一种新型脑靶向穿膜肽及其在脂质体中的应用的制作方法

一种新型脑靶向穿膜肽及其在脂质体中的应用
1.技术领域 本发明涉及计算模拟设计多肽和药学中纳米给药系统，尤其涉及脑靶向脂质体给药系统的设计和构建，属于生命科学和药学技术领域。


背景技术：

2.由于血脑屏障(bbb，blood-brain barrier)的存在，限制了超过98％的小分子及近乎100％的大分子通过血液进入脑组织
1.。受体介导是目前研究最为广泛的一种药物递送转运方式，其凭借分子识别特异性可增加药物脑靶向，但存在受体饱和性以及药物入胞后难以溶酶体逃逸的限制，阻碍了药物的脑部递送
2.。除了受体介导，利用静电相互作用的吸附介导也是一种促进药物跨bbb转运的有效方式。细胞穿透肽(cell penetrating peptides，cpp)在生理条件下带有正电荷，具有细胞穿透和溶酶体逃逸能力，是一种有潜力的吸附介导多肽，但其缺乏选择性
3.。将受体介导与吸附介导相结合，构建双重介导脂质体
4.，取长补短，可同时实现药物靶向性与溶酶体逃逸能力，提高药物治疗指数。前期，我们发明了一种转铁蛋白和细胞穿透肽双重修饰的脑靶向脂质体，申请并获得了专利授权(《靶向脑胶质瘤的双重修饰脂质体给药系统的制备和应用》，专利号：zl201510197807.3)，为脑胶质瘤的治疗提供了新策略。
3.研究表明，bbb上除了转铁蛋白受体，还高表达乙酰胆碱受体(nachr)
5.。狂犬病毒糖蛋白
6.的结构域(残基175-203)中29个氨基酸所构成的rvg29与nachr具有较高的结合能力，已在脂质体
7.、壳聚糖
8.、外涵体
9.、纳米粒
10.等多种给药系统得到应用，对于药物的脑递送起到了重要作用。
4.但目前存在的问题是(1)rvgp29具有29个氨基酸，其制备合成困难、产量低、体内应用易产生免疫原性，亟需发明一种与乙酰胆碱受体结合能力更强、氨基酸数目更少的短肽，应用于脑靶向递药系统的修饰。(2)除了我们之前发明中所设计的受体介导多肽和吸附介导多肽同时修饰脂质体构建双重介导脂质体之外，将脑靶向多肽与多聚精氨酸直接偶联是否也是一种双重介导方式？以及它的作用机制如何？这些问题尚不清楚，亟需在分子水平阐明这种直接偶联方式形成的单一多肽分子与bbb的作用机制，发明一种同时具有脑靶向和细胞穿透及溶酶体逃逸能力的新型多肽，为其在递药系统中的应用提供更广泛的前景。
5.2013年martin karplus，michael levitt和ariech warshel因其在“复杂化学系统中的多尺度模拟”的贡献被授予诺贝尔化学奖。多尺度模拟可依次划分为量子力学(quantum mechanics，qm)计算、全原子分子动力学(all-atom molecular dynamics，aamd)模拟、粗粒化动力学(coarse-grained molecular dynamics，cgmd)
11.、耗散动力学模拟(dissipative particle dynamics simulation，dpd)
12.等，研究的对象尺度也从微观逐步放大到介观，可以对不同精度的分子作用进行分析，为药物制剂在体内外的研究拓展了新的方法和思路。
6.脑靶向新型药物递送系统中的分子作用涉及配体与受体、配体与载体、受体与载体等多种相互作用。本发明应用全原子、粗粒化等多尺度计算模拟，结合虚拟突变、分子对接、全原子及粗粒化分子动力学等计算研究手段，以rvg29为模板设计得到了与乙酰胆碱受
dynamics simulation of water diffusion in the presence of carbon nanotubes[j].j mol graph model，2015，62：69-73.
[0019]
12.tan h，wang w，yu c，et al.dissipative particle dynamics simulation study on self-assembly of amphiphilic hyperbranched multiarm copolymers with different degrees of branching[j].soft matter，2015，11(43)：8460-8470.


