黄瓜CsHEC2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用的制作方法

黄瓜cshec2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及黄瓜cshec2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用。


背景技术：

2.黄瓜(cucumis sativus l.)，一种葫芦科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一(huang et al.,2009)。黄瓜果实是具有重要经济价值的食用器官，既可以鲜食，也可以加工成泡菜食用。黄瓜果实的表面通常覆盖肉眼可见的果瘤和着生于其顶端的果刺，它们一起组成疣性状(yang et al.,2014)。果实的疣性状是影响黄瓜果实外观和市场价值的重要品质性状。而且疣密度是鲜黄瓜市场分类的重要标准之一，直接影响消费者的购买欲望。例如，中国的黄瓜果实大部分都表现出高密度疣的特点，而欧美的黄瓜水果没有疣或少疣。因此，解析疣形成的调控机制，对于培育具有不同市场理想外在品质的黄瓜具有重要意义。
3.已有的研究表明果刺和果瘤的调控涉及一个复杂的网络，其包括多个转录因子和内源植物激素(che and zhang,2019)。几个黄瓜果刺突变体已经被鉴定和克隆，如完全无毛突变体glabrous 3(csgl3)和trichomless
‑
less(tril)，以及稀刺突变体few spines 1(fs1)(pan et al.,2015；cui et al.,2016；wang et al.,2016；zhang et al.,2016)。有意思地是，这几个突变体是等位的，并且是由同一个基因(csa6g514870)不同形式的突变所致。该基因编码一个iv类同源结构域亮氨酸拉链(hd
‑
zip iv)转录因子，在果刺的起始和发育中发挥重要作用(du et al.,2020)。另外，图位克隆也发现hd
‑
zip i转录因子csgl1在果刺的发育中发挥重要功能，但是csgll突变体在果实分布着大量的肉眼不可见的发育阻滞的果刺，表明该基因不调控果刺的起始过程(li et al.，2015；zhao et al.，2015)。此外遗传研究表明，有果瘤性状对无果瘤性状具有显性作用，而且果瘤性状受单一核显性基因(cstu)控制，该基因编码一个c2h2锌指转录因子，可能通过促进细胞分裂素合成来调控果瘤的发育。曹辰兴于2001年发现，普通有毛黄瓜果实表面均覆盖有果刺，但有的有瘤，有的却没有瘤。重要地是，遗传分析发现果刺基因csgl1对果瘤基因cstu具有隐形上位性，因为cstu基因在无果刺和无果瘤的csgl1突变体中不表达，而果刺在cstu基因突变后还是存在(wang et a1.，2007；zhang et al.，2010；yang et al.，2014)。以上研究结果也表明果刺的存在是果瘤形成的先决条件。
4.此外，赤霉素、生长素和细胞分裂素(ctk)等植物激素已被证实可调节黄瓜果刺和果瘤的发育。赤霉素生物合成基因csga20ox1对果刺发育具有负调控作用，它可能是csgl1基因潜在的下游基因(li et al.，2015)。转录组和激素检测结果表明，cstu参与ctk的生物合成，通过间接促进两个ctk类羟化酶(chl)基因的表达，从而刺激细胞分裂，最终导致果瘤的起始(yang et al.，2014)。
5.尽管刺瘤在黄瓜育种和生产中具有重要意义，但其形成的遗传和调控机制仍十分有限。而且，目前有关的调控黄瓜刺瘤发育的基因除了影响果实刺瘤，还对黄瓜植株地上部的其他器官也有影响，这往往会造成潜在的副作用。因此，发掘特异性调控黄瓜果实刺瘤的
development.development 142：3343
‑
3350
17.schuster c，gaillochet c，medzihradszky a，busch w，daum g，，krebs m，kehle a，lohmann ju(2014)a regulatoryframeworkfor shoot stem cellcontrol integrating metabolic，transcriptional，and phytohormone signals.dev cell28∶438
‑
449
18.wang g，qin z，zhou x，zhao zy(2007)genetic analysis and ssr markers of tuberculatetrait in cucumis sativus.chin bullbot 168
‑
172
19.wang yl，nie jt，chen hm，guo cl，pan j，he hl，pan js，cai r(2016)identification and mapping of tril，a homeodomain
‑
leucine zipper gene involved in multicellulartrichome initiation in cucumis sativus.theorappl genet 129：305
‑
316
20.xing hl，dong l，wang zp，zhang hy，han cy，liu b，wang xc，chen qj(2014)a crispr/cas9 toolkitfor multiplex genome editing in plants.bmc plant biol14∶327
