。使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse，carboxy fluorecein succinimidyl ester)对每个实验组进行标记，由此测定pbmc的增殖抑制率(％)。其结果如下表4和图14所示。
[0157]
表4.与外周血单个核细胞共培养时，根据类似间充质干细胞数量的增加的免疫细胞增殖抑制能力
[0158][0159]
*外周血单个核细胞：2x105cell/孔
[0160]
如上述表4和图14所示，可以确认类似间充质干细胞以依赖与于浓度的方式来抑制外周血单个核细胞的增殖。即，与骨髓来源的间充质干细胞相比，本发明的类似间充质干细胞具有显著良好的增殖抑制作用。因此，本发明的类似间充质干细胞的免疫抑制能力优异。
[0161]
另外，通过对类似间充质干细胞的基因组和蛋白质组的分析，对与抗炎功效和免疫抑制能力相关的基因的表达进行了分析。结果表明，具有典型抗炎功效的gata3、adora2a及gps2的表达量比骨髓来源的间充质干细胞高约11至100倍以上。因此，与骨髓来源的间充质干细胞相比，类似间充质干细胞具有更优越的抗炎功效和免疫抑制能力。
[0162]
实施例11：类似间充质干细胞的功能性有用物质的分泌能力
[0163]
为了对通过实施例1和2制备的类似间充质干细胞进行功能性的分析，测量了从它们分泌的有用物质的浓度。具体地，将制备的类似间充质干细胞在无血清dmem培养基中培养了24小时。然后，在500rpm条件下进行了离心，并仅回收上层部的培养基。使用酶联免疫吸附法(elisa，enzyme linked immunosorbent assay)来对回收的培养液中mmp-1、hgf及cd95进行了定量分析。为了与成体干细胞进行比较，对骨髓来源的间充质干细胞进行了比较分析，其结果如图15所示。
[0164]
如图15所示，基质金属蛋白酶-1(mmp-1)在类似间充质干细胞中的浓度为20953pg/ml，在骨髓来源的间充质干细胞中的浓度为1237pg/ml。即，在类似间充质干细胞中，mmp-1的分泌量是骨髓来源的间充质干细胞的约16倍。另外，与细胞生长和增殖有关的蛋白质组肝生长因子(hgf，hepatic growth factor)在类似间充质干细胞中的浓度为1360pg/ml，在骨髓来源的间充质干细胞中的浓度为534pg/ml。换言之，hgf在类似间充质干细胞中的分泌量是骨髓来源的间充质干细胞的2.5倍。此外，在诱导细胞凋亡中起重要作用的cd95在类似间充质干细胞张红的浓度为53pg/ml，在骨髓来源的间充质干细胞中的浓度为800pg/ml。因此，与骨髓来源的间充质干细胞相比，cd95在类似间充质干细胞中的表达量低约15倍以上。因此，与现有的骨髓来源的间充质干细胞相比，根据本发明制备的类似间充质干细胞在分泌与组织再生和细胞增殖相关的蛋白质方面具有优越性。此外，细胞凋亡诱导蛋白的表达显著降低，由此可以看出组织再生和细胞存活能力非常优越。
[0165]
实施例12：分离并培养的类似间充质干细胞的炎症调节及免疫抑制相关基因的表达特征的确认
[0166]
对通过实施例1和2分离培养的类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞进行下一代测序(ngs，next generation sequence)之后，基于由ncbi-geo发布的数据库来对基因表达差异进行了分析。
[0167]
具体地，为了比较类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞的基因表达，进行了rna序列测定(sequencing)。将上述两个细胞以3
×
105/皿的密度分配在100mm的培养皿中，并在80％汇合处(confluence)进行了分析。从细胞中提取总rna进行了rna-seq，并确认所有rna样品的质量均高于标准。根据truseq stranded mrna lt样品制备试剂盒(illumina)的标准程序来制备了cdna文库(library)。根据truseq stranded mrna样品制备指南(第15031047版)，在novaseq 6000系统(illumina)上对cdna文库进行了测序。每个rna序列数据由每个细胞的3个样品(n＝3)来生成。使用bbduk(bbtools)从获得的illumina read数据中计算出phred质量分数(quality score)，并且，在所有数据中仅使用了平均q30以上的数据。使用bowtie2来将选定的读取数据映射到参考基因组序列(hg19；基因组数据库：uscs)上(langmead&amp；salzberg，2012)。使用bedtools(https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/)来对读取的数据进行了计算。对每个样品进行了映射(mapping)和量化。使用edger来对量化的基因表达信息进行了分位数标准化(robinson，mccarthy，&amp；smyth，2010)。为了比较类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞，对所有的数据进行了分析。其结果如图16和图17所示。