技术实现要素：

[0020]
本发明的目的之一是以rvg29为模板设计了与血脑屏障上乙酰胆碱受体有更好结合能力的短肽，命名为rvgp；
[0021]
本发明的目的之二是将rvgp与多聚精氨酸偶连，通过优化精氨酸的数目，得到一种新的多功能肽，命名为脑靶向穿膜肽(peptides targeting to brain，ptb)；
[0022]
本发明的目的之三提供一种制备双重介导脂质体给药系统的方法；
[0023]
本发明的目的之四提供一种最优双重介导脑靶向脂质体的结构组成和修饰密度，以达到高效低毒治疗中枢系统疾病尤其脑胶质瘤的目的。
[0024]
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0025]
针对现阶段脂质体脑部递送系统存在的靶向效率较低的问题，本发明人通过锐意研究发现，以rvg29为模板设计的短肽rvgp具有良好的靶向能力；在此基础上，用九聚精氨酸(r9)和rvgp偶连又获得一种新的功能肽rvgpr9，其具有良好的脑靶向性和穿膜性，并具备独特的细胞摄取内化机制，因此，将其命名为脑靶向穿膜肽-ptb。
[0026]
在技术上，采用虚拟突变、分子对接、全原子及粗粒化分子动力学等计算研究手段，对短肽设计、其在给药系统中的应用等进行了探究，从理论上完成了脑靶向多功能肽的设计以及双重介导脂质体的合理化构建工作，解决了现有的脂质体制剂脑靶向性效率低的技术问题。经细胞和动物实验验证，本发明所提出的多功能肽具有独特的细胞内化机制以及所构建的双重介导脂质体对于脑胶质瘤的治疗具有很好的效果，从而完成了本发明。
[0027]
1.该发明的创新点之一：设计发明了一种与乙酰胆碱受体结合能力更强的短肽。
[0028]
血脑屏障的存在限制了药物在脑组织的应用，为实现脑部递送，利用受体介导的靶向配体的设计是影响脑靶向给药系统靶向能力的重要因素。bbb上丰富表达的nachr受体是常用脑部递送的靶标之一，rvg29(ytiwmpenprlgmscdiftnsrgkraskg)可以特异性结合bbb上nachr。我们以rvg29为模板，研究了其与nachr单体的分子动力学模拟，根rvg29与nachr单体的关键作用位点发现rvg29中关键氨基酸，并对其进行分析和虚拟突变方法，获得了与nachr单体结合能力更强的短肽，将其命名为rvgp(序列为n-cdgfcssrgkr-c)。通过实验证实其修饰脂质体具有良好的靶向系数，其在脑靶向给药系统中作为靶向多肽有较强的潜在价值。
[0029]
2.该发明的创新点之二：设计发明了一种同时具有脑靶向和穿膜功能的脑靶向穿膜肽。
[0030]
将受体介导与吸附介导结合构建双重介导的脂质体，在受体介导下，发挥细胞穿透肽对靶细胞的穿透能力和溶酶体逃逸功能。从这一思路出发，我们将通过nachr受体介导入胞的短肽rvgp和与通过吸附介导入胞的细胞穿透肽直接偶联为成单一多肽分子，通过研究发现其同时具备脑靶向性及穿膜性，是一种有极大潜质的脑靶向递药系统的理想配体。
以脂质体为例，将其修饰在长循环脂质体上，构建了一种全新的高效脑靶向递药系统。
[0031]
在技术上，采用分子动力学模拟研究了不同精氨酸数目对rvgp与nachr结合能力的影响，结果表明rvgp偶联精氨酸可增加rvgp与nachr的结合作用，其中r9促结合能增加作用最强，将rvgp与九聚精氨酸偶连可构成一种新的肽即rvgpr9，将其命名为脑靶向穿膜肽(peptides targeting to brain，ptb)，其具有良好的靶向能力，修饰的脂质体具备良好的靶向系数。
[0032]
3.该发明的创新点之三：在于所述双重介导脂质体的最优结构组成和修饰密度。
[0033]
载体的设计是影响递药系统靶向能力发挥的关键因素，本专利中，我们通过分子对接研究了ptb与α7-nachr五聚体蛋白的结合位点并预测了ptb修饰脂质体的最佳密度为2％，与细胞摄取实验相一致。我们利用粗粒化分子动力学模拟对ptb修饰的脂质体上最佳peg linker分子量进行了考察，结果表明最优peg linker的分子量为3.4k。
[0034]
4.该发明的创新点之四：在于所述ptb修饰的双重介导脂质体具有全新的细胞内化机制，是一种新型的脑递送载体。
[0035]
我们用所发明的ptb肽直接修饰脂质体所获得的ptb-ssl在bmvec细胞摄取显著高于所发明的pvgp肽和九聚精氨酸r9两个多肽共同修饰的脂质体rvgp-r9-ssl(p＜0.05)，且细胞摄取竞争抑制结果表明两者细胞摄取机制不同：ptb-ssl主要通过受体介导和小窝蛋白介导的方式进入细胞，rvgp-r9-ssl主要通过受体介导和网格蛋白介导的bmvec细胞内转运；此外两者进入细胞后在细胞器内的转运途径也不相同：ptb-ssl主要依靠内质网途径转运，rvgp-r9-ssl主要通过溶酶体途径转运。本发明的ptb肽修饰的给药系统独特的内化机制与一般的多肽修饰脂质体存在明显差异，是一种全新的脑靶向递送方式和机理。