21.yan s，ning k，wang z，liu x，zhong y，ding l，zi h，cheng z，li x，shan h，lv q，luo l，liu r，yan l，zhou z，lucas wj，zhang x(2020)csivpfunctions in vasculature development and downy mildew resistance in cucumber.plos biol18：e3000671
22.yang x，zhang w，he h，nie j，bie b，zhao j，ren g，liy，zhang d，pan j，cai r(2014)tuberculatefruit gene tu encodes a c2 h2 zinc finger protein that is required for the warty rfuitphenotype in cucumber(cucumis sativus l.).plant j 78∶1034
‑
1046
23.zhang h，wang l，zheng s，liu z，wu x，gao z，cao c，li q，ren z(2016)afragment substitution in the promoter of cshdziv11/csgl3 is responsible for fruit spine density in cucumber(cucumis sativus l.).theorappl genet 129：1289
‑
1301
24.zhang w，he h，guan y，du h，yuan l，li z，yao d，pan j，cai r(2010)identification and mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in the cucumber(cucumis sativus l.).theor appl genet 120：645
‑
654
25.zhao jl，pan js，guan y，zhang ww，bie bb，wang yl，he hl，lian hl，cai r(2015)micro
‑
trichome as a class i homeodomain
‑
leucine zipper gene regulates multicellular trichome development in cucumis sativus.j integr plant bio1 57：925
‑
935


技术实现要素：

26.本发明的目的是提供黄瓜cshec2蛋白及其编码基因在降低果实刺瘤密度中的应用。
27.具体而言，本发明首先提供cshec2蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑制因子的生物材料在调控黄瓜果实的刺瘤密度。
28.本发明还提供cshec2蛋白、或其编码基因、或其抑制因子、或含有其编码基因或抑
制因子的生物材料在选育果实刺瘤密度较低的黄瓜中的应用。
29.作为优选，通过抑制cshec2蛋白的编码基因的表达，以降低黄瓜果实的刺瘤密度。
30.作为优选，所述cshec2蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
31.1)seq id no.2所示的氨基酸序列；或，
32.2)seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
33.作为优选，cshec2蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：
34.(1)seq id no.1所示的核苷酸序列(从黄瓜品种新泰密刺中克隆得到)，或，
35.(2)seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，
36.(3)在严格条件下可以与seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
37.本发明还提供了一种构建果实刺瘤密度较低的转基因黄瓜的方法，抑制黄瓜中cshec2蛋白的表达。
38.作为优选，通过crispr/cas9技术在黄瓜中对cshec2蛋白的编码基因进行编辑，抑制所述编码基因的表达。
39.更优选的，crispr/cas9载体所编辑的靶点序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
40.该敲除植株中cshec2基因提前形成终止密码子而不能翻译成完整蛋白，进而使cshec2基因丧失功能。
41.更优选的，crispr/cas9载体的sgrna的序列如seq id no.5和seq id no.6所示。
42.基于上述方案，本发明的有益效果如下：
43.本发明首次发现，通过抑制cshec2蛋白的编码基因的表达，可以显著降低黄瓜果实表面的刺瘤密度，而不影响商品期果实的瓜长和瓜横径，可在改良黄瓜品种中得到应用，有望加快不同刺瘤密度市场需求的黄瓜新品质培育。
附图说明
44.图1为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2编辑植株靶点一的桑格测序色谱图比对的结果。
45.图2为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2编辑植株靶点二的桑格测序色谱图比对的结果。
46.图3为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2突变体的基因型。
