一组用于测序矫正的内标及其应用的制作方法

1.本发明属于宏基因组测序领域，特别涉及一组用于测序矫正的内标及其应用。


背景技术：

2.感染性疾病是临床常见的多发病，是全球死亡率和发病率最高的疾病之一。病原微生物的宏基因组测序可以直接从临床样本中识别多种病原微生物，包括病毒、细菌，真菌和寄生虫，宏基因组测序不依赖于微生物的分离与培养，因而减少了由此带来的瓶颈问题，打破了传统病原微生物检测的局限性，越来越多的应用于临床感染性疾病的诊断，因而也对宏基因组测序的要求也不断提高。宏基因组测序从dna的提取、文库构建到上机测序，需要经历很多操作步骤，又因节约成本充分利用资源将多个样本一起处理和测序，会存在样本间的污染或标签的污染、以及人为的误差发生，影响检测结果的准确性。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一组用于测序矫正的内标及其应用，该组内标与样本一起经历全实验过程，可以有效监控样本间交叉污染，矫正测序结果，提高检测结果的准确性。
4.本发明提供了一组用于测序矫正的内标，每条内标片段由带侧翼序列的上游引物和带侧翼序列的下游引物，以合成的dna短片段为模板，经pcr扩增获得；其中，所述侧翼序列为与人类及病原体均不同源的随机序列，长度为15～25bp，gc含量40～60％；每条内标片段间的侧翼序列间的同源性小于60％。
5.所述合成的dna短片段包括两端的引物结合区和中间的内标特异区。是经评估少二级结构，无ploy结构，容易扩增的区域。不同的侧翼区与不同的内标特异区共同组成不同内标间的差异；最简单设计方式是同一内标用同一种侧翼序列，如若为了侧翼序列数目和内标特异区不变的情况下增加生产内标的种类数，可设计同一内标用两种不同的侧翼序列，但要对不同的侧翼序列间二级结构等情况进行两两的评估。
6.所述合成的dna短片段长度为100～180bp，gc含量30～80％。
7.所述上游引物和下游引物长度为30～40bp，gc含量30～80％。
8.所述上游引物包括侧翼序列和上游引物结合区；所述下游引物包括侧翼序列和下游引物结合区。
9.所述内标均为长度为150～250bp的dna片段。
10.本发明还提供了一种用于测序矫正的内标的应用，在dna抽提前按比例加入待测样本中，每一个待测样本对应唯一的内标，与样本共同进行dna抽提，及随后的定量、文库构建、混样、上机测序及数据分析过程，监控整个实验过程。
11.本发明还提供了一种用于测序矫正的内标的应用，适用于游离dna建库，dna抽提前直接混入待测样本，不经酶切和打断步骤，直接进入建库步骤。
12.所述比例为小于待测样本总量的8％。
13.有益效果
14.(1)本发明与样本一起经历全实验过程，可以有效监控样本间交叉污染，矫正测序结果，提高检测结果的准确性。
15.(2)本发明可以通过不同的dna短片段模板与不同的上游引物和下游引物的组合，获得足够数量的内标。
16.(3)本发明在有效监控样本间交叉污染的同时不影响测序的数据量。
17.(4)本发明可不经酶切和打断步骤，直接进入建库步骤，适合于游离dna建库时直接混入待抽提样本。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
19.实施例1
20.以生产一批16种内标为例，加以说明，需要其他数量的内标可依此步骤生产。
21.首先合成200bp的dna短片段，合成带侧翼序列的引物16对引物；dna短片段工作液浓度为5000copies/ul，引物工作液浓度为10pmol/ul。
22.dna短片段序列如下，方框处为上游引物结合区和下游引物结合区：
[0023][0024]
带侧翼序列的引物：
[0025]
上游引物：侧翼序列区 上游引物结合区，下游引物：侧翼序列区 下游引物结合区。
[0026]
[0027][0028]
pcr扩增为50ul体系，加入pcr反应mix 25ul，引物各2ul，无核酸酶灭菌水补足体系，按照如下程序进行扩增。
[0029]
扩增程序：
[0030][0031]
获得的pcr扩增产物，加入te稀释后进行质控定量，编号分装，冻存备用。
[0032]
实施例2
[0033]
内标应用于测序矫正
[0034]
1、dna提取
[0035]
液体类样本直接加入内标，痰液类样本需先行液化后再加入内标，加入内标的量为500拷贝，与样本同时进行提取，不同样本加入不同编号内标。
[0036]
2、文库构建
[0037]
使用市面通用dna文库制备试剂套装进行文库构建，从末端修复开始，经过连接接头，纯化，pcr扩增及纯化，最后获得合格文库。
[0038]
3、上机测序
[0039]
每个样本的文库经过定量后混合在一起，上机测序。
[0040]
4、生物信息分析
[0041]
内标与index的编号不一致，常规判断为样本混淆，需重新实验；同一index编号
下，对应两个内标，则有污染存在，可根据具体情况来判断病原体的阴阳性。
[0042]
样本名称对应index编号序列数对应内标编号序列数其他内标编号序列数样本1index12779568内标10内标214590样本2index23432905内标20内标117172样本3index33497441内标368212
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样本4index43250233内标425027内标3257样本5index53368534内标567557
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样本6index63261570内标677951
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样本7index73451020内标732787
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样本8index83034242内标874512
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样本9index92820718内标947992
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样本10index103557559内标1062079
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样本11index113633532内标1152907
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样本12index123061551内标1233152
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技术特征：
1.一组用于测序矫正的内标，其特征在于：每条内标片段由带侧翼序列的上游引物和带侧翼序列的下游引物，以合成的dna短片段为模板，经pcr扩增获得；其中，所述侧翼序列为与人类及病原体均不同源的随机序列，长度为15～25bp，gc含量40～60％；每条内标片段间的侧翼序列间的同源性小于60％。2.根据权利要求1所述的内标，其特征在于：所述合成的dna短片段包括两端的引物结合区和中间的内标特异区。3.根据权利要求1所述的内标，其特征在于：所述合成的dna短片段长度为100～180bp，gc含量30～80％。4.根据权利要求1所述的内标，其特征在于：所述上游引物和下游引物长度为30～40bp，gc含量30～80％；所述上游引物包括侧翼序列和上游引物结合区；所述下游引物包括侧翼序列和下游引物结合区。5.根据权利要求1所述的内标，其特征在于：所述内标均为长度为150～250bp的dna片段。6.一种如权利要求1所述的用于测序矫正的内标的应用，其特征在于：在dna抽提前按比例加入待测样本中，每一个待测样本对应唯一的内标，与样本共同进行dna抽提，及随后的定量、文库构建、混样、上机测序及数据分析过程，监控整个实验过程。7.一种如权利要求1所述的用于测序矫正的内标的应用，其特征在于：适用于游离dna建库，dna抽提前直接混入待测样本，不经酶切和打断步骤，直接进入建库步骤。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述比例为小于待测样本总量的8％。

技术总结
本发明涉及一组用于测序矫正的内标及其应用，每条内标片段由带侧翼序列的上游引物和带侧翼序列的下游引物，以合成的DNA短片段为模板，经PCR扩增获得。本发明与样本一起经历全实验过程，可以有效监控样本间交叉污染，矫正测序结果，提高检测结果的准确性。提高检测结果的准确性。


技术研发人员：鹿亚超
受保护的技术使用者：海宁麦凯医学检验有限公司
技术研发日：2021.08.27
技术公布日：2022/1/7