[0036]
5.该发明的创新点之四：在于所述ptb修饰的双重介导脂质体对于脑胶质瘤有更好的药效。
[0037]
用本发明的ptb修饰脂质体装载抗肿瘤药物(如阿霉素)，其在大鼠脑胶质瘤c6细胞ic
50
为10.63
±
2.95μg
·
ml-1
，显著低于临床用的阿霉素脂质体剂型(18.29
±
2.56μg
·
ml-1
)；此外，动物体内试验表明其治疗原位脑胶质瘤的相对日均肿瘤增长率t/c％为0.96％，显著低于细胞毒药物抗肿瘤药效评价标准(40％)(评价标准)，表明其对于脑胶质瘤的治疗具有光明的前景。
[0038]
本发明与现有技术相比，创新性在于：
[0039]
(1)利用rvg29的脑靶向性，以其为模板，通过虚拟突变及分子动力学模拟的计算研究手段，发明了一种与乙酰胆碱受体结合能力更强的短肽pvgp，其氨基酸数目减少了18个，降低了多肽的免疫原性，以及合成更加简单，成本更加低廉，应用更加广泛。
[0040]
(2)在本发明rvgp基础上，创造性将rvgp与多聚精氨酸偶联，应用分子动力学研究手段优化得到了一种新型功能肽，因其同时具有脑靶向能力和细胞穿透性。因此，将其命名为脑靶向穿膜肽(peptides targeting to brain，ptb)。
[0041]
(3)与目前通用的细胞实验优化脂质体中多肽修饰密度和分子量的技术比较，本发明采用分子对接和粗粒化计算模拟手段，在原子及分子尺度层面进行研究，获得了ptb修饰脂质体的结构组成。这种技术高效、成本低、准确性强，可以分析递药系统中的分子相互作用提供关键物理化学信息，为实验筛选优化新型递送系统提供理论依据。
[0042]
(4)与双配基修饰脂质体(中国专利zl201510197807.3)采用转铁蛋白tf为靶向分
子，精氨酸残基短肽r9共同修饰的脑靶向脂质体(tf-r9-ssl)相比较，单一肽ptb修饰的脂质体(ptb-ssl)的制备工艺更加简单，避免了r9和阿霉素(dox)的相互作用，质量更加可控。
[0043]
(5)与现有的脑靶向脂质体相比较：ptb-ssl同时具有良好的脑靶向性和细胞穿透性，具有全新的独特的细胞内化机制和细胞内转运途径，其主要通过受体介导和小窝蛋白介导的方式入胞，内质网途径转运，与目前其他脑靶向递药系统的溶酶体途径转运明显不同。这种内质网转运途径避开了溶酶体途径，具有更好的药效。
附图说明
[0044]
图1.rvgp短肽的设计。(a)rvg29-nachr复合物构象；(b)rvg候选肽的氢键分析；(c)rvg4-nachr复合物构象。
[0045]
图2.ptb短肽的设计：ptb与nachr关键氨基酸相互作用。
[0046]
图3.ptb在脂质体上的修饰密度。(a)ptb-α7 nachr五聚体复合物构象；(b)ptb修饰脂质体与受体结合示意图；(c)ptb修饰密度对细胞摄取的影响。
[0047]
图4.ptb与脂质体偶联的peg链长优化。(a)peg单体数目对ptb暴露于脂质体膜外比例的影响，i：22peg；ii：45peg；iii：78peg；(b)ptb与各组分接触的表面积相对比例；(c)rvgpr9修饰对peg coating和peg linker的平均首尾距离的影响。
[0048]
图5.ptb修饰脂质体的细胞摄取和内化机制。(a)包载cou-6脂质体在bmvec细胞上摄取的荧光强度均值；(b)抑制剂对3种包载cou-6脂质体在bmvec细胞上摄取的影响；(c)包载cou-6脂质体与bmvec细胞器(溶酶体和内质网)的共定位；(d)脂质体与溶酶体和内质网的共定位率的皮尔森系数值
[0049]
图6.ptb修饰脂质体治疗脑胶质瘤的动物生存曲线。
具体实施方式
[0050]
实施例1 结合乙酰胆碱受体的脑靶向肽rvgp的设计
[0051]
以rvg29(ytiwmpenprlgmscdiftnsrgkraskg)为模板，对rvgp29与乙酰胆碱受体(α7-nachr)亚基单体进行分子对接及分子动力学模拟，通过分析rvg29特异性结合nachr的动态过程，确定二者的结合区域和关键结合位点，然后通过虚拟突变的方法变换氨基酸的类型、设计多个候选突变肽再进行动力学模拟，通过氨基酸结合能贡献最终优化获得与nachr有更强相互作用的短肽rvgp。
[0052]
(1)分子的选择及构建
[0053]
从pdb数据库上获取α7-nachr五聚体(pdb id：3sq6)的三维结构，以及rvg蛋白(pdb id：3nfk)中rvg29序列信息。使用蛋白质对接程序在线服务zdock将rvg29与nachr单体进行刚性对接，分析确定rvg29与nach结构最优的8种复合物模型。
[0054]
(2)rvg29与nachr的动力学模拟
[0055]
利用软件对获得的8种复合物模型进行32ns全原子分子动力学模拟，确定结合过程最稳定、结合作用最强的rvg29-nachr复合物模型，继而进行能量分解，得到nachr上四段氨基酸结合区域，rvg29上两段结合区域。通过作用力分析，发现rvg29与nachr的相互作用力主要来自于疏水氨基酸之间的疏水相互作用以及带有电荷的氨基酸之间的静电相互作用。rvg29与nachr有强相互作用的氨基酸序列段为头部1-4号和尾部14-24
