一种sars-cov-2假病毒
技术领域：
：1.本发明涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及截短的spike蛋白或其变体，包含所述蛋白的融合蛋白和类病毒颗粒。所述类病毒颗粒可用于抗sars-cov-2的抗体和药物的筛选(例如，检测sars-cov-2抗体的中和活性，或者在细胞水平上筛选抑制sars-cov-2感染的药物)。本发明还涉及包含上述蛋白的制备方法和试剂盒。
背景技术：
：：2.假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的类病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。3.假病毒主要通过多质粒共转染293t细胞，在细胞内自行复制、表达组装形成，通过收集培养基上清或者裂解细胞等方法获得。假病毒不仅具备和真病毒一样的感染性，进入细胞的过程和真病毒一样，而且进入细胞后不具有复制产生病毒的能力，因而没有危害，可以更安全地用于中和抗体和抗病毒药物检测。4.传染性强、致病性强的病毒，如sars-cov-2，ebola病毒，狂犬病毒，h7n9等，真病毒研究有极大的危险性，而且数量有限，假病毒安全性好，并可以通过转染技术大量制备，为这些危险性高的病毒研究提供了方便。5.假病毒体系其特点是克服了传统方法的缺陷，使检测技术更安全、简便、快速、高通量，而且使一些本身很难培养的病毒也能采用培养的方法进行检测。6.但是通常利用病毒膜蛋白直接用于假病毒的构建其病毒滴度往往较低，这限制了假病毒的应用。因此，需要进一步提高假病毒的病毒滴度。技术实现要素：7.本技术的发明人经过大量实验和反复摸索，将spike蛋白进行截短并改造，由此获得了高滴度的sars-cov-2假病毒。基于此，进一步通过大量实验对载体进行改造，获得了制备高滴度假病毒的改造的载体和转染条件，并由此完成了本发明。8.因此，在第一方面，本发明提供了截短的spike蛋白或其变体，其中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，(1)所述截短的spike蛋白的c端截短了13-23个氨基酸，和/或，(2)所述截短的spike蛋白在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置；9.其中，所述变体与所述截短的spike蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的保守置换)。10.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，该截短的spike蛋白的c端截短了13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个氨基酸。11.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白还含有缺失，即，在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置。12.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为furin酶切位点。13.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为prra。14.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置。15.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白的c端还被截短了13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个氨基酸。16.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为furin酶切位点。17.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为prra。18.在某些实施方案中，所述的截短的spike蛋白或其变体具有选自下列的氨基酸序列：19.(1)seqidno:2-seqidno:23；20.(2)与seqidno:2-seqidno:23任一项所示的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的保守置换)的氨基酸序列；21.(3)与seqidno:2-seqidno:23任一项所示的序列相比，具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。22.在本发明中，上述变体基本保留了其所源自的蛋白的生物学功能。在本发明中，所述生物学功能主要是指，野生的sars-cov-2的spike蛋白的生物学功能，包括但不限于，与细胞表面受体(ace2)的结合的活性，能够发生构象变化(例如，卷曲折叠形成发夹样结构)，自组装成类病毒颗粒等。23.在第二方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含如上所述的截短的spike蛋白或其变体以及另外的多肽。24.在某些实施方案中，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述蛋白的n端或c端。这类接头是本领域熟知的，其实例包括但不限于，包含一个或多个(例如，1个，2个，3个，4个或5个)氨基酸(如，glu或ser)的肽接头。在某些实施方案中，所述肽接头是柔性的。在某些实施方案中，柔性的肽接头可能是有利的，其能够连接两种蛋白/多肽成分，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包括但不限于，(ggggs)3。25.在某些实施方案中，所述另外的多肽选自标签、信号肽或导肽、可检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(gfp))，或其任何组合。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与标签序列连接，以便于本发明的蛋白的表达、检测和/或纯化。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与信号肽或导肽序列连接，以引导本发明的蛋白的分泌。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与可检测的标记序列连接，以便于对本发明的蛋白进行检测或示踪。26.在某些实施方案中，所述信号肽选自spike蛋白、cd5、cd14、igg重链、免疫球蛋白轻链(immunoglobulinlightchain)、组织型纤溶酶原激活物(tpa)、scgb1d1、血清蛋白前蛋白(serumalbuminpreproprotein)、gluc、il-2和ifnα2的天然信号肽。27.在某些实施方案中，本发明的融合蛋白包含标签，这类标签是本领域技术人员熟知的，所述标签包括但不限于组氨酸标签(his)、谷胱甘肽巯基转移酶标签(gst)、流感病毒血凝素(ha)、flag-tag。本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，蛋白的表达、纯化或检测)选择合适的标签。28.在某些实施方案中，所述信号肽具有选自下列的氨基酸序列：seqidno:24-seqidno:33。29.在某些实施方案中，所述标签具有如seqidno:35所示的氨基酸序列。30.上述融合蛋白/另外的多肽(例如标签或信号肽)不会不利地影响本发明的蛋白的期望活性(例如，与细胞表面受体(ace2)的结合的活性，能够发生构象变化(例如，卷曲折叠形成发夹样结构)，自组装成类病毒颗粒)。31.在第三方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如上所述的截短的spike蛋白或其变体，或者编码如上所述的融合蛋白。32.在第四方面，本发明提供了一种载体，其包含如上所述的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在宿主细胞(例如哺乳动物的细胞，例如人的细胞)内表达本发明的蛋白或如上所述的融合蛋白。