[0168]
如图16所示，通过对炎症调节基因的分析，可以确认表达量比骨髓来源的间充质干细胞高约两倍以上的基因有16种：gata3、adora2a、gps2、psma1、pbk、lrfn5、cdh5、apoe、foxf1、tek、cxcl1、ptger4、acp5、bcr、socs5及mdk。尤其，gata3基因表达约108倍，adora2a基因表达约27.97倍，gps2基因表达约11.02倍。因此，炎症调节基因在类似间充质干细胞中的表达量是骨髓来源的间充质干细胞的10倍以上。
[0169]
另外，通过使用rna-seq来分析免疫抑制能力相关基因的表达的结果如图17所示。表达量比骨髓来源的间充质干细胞高两倍以上的基因有11种：gata3、gps2、psma1、apoe、foxf1、tek、cxcl1、ptger4、bcr、socs5及mdk。尤其，gata3基因的表达量为108倍，adora2a基因的表达量为11.02倍，由此可以确其表达量是骨髓来源的间充质干细胞的10倍以上。
[0170]
实施例13：分离并培养的类似间充质干细胞的细胞溶解物及培养上清液的蛋白质组分析
[0171]
使用l507抗体阵列(antibody array)来对通过实施例1和2制备的类似间充质干细胞的细胞溶解物(cell lysate)和培养基的增加或减少蛋白质组进行了分析。
[0172]
具体地，为了比较类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞的细胞溶解物及培养上清液的蛋白质组成，使用了作为半定量的蛋白质抗体阵列芯片(antibody array chip)的l507(raybiotech)。在获得总rna时一起取得了细胞溶解物及培养上清液。l507芯片是一种基于生物素标记(biotin labeling)来分析507种的蛋白质的方法，被用于来分析类似间充质干细胞的蛋白质。为了进行分析，提取了细胞溶解物及培养上清液中的蛋白质。之后使用bca蛋白检测试剂盒(protein assay kit，abcam)来对蛋白质进行了定量(50至200μg范围)。将定量后的蛋白质分配成等量，并进行了生物素标记。然后进行了蛋白质杂交(protein hybridization)。使用链霉亲和素-cyanine3共轭物(streptavidin-cyanine3conjugate)来可显示杂交产生的荧光图像，并使用genepix 4100a微阵列扫描仪
(microarray scanner)(分子器件，molecular devices)来对其进行了扫描。并使用edger来对所有数据进行了分位数标准化(quantile normalization)。之后，使用genepix pro7.0软件(分子器件)来对其进行了分析。为了比较类似间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞，对所有数据进行了分析，其结果如图18、图19、图20及图21所示。
[0173]
如图18所示，分析了类似间充质干细胞溶解物蛋白质组。类似间充质干细胞表达的血管生成素-4(angpt4)、骨形态发生蛋白受体-ib(bmpr-1b)、人趋化因子受体(hcr)、激活素-b、激活素-rii、ccr1、细胞间粘附分子-2(icam-2)是骨髓来源的间充质干细胞的约两倍多。另外，如图19所示，包括血管生成素(ang)、血管内皮素-1(ang-1)、血管内皮素-2(ang-2)、骨形态发生蛋白受体-1a(bmpr1a)及cxc趋化因子受体-6(cxcr6)的15中蛋白质组在类似间充质干细胞中的表达量比骨髓来源的间充质干细胞低约2倍。
[0174]
另外，如图20所示，分析了培养上清液的蛋白质组。类似间充质干细胞分泌的gro-a、il-15rα、fasl、激活素-rii、bmp-2、ccr2、cxcl14及fgfr4的分泌量是骨髓来源的间充质干细胞的约2倍。如图21所示，类似间充质干细胞表达的甲状旁腺蛋白酶组织抑制剂(timp-2)、激活素-a、血管内皮因子(vegfa)、卵泡抑素样蛋白-1(fstl1)、erb4、血小板反应素-1(thrombospondin-1)等较低。
[0175]
综上，通过有限的实施例及附图对实施例进行了说明，本领域的普通技术人员能够对上述记载进行多种修改与变形。例如，所说明的技术以与所说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的构成要素以与所说明的方法不同的形态结合或组合，或者，由其他构成要素或等同物进行替换或置换也能够获得相同的效果。
[0176]
由此，其他体现、其他实施例及权利要求范围的均等物全部属于专利权利要求的范围。