号氨基酸(如附图1a所示)，将两段氨基酸连接，构成rvg29模拟初肽(rvg29mp)，其序列为ytiwcdiftnsrgkr。
[0056]
(3)虚拟突变优化肽链
[0057]
依据rvg29mp周围nachr氨基酸残基的官能团性质，考虑极性，亲核性，电荷性，亲疏水性等，对初肽(rvg29mp)上第3，7，9，10号残基进行突变，优化设计8条突变肽(rvg1-rvg8)，其序列如表1所示。
[0058]
表1 rvg29mp虚拟突变后的8种多肽的序列
[0059][0060][0061]
利用软件对上述8种短肽与nachr进行40ns的全原子分子动力学模拟探究其相互作用并确定最佳短肽序列。结果表明突变肽链rvg1，rvg3，rvg4和rvg5与nachr的结合过程更为稳定。进一步能量分解发现rvg4与nachr之间的氢键数目最多、稳定程度最好(如附图1b所示)，rvg4与nachr的相互作用主要体现在phe可以与nachr的ile侧链和val侧链形成范德华力；rvg4上的第8位arg在nachr上第17及87号两个asp周围，由于arg与asp所带电荷正负不同，存在静电相互作用，其复合物构象如附图1c所示。
[0062]
因此，相较其他候选肽，rvg4与nachr之间的相互作用最为稳定，将其命名为rvgp，序列为n-cdgfcssrgkr-c。
[0063]
【结论】：以rvg29为模板设计了与乙酰胆碱受体结合能力更强的短肽rvgp，其序列为n-cdgfcssrgkr-c，是一种具有潜力的应用于中枢神经系统的靶向分子。
[0064]
实施例2 脑靶向穿膜肽ptb的设计
[0065]
利用血脑屏障(bbb)上药物转运方式的特点，将受体介导和吸附介导相结合有利于药物的跨膜转运和溶酶体逃逸。除了受体的配体和细胞穿透肽两种多肽联合使用制备双配基修饰的脂质体等递药系统之外，将受体的配体和细胞穿透肽直接偶联也可能是一种新颖的双重介导递送方式。在本发明中，我们以多聚精氨酸作为细胞穿透肽，采用全原子分子动力学模拟探讨了精氨酸数目对rvgp与nachr结合能力的影响，通过结合能分析，确定精氨酸的最优数目为9个，由此发明了一种新型具有脑靶向和穿膜多功能的多肽rvgpr9，其序列为n-cdgfcssrgkrrrrrrrrr-c，将其命名为脑靶向穿膜肽(peptides targeting to brain，
ptb)。
[0066]
(1)rvgprx与nachr动力学模拟
[0067]
利用sybylx软件分别构建不同精氨酸数目的rvgprx模型(x＝3，5，7，9，11，13)。利用软件构建rvgprx(x＝3，5，7，9，11，13)与nachr复合物模型并进行40ns全原子分子动力学模拟。通过结合能分析，对结合作用最强的rvgprx-nachr复合物模型进行氨基酸结合能贡献分析并确定最佳精氨酸数目。
[0068]
结果表明，精氨酸的加入提高了rvgp与nachr之间的静电相互作用，随着精氨酸数量增加，导致rvgprx与nachr之间的范德华相互作用增加，从而rvgprx与nachr结合能升高；但随着精氨酸数目的增加到11时，结合能降低，这可能是由于电荷带来的极性效应增强，导致结合不稳定。当精氨酸数目达到9时，整个体系的能量贡献最强，体系最为稳定。rvgpr9与nachr关键氨基酸相互作用如附图2所示。rvgpr9尾部r9氨基酸序列的第4个arg和nachr上的第15号asn及第22号gln间形成氢键以及存在疏水相互作用。
[0069]
(2)细胞学实验验证
[0070]
建立bbb体外模型，采用fitc标记ptb和rvg29r9，通过荧光分光光度法测定结果表明ptb在bbb体外模型上的通透系数是rvg29r9的1.26倍。ptb修饰脂质体ptb-ssl在丰富表达nachr的bmvec和neuro 2a的细胞摄取分别是rvgp修饰脂质体rvgp-ssl的1.8和1.6倍，而在不表达nachr的hela的细胞摄取和rvgp-ssl相当，说明rvgp与r9直接偶联与nachr的结合能力强于rvgp，在脑靶向中具有更好的受体结合能力。
[0071]
【结论】：通过全原子计算模拟发明一种脑靶向穿膜肽ptb，其序列为n-cdgfcssrgkrrrrrrrrr-c，其与乙酰胆碱受体结合能力更强，在双重介导脑靶向给药系统中作为靶向穿膜肽有较强的潜在价值。
[0072]
实施例3 ptb修饰脂质体的最优密度
[0073]
ptb在脂质体表面的修饰密度是影响其靶向能力的关键参数。本专利通过patchdock，firedock及tox dock三种对接软件的联合使用研究了ptb与α7-nachr五聚体复合物的结合位点，通过和脂质体表面ptb间距离的比较分析，得到了ptb在脂质体表面修饰的最佳密度为2％，而且发现其特点为脂质体上多个ptb与一个乙酰胆碱受体蛋白相结合，而非1个ptb与一个受体蛋白的结合。