47.图4为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2突变体的黄瓜果实表型图。其中a图为开花当天的果实；b图为开花当天果实的局部放大图；c图为开花当天果实的局部电镜扫描图；d图为花后10天的果实。
48.图5为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2突变体的黄瓜果实的数据统计图。其中a图为开花当天果实40mm2区域内的刺瘤密度统计；b图为花后10天果实的果长；c图为花后10天果实的果粗。
49.图6为所示实施例3中野生型wt、cshec2#1和cshec2#2突变体的黄瓜叶片的电镜扫描图。
具体实施方式
50.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
51.cshec2基因是csa2g285890基因的简称。pkse402g载体由中国农业科学院黄三文和杨丽老师惠赠(hu et al.,2017.engineering non
‑
transgenic gynoecious cucumber using an improved transformation protocol and optimized crispr/cas9 system.mol plant10:1575
‑
1578)。pcbc
‑
dt1t2模板质粒由中国农业大学陈其军老师惠赠(xing et al.,2014.a crispr/cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.bmc plant biol 14:327)。农杆菌eha105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。bsai内切酶和t4连接酶购自新英格兰生物实验室(new england biolabs)。
52.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
53.实施例1 cshec2基因的克隆
54.hecs转录因子在拟南芥的雌性生殖器官发育和分生组织调控中发挥重要作用，但是其再黄瓜中的功能还未知(gremski et al.,2007；schuster et al.,2014；schuster et al.,2015)。重要的是，发明人最近的研究成果表明，维管组织特异表达的bhlh转录因子csivp/hec3基因通过直接激活维管发育调节因子csyab5、csbp、csaux4的表达来调控叶片形状和株高(yan et al.,2020)，于是本发明对cshecs家族基因的功能正在进行系统研究。通过荧光定量和原位杂交技术发现cshec2在黄瓜果实表明的刺瘤组织有强烈的表达，于是对cshec2基因进行了克隆和功能分析。
55.1、实验材料的获得
56.黄瓜新泰密刺品种由中国农业大学张振贤教授实验室惠赠。苗期种植于光照培养箱，待黄瓜幼苗生长到第二片真叶展开，取幼嫩生长点，迅速置入液氮中冷冻，存于
‑
80℃冰箱备用。
57.2、rna的提取
58.采用普洛麦格公司试剂盒(eastep super isolation kit，promega)提取样品总rna。
59.3、cdna的获得
60.以上述步骤2中提取的rna为模板，采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(fastking gdna dispelling rt supermix kit，tiangen biotech)进行反转录合成cdna。
61.4、目的基因的扩增
62.以步骤3获得的cdna为模板，采用引物cshec2
‑
f和cshec2
‑
r进行pcr扩增，得到pcr产物长度为648bp的cshec2基因全长。引物序列如下：
63.cshec2
‑
f:5
’‑
atggacgatatcgacatcctca
‑3’
(seq id no.7)
64.cshec2
‑
r:5
’‑
tcaagactgcatttgcaaagaa
‑3’
(seq id no.8)
65.表1、目的基因cshec2编码区全长序列扩增体系
[0066][0067]
pcr扩增反应程序：预变性98℃1min；变性98℃10s，退火56℃15s，延伸72℃40s，34个循环；终延伸72℃5min。
[0068]
5、pcr产物的检测及回收
[0069]
扩增反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外灯下快速切下预期的目的条带。采用胶回收试剂盒进行凝胶回收，并将胶回收产物进行测序。
[0070]
实施例2 cshec2基因的crispr/cas9载体构建
[0071]
1、sgrna序列的靶点序列设计
[0072]
在cshec2基因上寻找并设计靶点序列，长度为19bp。
[0073]
靶点一核苷酸序列为：
[0074]5’‑
agtacatgaggagtgcaat
‑3’
(seq id no.3)
[0075]
其反向互补序列为：5
’‑
attgcactcctcatgtact
‑3’
(seq id no.5)
[0076]
靶点二核苷酸序列为：
[0077]5’‑
ggcgataaaggcgccgaag
‑3’
(seq id no.4)
[0078]
反向互补序列为：5
’‑
cttcggcgcctttatcgcc
‑3’
(seq id no.6)。
[0079]
2、crispr/cas9载体构建的引物设计及扩增
[0080]
依据上述步骤1中选择的靶点序列合成下列四条部分重叠的引物。以稀释100倍的pcbc
‑
dt1t2质粒为模板进行四引物pcr扩增。
‑
bsf/
‑