33.在某些实施方案中，所述载体为包含如上所述的核酸分子的真核表达质粒。34.在某些实施方案中，所述真核表达质粒选自pcdna3.1 、pcag3.1和pcmv3.1。35.在第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或如上所述的载体。36.在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物的细胞。37.在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。38.在某些实施方案中，所述细胞为表达或过表达人ace2蛋白的细胞(例如，293t-ace2)。39.在某些实施方案中，所述宿主细胞还包括包装质粒。40.在第六方面，本发明提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白；或者，所述类病毒颗粒由如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白组成。41.在本发明中，所述截短的spike蛋白或其变体或所述的融合蛋白自组装形成了所述类病毒颗粒的外壳。在某些实施方案中，所述类病毒颗粒还含有核酸组分。此类核酸组分例如被包裹在所述截短的spike蛋白或其变体或所述的融合蛋白自组装形成的外壳内。在某些实施方案中，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：42.(a)外源dna，或者编码外源蛋白或多肽的外源dna，或者编码rna的外源dna；43.(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源dna；44.(c)外源rna，或者编码外源蛋白或多肽的外源rna；45.(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源rna。46.在本发明中，所述核酸组分可以是双链的，单链的，或其任何组合。在本发明中，所述核酸组分可以是dna，rna，或其任何组合。47.在某些实施方案中，所述核酸组分与如上所述的载体共转染至宿主细胞中并进行自组装，宿主细胞表达的蛋白包裹核酸，形成了类病毒颗粒。48.在某些实施方案中，所述核酸组分为包装质粒。49.在第七方面，本发明提供了一种sars-cov-2假病毒的制备方法，所述方法包括，在合适的宿主细胞中表达如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白。在某些实施方案中，将如上所述的载体转入合适的宿主细胞中，并表达如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白。在某些实施方案中，将如上所述的载体和包装质粒共同转入宿主细胞中。50.在某些实施方案中，将如上所述的载体和包装质粒转染至宿主细胞中。51.在某些实施方案中，转染过程中所使用的载体和所述包装质粒的质量比为1-3:1-4，例如，3：1、2：1、1：1、1：2、1：3或1：4。在某些实施方案中，转染过程中所使用的载体和所述包装质粒的质量比为1：3。52.在某些实施方案中，转染过程中所使用的转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、pei，或其任何组合。53.在某些实施方案中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。54.在某些实施方案中，所述类病毒颗粒感染的细胞为过表达人ace2蛋白的细胞(例如，293t-ace2)。55.在第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分：如上所述的截短的spike蛋白或其变体、如上所述的融合蛋白、如上所述的分离的核酸分子、如上所述的载体、如上所述的宿主细胞、如上所述的类病毒颗粒。56.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括包装质粒。57.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括转染试剂。58.在某些实施方案中，所述转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、pei，或其任何组合。59.在某些实施方案中，本发明的试剂盒还包括使用说明。在本文中探讨了多种优化方案，以提高制备的假病毒的滴度。例如，包装质粒的选择、表达质粒和包装质粒的比例，转染试剂的选择，转染试剂与质粒的比例、假病毒收获时间等。上述方案均可以列入本发明的试剂盒的使用说明中。60.在第九方面，本发明提供了一种检测sars-cov-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将如上所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒与所述抗体或宿主细胞接触。61.与直接elisa法和单表位竞争elisa法相比，假病毒法更能反映抗体的中和能力，其能够模拟抗体阻断病毒进入细胞的生物过程，能够直接反映抗体的保护效果。所述方法通常在将假病毒与宿主细胞接触之前(即，用假病毒感染宿主细胞之前)，将待测抗体与宿主细胞或类病毒颗粒接触，然后再检测假病毒感染宿主细胞的能力。若假病毒感染活性下降，则表明抗体对假病毒感染细胞具有抑制作用，且对细胞具有保护作用。62.在第十方面，本发明提供了一种筛选能够抑制sars-cov-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将如上所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。63.在某些实施方案中，所述方法通常在将假病毒与宿主细胞接触之前(即，用假病毒感染宿主细胞之前)，将待测候选药物与宿主细胞或类病毒颗粒接触，然后再检测假病毒感染宿主细胞的能力。若假病毒感染活性下降，则表明候选药物对假病毒感染细胞具有抑制作用，且对细胞具有保护作用。64.在第十一方面，本发明提供了如上所述的截短的spike蛋白或其变体、如上所述的融合蛋白、如上所述的分离的核酸分子、如上所述的载体、如上所述的宿主细胞、如上所述的类病毒颗粒用于检测或筛选抗sars-cov-2抗体或药物的用途。65.术语定义66.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。67.如本文中所使用的，术语“sars-cov-2”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2)”的简称，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-ncov”，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947。sars-cov-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars-cov-2的受体与sars-cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，s蛋白在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。68.如本文中所使用的，术语“表面刺突蛋白”、“spike蛋白”和“s蛋白”是指sars-cov-2的一种膜蛋白，它们具有相同的含义，可互换使用。69.如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid-19”是指，因sars-cov-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。70.如本文中所使用的，术语“sars-cov”或“sars-cov-1”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus1)”的简称，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：aap13567.1。