[0074]
(1)分子对接
[0075]
使用实施例1中α7-nachr五聚体的三维结构及所得ptb最佳分子构象pdb文件作为对接初始结构。首先利用patchdock初步寻找ptb在α7-nachr五聚体上潜在的结合位点，将所得结果按照几何形状互补性分数进行排序，然后在以结合位点位于五聚体膜外侧及空腔内的溶剂化区域的构象进行进一步筛选，最后，利用firedock进行二次对接，tox dock进行第三次对接，精确寻找ptb在α7-nachr五聚体上潜在的结合位点，得到能量最低构象，如附图3a所示。
[0076]
(2)ptb修饰脂质体的最优密度
[0077]
计算ptb与α7-nachr五聚体作用的5个位点间距离约与ptb的修饰密度分别为1％，2％，3％，4％，6％时，ptb分子间的距离(如表2所示)比较，发现ptb密度为2％时，ptb分子间距与动力学模拟所得结合位点距离相符(如附图3b所示)。另外，细胞摄取实验结果表明，ptb修饰脂质体在bmvec细胞达到最大摄取率时ptb的修饰密度为2％(如附图3c所
示)。
[0078]
表2 ptb分子间距离/随其在脂质体修饰密度d％的变化
[0079][0080]
【结论】：ptb在脂质体表面的最优修饰密度为2％，且脂质体表面多个ptb与一个α7-nachr五聚体蛋白相结合，促进脂质体的跨bbb转运。
[0081]
实施例4 ptb修饰脂质体中peg偶联最优分子量
[0082]
主动靶向脂质体中的多肽依靠peg偶联修饰于脂质体表面，其中peg的分子量(即链长)直接影响多肽与受体蛋白的结合能力。本发明建立ptb和peg修饰脂双层粗粒化模型，通过探究peg和ptb分子相互作用，确定最佳peg偶联的分子量为3.4k da。
[0083]
(1)ptb和peg修饰脂双层粗粒化模型的构建
[0084]
参考ptb全原子模型，基于martini v2.2的蛋白质力场得到粗粒化ptb的结构文件和拓扑信息；构建dspe-npeg-ptb(n＝22，45，78)的粗粒化模型；使用packmol搭建不同peg linker分子量下2％ptb修饰的脂双层膜体系，其中peg总修饰密度为8％。体系中各分子比例为dspe-npeg-ptb(n＝22，45，78)∶dspe-45peg∶dspc＝2∶6∶92。每侧含有576个dspc个分子，并将dspe-peg、dspe-npeg-ptb约束在单侧膜。
[0085]
(2)ptb修饰的peg脂双层的动力学模拟
[0086]
使用gromacs软件的martini力场进行500ns模拟。通过研究peg linker相对分子量对ptb靶向能力的影响、ptb肽对于peg构象的影响(即对长循环能力的影响)、ptb与脂双层的相互作用确定最佳peg linker分子量。
[0087]
结果表明：随peg linker分子量增加，ptb暴露于peg水化层外的比例增加，ptb的正电性氨基酸与负电性磷脂磷酸基间静电相互作用减少，当peg单体数为78时，ptb的密度分布峰暴露在peg水化层外的比例增加至97％(如附图4a所示)，溶剂可及的比例上升至0.69，而peg(包括peg coating和peg linker)接触的ptb表面积下降至0.31(如附图4b所示)。说明ptb基本完全暴露于peg水化层外侧，且受peg掩盖的部分减少，靶向能力得到充分发挥。同时通过对各体系中peg coating的首尾距离进行考察证实ptb的修饰对peg coating的构象均无显著影响(如附图4c所示)，脂质体仍具有较好的长循环性能。
[0088]
【结论】：利用粗粒化分子动力学模拟对ptb修饰的脂质体上最佳peg linker分子量进行了考察，结果表明最优peg linker的分子量为3.4k，即peg单体数78个。
[0089]
实施例5 ptb修饰脂质体的细胞摄取和内化机制
[0090]
(一)ptb修饰脂质体(ptb-ssl)及双配基修饰脂质体(rvgp-r9-ssl)制备及基本性质
[0091]
1.实验方法：
[0092]
分别精密称量适量的大豆磷脂spc、胆固醇chol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-ptb复合物、香豆素-6(spc∶chol∶dspe-peg2000∶dspe-peg2000-ptb＝100∶50∶6∶2mol/mol；coumarin-6∶spc＝1.5∶2000，w/w)用chcl3充分溶解，置于涡旋振荡器上振荡混合均匀后，37℃水浴旋转蒸发，直至形成一层均匀的脂质薄膜，继续抽真空30min，尽可能除去残留的三氯甲烷。随后加入2ml pbs溶液(ph
＝7.4，0.1mol/l)，涡旋，37℃的水浴中超声30min直至水化完全。即得spc终浓度为2mg/ml，cou-6终浓度为1500ng/ml的2％ptb-ssl(cou-6)。