bsr为正常引物浓度；
‑
f0/
‑
r0稀释20倍。pcr体系及扩增程序参考实验案列一。四引物序列如下(由上至下依次为seq id no.9
‑
12)：
[0081]
cshec2
‑
dt1
‑
bsf:
[0082]5’‑
atatatggtctcgattgagtacatgaggagtgcaatgtt
‑3’
cshec2
‑
dt1
‑
f0:
[0083]5’‑
tgagtacatgaggagtgcaatgttttagagctagaaatagc
‑3’
[0084]
cshec2
‑
dt2
‑
r0:
[0085]5’‑
aaccttcggcgcctttatcgcccaatctcttagtcgactctac
‑3’
[0086]
cshec2
‑
dt2
‑
bsr:
[0087]5’‑
attattggtctcgaaaccttcggcgcctttatcgcccaa
‑3’
[0088]
3、载体的酶切
‑
连接体系建立
[0089]
将pcr扩增产物进行纯化回收，建立如下酶切
‑
连接体系，得到pkse402g
‑
crispr/cas9
‑
cshec2载体。
[0090]
表2、crispr/cas9载体构建的酶切
‑
连接体系
[0091][0092]
反应程序如下：37℃孵育2min，16℃孵育5min，循环重复50次，80℃孵育5min(对酶进行热失活)。
[0093]
4、大肠感受态转化及菌落测序
[0094]
将上述步骤3中连接好的载体转化大肠杆菌感受态dh5α，菌液涂布在含硫酸卡那霉素(50mg/l)的培养基平板上进行筛选。将得到的单菌落，使用引物u626
‑
f u629
‑
r＝726bp进行菌落pcr鉴定，选取符合预期目的条带的菌落用引物u626
‑
f和u629
‑
f进行载体测序。引物序列如下(由上至下依次为seq id no.13
‑
15)：
[0095]
u626
‑
f:5
’‑
tgtcccaggattagaatgattaggc
‑3’
[0096]
u629
‑
f:5
’‑
ttaatccaaactactgcagcctgac
‑3’
[0097]
u629
‑
r:5
’‑
agccctcttctttcgatccatcaac
‑3’
。
[0098]
实施例3利用crispr/cas9系统实现cshec2基因在降低果实刺瘤密度中的应用
[0099]
1、重组载体转化农杆菌eha105
[0100]
将上述实施例2中获得的测序正确的pkse402g
‑
crispr/cas9
‑
cshec2载体菌液通过质粒提取试剂盒进行质粒提取。提取获得的重组质粒pkse402g
‑
crispr/cas9
‑
cshec2通过热激转化法进行农杆菌感受态eha105的转化，得到重组农杆菌eha105(pkse401
‑
crispr/cas9
‑
cshec2)。具体转化步骤按照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌感受态转化说明书进行。
[0101]
2、农杆菌侵染遗传转化黄瓜
[0102]
将上述步骤1中的重组农杆菌利用农杆菌介导的黄瓜子叶转化方法进行黄瓜转基因，黄瓜品种为新泰密刺，具体遗传转化步骤参照2017文章所描述(hu et al.,2017)。分化后的再生芽在体式荧光显微镜下进行gfp荧光筛选后，获得t0代阳性转基因黄瓜植株。获得的植株经过驯化炼苗后，种植温室，通过人工授粉，收取后代种子。
[0103]
3、基因cshec2编辑的黄瓜植株获得
[0104]
将上述步骤2中的t0代植株在中国农业大学科技园温室进行繁殖后获得t1代种子，t1代种子选取无gfp荧光的种子进行育苗(无gfp荧光说明crispr/cas9载体已得到分离，获得不含转基因载体但被编辑的植株)，幼苗第一片真叶完全展开时，采用经典的ctab方法进行真叶基因组dna的提取。cshec2基因采用实施例1中的引物cshec2
‑
f和cshec2
‑
r进行pcr扩增克隆，得到的产物凝胶电泳后，经紫外灯初步观察有条带后，将不同株系的不同单株的pcr扩增凝胶产物进行桑格测序。根据公司测序结果与野生型的cshec2基因进行序列比对，对所获得的基因编辑植株进行基因型鉴定(图1，2，3)。图1和图2的测序色谱图分析
表明，利用crispr/cas9系统成功的实现了对黄瓜cshec2基因的编辑，获得两个完全突变体：cshec2#1(纯合等位基因，靶点一缺失2bp,靶点二缺失1bp，86氨基酸)和cshec2#2(纯合等位基因，靶点一缺失7bp,靶点二缺失2bp，33氨基酸)，两者都产生过早的终止密码子，导致产生截短的蛋白终产物，实现cshec2基因的功能缺失(图3)。
[0105]
4、基因cshec2编辑的黄瓜植株表型观察
[0106]
上述步骤3获得的t2代黄瓜基因cshec2编辑的植株在温室种植和生长发育后，进行表型观察和拍照。结果如图4所示，与野生型植株果实相比较发现：cshec2#1和cshec2#2敲除植株的开花当天的果实(图4中a，b，c)和商品期(花后10天)的果实(图4中d)都表明，刺瘤密度明显减少，但形态上未发生明显变化。统计上分析发现果实表明的刺瘤密度的确显著的下降(图5中a)，重要的是商品果的果长(图5中b)和果粗(图5中c)统计上没有显著性差异。此外，我们也对植株的叶片进行了观察，发现cshec2#1和cshec2#2敲除植株的叶片正面和背面的刺均没有明显数目和形态上的变化(图6)。以上结果表明基因cshec2特异性调控果实刺瘤的起始，并且敲除后在不影响果实果长和果粗及叶片表面刺的情况下能够显著地减少刺瘤的密度。
[0107]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。