[0093]
2％rvgp-4％r9-ssl(cou-6)制备方法与2％ptb-ssl(cou-6)相同，处方为spc∶chol∶dspe-peg2000∶dspe-peg2000-rvgp∶dspe-peg1000-r9＝100∶50∶2∶2∶4mol/mol∶coumarin-6∶spc＝1.5∶2000，w/w。
[0094]
采用g50柱分离法测定香豆素-6包封率，采用zetasizer nano zs动态光散射仪分别测定粒径、粒子的多分散系数pdi和zeta电位。
[0095]
2.实验结果
[0096]
2％ptb-ssl和2％rvgp-4％r9-ssl的包封率均大于95％，粒径值分别为105.1
±
1.23nm和103.9
±
1.79nm，zeta电位分别为-4.32
±-
0.13mv和-4.68
±-
0.24mv，两种脂质体的粒径和zeta电位值无显著性差异，pdi均接近0.2说明两种脂质体粒径均匀，分散性好。
[0097]
(二)ptb-ssl及rvgp-r9-ssl在bmvec细胞的摄取
[0098]
1.实验方法：
[0099]
将2％ptb-ssl(cou-6)及2％rvgp-4％r9-ssl(cou-6)用无血清的dmem培养基，稀释至磷脂终浓度0.2mg/ml，cou-6终浓度为150ng/ml备用，然后将备用液过0.22μm的无菌微孔滤膜除菌。
[0100]
将融合至90％的达到对数生长期的bmvec细胞，用胰酶消化后接种于明胶预包被的六孔细胞培养板中(接种密度为1
×
106cells/孔)于5％co2，相对湿度为90％的37℃恒温培养箱中培养24h。待bmvec细胞贴壁生长后，吸出培养液，用pbs缓冲液(ph＝7.4)清洗3遍，依次向各孔中加入上述过膜除菌的脂质体的备用液1.8ml，以pbs孔为空白对照，每个样品重复三孔。随后将该六孔板置于37℃恒温培养箱中培养2h。
[0101]
2h后吸出孵育液，用预冻至4℃的pbs清洗3遍，终止细胞摄取。随后用胰酶消化制备单细胞悬液，并将其全部转移至15ml离心管中1000rpm离心5min，弃去上清后加入pbs缓冲液使细胞重悬后于1000rpm下离心5min，反复三次。使用0.5mlpbs缓冲液重悬细胞，过300目细胞筛后，用流式细胞仪测定各组bmvec细胞中cou-6的荧光强度(i)。每次检测收集10000个细胞，检测的波长为：激发波长(λex)466nm，发射波长(λem)504nm。
[0102]
2.实验结果
[0103]
rvgp-r9-ssl和ptb-ssl的bmvec细胞摄取分别是空白脂质体的2.5和3.0倍(如附图5a所示)，单配基脂质体ptb-ssl在bmvev细胞摄取显著高于双配基脂质体rvgp-r9-ssl(p＜0.05)。
[0104]
(三)ptb-ssl及rvgp-r9-ssl在bmvec细胞内化机制
[0105]
1.实验方法：
[0106]
(1)细胞摄取竞争抑制
[0107]
将抑制剂氯丙嗪、菲律平、叠氮钠、rvg29用不含酚红的dmem培养基配制成终浓度分别为30μmol/l，10μmol/l，0.5mmol/l，0.1mg/ml的备用液。将包载香豆素的脂质体ssl(cou-6)，ptb-ssl(cou-6)与rvgp-r9-ssl(cou-6)用不含酚红的dmem培养基稀释为spc终浓度为0.2mg/ml，cou-6终浓度为150ng/ml的受试液。抑制剂备用液和受试药液均利用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
[0108]
bmvec细胞以1
×
105/孔密度，接种在明胶预包被的六孔细胞培养板中，使用bmvec
细胞专用培养基培养24h后移去培养基，加入抑制剂备用液与细胞共孵育30min后，移去抑制剂溶液，再加入含抑制剂的ssl(cou-6)，ptb-ssl(cou-6)或rvgp-r9-ssl(cou-6)溶液孵育1h。以不加入抑制剂的脂质体为对照组。
[0109]
孵育1h后移去药液，用预冻至4℃的pbs清洗3遍，终止细胞摄取。随后经胰酶消化并制备单细胞悬液，将其全部转移至15ml离心管中1000rpm下离心5min，弃去上清并加入pbs缓冲液重悬细胞，再次于1000rpm下离心5min，反复三次。使用0.5mlpbs缓冲液重悬细胞后过300目细胞筛，用流式细胞仪测定各组bmvec细胞中cou-6的荧光强度(i)。每次检测收集10000个细胞，检测的波长为：激发波长(λex)466nm，发射波长(λem)504nm。
[0110]
利用如下公式计算抑制率：
[0111][0112]
其中i
in
给为抑制剂组的荧光强度，i
con
为对照组的荧光强度。
[0113]
(2)bmvec细胞器共定位实验
[0114]
将ptb-ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)用无酚红的f10培养基稀释至spc终浓度为0.2mg/ml，cou-6终浓度为150ng/ml，之后用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
[0115]
将融合至90％的c6细胞消化为单细胞悬液，以1
×
104/孔的密度接种于激光共聚焦小皿中于5％co2，37℃孵箱中培养24h。待细胞贴壁稳定生长后取出。弃去原有培养基，加入无菌pbs缓冲液清洗3次，分别加入上述用无酚红f10培养基稀释的脂质体溶液1ml，置于5％co2，37℃孵箱中培养4h。分别于给药后1，2，4h取出样品染色后用激光共聚焦显微镜观察脂质体制剂与c6细胞器共定位情况。cou-6激发波长为466nm，er-tracker red激发波长为587nm，lyso-tracker red激发波长为576nm。采用lasx软件处理数据，计算皮尔森系数(pearson correlation coefficient，pcc)。
[0116]
染色的具体步骤如下：对于溶酶体染色，给药后0.5h，1.5h，3.5h后分别向小皿中加入lysotracker red(100nm)，37℃孵箱中孵育30min；对于内质网的染色，给药后0.75h，1.75h，3.75h分别向小皿中加入er-tracker red(0.5ug/ml)，37℃孵箱中孵育15min。在培养结束后，用无菌pbs缓冲液洗涤3次，加入细胞组织固定液固定15min，用无菌pbs缓冲液清洗3次，加入hoechst33342标记细胞核10min，用无菌pbs缓冲液清洗3次，加入甘油∶pbs(9∶1)封片。
[0117]
2.实验结果
[0118]
(1)细胞摄取机制
[0119]
抑制剂对ssl(cou-6)，ptb-ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)在bmvec细胞的摄取抑制率(如附图5b所示)，可得：叠氮化钠(能量抑制剂)对三种脂质体的摄取均有显著影响，三种脂质体的摄取均需要能量；rvg29(nachr竞争性抑制剂)显著抑制了ptb-ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)的细胞摄取，但对ssl(cou-6)影响较小，ptb-ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)的细胞摄取与nachr介导有关；氯丙嗪(网格蛋白抑制剂)显著抑制了ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)的细胞摄取，而对ptb-ssl(cou-6)影响较小，ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)的细胞摄取与网格蛋白有关；菲律平(小窝蛋白抑制剂)显著抑制了ptb-ssl(cou-6)的细胞摄取，而对ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)影响较小，ptb-ssl(cou-6)的细胞摄取与小窝蛋白有关。
[0120]
终上所述，配体的修饰改变了脂质体进入bmvec细胞的方式，并且配体的连接方式也会影响脂质体进入细胞的方式。ssl(cou-6)主要通过网格蛋白介导的方式进入细胞，而ptb-ssl(cou-6)主要通过受体介导和小窝蛋白介导的方式进入细胞，rvgp-r9-ssl(cou-6)则主要通过受体介导和网格蛋白介导的方式进入细胞。且这三种脂质体都具有能量依赖性。
[0121]
(2)bmvec细胞器共定位
[0122]
ssl(cou-6)、ptb-ssl(cou-6)和rvgp-r9-ssl(cou-6)与bmvec细胞器(溶酶体和内质网)的共定位(如附图5c)结果可见：ssl(cou-6)给药后1，2，4小时，与溶酶体的共定位率逐渐增加，给药后ssl(cou-6)主要经溶酶体途径进行转运，在4小时内没有出现溶酶体逃逸，整体内质网共定位率低于与溶酶体共定位率；ptb-ssl(cou-6)与内质网共定位率随孵育时间的增加而增加，与溶酶体的共定位率较低，4小时内与溶酶体共定位没有显著变化，ptb-ssl(cou-6)主要通过内质网途径进行转运，绕开溶酶体途径；rvgp-r9-ssl(cou-6)与溶酶体共定位率先增加后减少，2小时达到峰值，且与溶酶体的共定位率高于与内质网的共定位率，rvgp-r9-ssl(cou-6)主要通过溶酶体途径进行转运，且具有溶酶体逃逸功能。
[0123]
脂质体与溶酶体和内质网的共定位率的皮尔森系数值(如附图5d所示)，结果可见：ssl、rvgp-r9-ssl与溶酶体定位率明显高于内质网，主要通过溶酶体途径转运，而ptb-ssl与内质网共定位率显著低于溶酶体，不同于另两种脂质体，ptb-ssl主要依靠内质网途径转运。
[0124]
【结论】单配基脂质体ptb-ssl在bmvev细胞摄取显著高于双配基脂质体rvgp-r9-ssl(p＜0.05)，且ptb-ssl(cou-6)主要通过受体介导和小窝蛋白介导的方式进入细胞，经内质网进行胞内转运，而rvgp-r9-ssl(cou-6)主要通过受体介导和网格蛋白介导，经溶酶体途径转运。
[0125]
实施例6 ptb修饰脂质体对脑胶质瘤的治疗效果
[0126]
采用脑立体定位仪对裸鼠脑部非功能区进行定位，注射高浓度c6细胞悬液制备裸鼠脑胶质瘤原位模型。动物造模后均匀分组，以生理盐水、阿霉素长循环脂质体为对照，考察ptb-ssl(dox)的抗脑胶质瘤药效。
[0127]
1.实验方法：
[0128]
(1)ptb-ssl(dox)细胞毒
[0129]
将融合达到90％的c6细胞消化后，计数，按104cells/孔的密度接种于96孔板中，每孔200μl。将96孔板置于相对湿度为90％、5％co2的37℃恒温培养箱中培养24h后，移去培养液，加入200μl上述受试药液，平行重复六次，继续培养24h。取出96板，每孔中加入50μl的50％tca溶液，4℃下固定1h后移除tca。使用去离子水清洗5遍后在37℃下烘干。随后向每孔中加入100μl 0.4％srb的1％醋酸溶液，室温染色30min，移除srb，用1％的醋酸溶液清洗5遍，于37℃下烘干。每孔加入200μl浓度为10mm的tris缓冲液，37℃震荡30min后在540nm处测定溶液的吸光值(od值)。按照如下公式计算细胞存活率sr％：
[0130][0131]
其中，odtest为实验组的吸光度，odcontrol为阴性对照组的吸光度。以细胞存活率sr％对dox浓度作图，使用spss软件计算不同制剂的ic50(μg
·
ml-1
)。
[0132]
(2)ptb-ssl(dox)对原位脑胶质瘤的治疗
[0133]
制备wistar大鼠c6脑胶质瘤模型，肿瘤动物模型均匀分三组(阴性对照组：生理盐水溶液(ns)，载药组：ssl(dox)组，ptb-ssl(dox)组，其中阿霉素浓度为0.5mg/ml)。每组5只。造模15天后，尾静脉注射给药，给药剂量为5mg dox
·
kg-1
，隔一天给药一次，即每两天给药一次，共给药3次。每次给药后称取体重，并观察模型动物生存状态。药效考察期间死亡大鼠，剥离脑部肿瘤，精确称量肿瘤重量，同时精确测量肿瘤横纵长度；给药3次后将尚存活的大鼠脱颈处死，剥离脑部肿瘤，精确测量肿瘤横纵长度。并根据下述公式计算相对肿瘤体积：
[0134][0135]
a为肿瘤长度(mm)，b为肿瘤宽度(mm)
[0136]
药效学采取生存率(survival ratio％，sr％)、日均肿瘤增长率(daily tumor relative volume，dtrv)、对日均肿瘤增殖率(t/c％)进行评价，相应计算公式如下：
[0137][0138]
number(t)为第t天尚存活大鼠数量，number(0)为给药起始时大鼠数量
[0139]
抑瘤率(inhibit tumor ratio％)：
[0140][0141]
v
t
为动物死亡时肿瘤体积(mm3)，v0为给药前肿瘤大小(mm3)，t为动物生存期(天)。
[0142][0143]
t
dtrv
为药物治疗组的日均肿瘤增长率，c
dtrv
为生理盐水阴性对照组的日均肿瘤增长率。抗肿瘤药物研发指南中药效标准：t/c％＜40％，而且给药组与对照组肿瘤体积具有显著性差异(p＜0.05)表示药物能够有效发挥疗效。
[0144]
2.实验结果
[0145]
(1)ptb-ssl(dox)细胞毒
[0146]
ssl，ptb-ssl与c6共孵育，ic
50
分别为18.29
±
2.56g
·
ml-1
，10.63
±
2.95g
·
ml-1
，表明ptb-ssl(dox)药效显著提高。
[0147]
(2)ptb-ssl(dox)对原位脑胶质瘤的治疗
[0148]
裸鼠生存率曲线(如附图6所示)结果可知，与ns组和ssl(dox)组相比较，ptb-ssl(dox)明显提高了动物的生存率，而ssl(dox)并没有显著改善动物的生存率。
[0149]
荷瘤裸鼠尾静脉给药后肿瘤体积、日均肿瘤增长率dti和相对日均肿瘤增长率t/c％结果列入表3。
[0150]
表3 各组肿瘤体积、日均肿瘤增长率和相对日均肿瘤增长率(n＝5)
[0151][0152]
**p＜0.01，control group：ns
[0153]
从上述结果可以看出，普通ssl(dox)t/c％为50.40％，与抗肿瘤药物研发指南中药效标准(＜40％)存在差距，药效不明显。ptb-ssl(dox)组的相对肿瘤增长率t/c％较ssl(dox)组降低了52.5倍，体现了较强的治疗脑胶质瘤能力。
[0154]
【结论】体内研究结果表明，ptb-ssl(dox)的药效优于生理盐水和ssl(dox)，体现了ptb-ssl的优越性，其有利于提高阿霉素等抗癌药物抗脑胶质瘤药效，是一种具有前景的抗脑癌新型给药系统。