由sars-cov-1所导致的肺炎被称为sars。71.如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本文中所使用的，野生的sars-cov-2的spike蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的spike蛋白。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得spike蛋白的氨基酸序列。例如，野生的sars-cov-2的spike蛋白的氨基酸序列可如seqidno：1所示。72.如本文中所使用的，术语“c端截短x个氨基酸”是指，c端最末端连续的x个氨基酸被截短。73.如本文中所使用的，术语“对应位置”是指，当对两个序列进行最优比对时，即当两个序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的两个序列中位于等同位置的氨基酸位置。例如，表述“与seqidno:1的第669-672位对应的位置”是指，当对某一序列与seqidno:1进行最优比对时，即当某一序列与seqidno:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的该序列中位于与seqidno:1的第669-672位等同位置的氨基酸位置。74.如本文中所使用的，术语“假病毒”和“类病毒”二者具有相同的含义，可互换使用；其是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，从而，所述假病毒或类病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力。因此，与真正的病毒相比，其生物安全性高。假病毒的包装系统一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，hiv-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。75.如本文中所使用的，术语“骨架质粒”和“包装质粒”具有相同的含义，可以互换使用。如本领域技术人员通常理解的，病毒载体系统(特别是慢病毒载体系统)可以由两部分组成，即，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)和载体成分(例如，携带目的基因的重组表达载体)；其中，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)可提供转录和包装遗传物质(例如rna)到重组的假病毒颗粒内所需要的所有辅助蛋白。由此，可通过下述方式产生高滴度的假病毒颗粒：用重组表达载体和包装质粒共转染细胞，然后在细胞中进行假病毒的包装，随后包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。此类包装质粒或骨架质粒是本领域技术人员熟知的，例如，以hiv-1为基础构建的骨架质粒：包括但不限于，psg3.δenv(weix等人，antibodyneutralizationandescapebyhiv-1.nature422:307-312,2003)和nl4-3.fluc.r-.e-(connorri,等人，vprisrequiredforefficientreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustype-1inmononuclearphagocytes.virology206:935–944,1995)，以及本技术实施例中构建的psg3.δenv.fluc和psg3.δenv.cmvfluc。76.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。77.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。78.如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。79.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。80.本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等。81.如本文中所使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如轮状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如轮状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由轮状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。82.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。83.发明的有益效果84.与现有技术相比，本技术制备的sars-cov-2的假病毒滴度提高了至少10倍，最高将滴度提高了826倍。本技术的假病毒的研制，使得sars-cov-2的研究不局限于高等生物安全条件的实验室。并且，所述假病毒能够应用于抗体中和能力的检测，为sars-cov-2疫苗、药物评价、及病毒致病机制的研究提供了良好的技术支撑手段。85.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明86.图1显示了实施例1中22种截短的spike蛋白所制备的假病毒的荧光值(rlu)。87.图2显示了融合了10种信号肽的spike蛋白所制备的假病毒的荧光值(rlu)。88.图3显示了构建的经改造的3种载体所制备的假病毒的荧光值(rlu)。89.图4显示了构建的经改造的4种载体所制备的假病毒的荧光值(rlu)。90.图5显示了3种骨架质粒所制备的假病毒的荧光值(rlu)。91.图6显示了使用3种不同的转染试剂所制备的假病毒的荧光值(rlu)。92.图7显示了重组载体与骨架质粒的不同质量比所制备的假病毒的荧光值(rlu)。93.序列信息94.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。95.表1：序列的描述96.97.98.99.100.101.102.103.104.105.106.107.108.具体实施方式109.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。110.除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等常规技术，可参见萨姆布鲁克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥苏贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methodsinenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr2：实用方法》(pcr2:apracticalapproach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。111.另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。112.实施例1.重组载体pcdna3.1-spike的构建113.根据质粒pcdna3.1 (购自invitrogen，货号v79020)上的bamh1和xho1酶切位点，将编码sars-cov-2spike蛋白(seqidno:1)的核苷酸序列和编码天然信号肽(seqidno:34)的核苷酸序列连接到pcdna3.1 质粒上，构建重组载体pcdna3.1-spike(genebank:mt613044)。114.具体过程如下：将双酶切后的质粒pcdna3.1 回收，与目的片段混匀，加入infusion酶，置于pcr仪上，50℃连接15分钟。取上述连接产物转入50μldh5α感受态细胞中，冰上放置30min。将感受态细胞取出后，于42℃水浴中热激45-60s，迅速放置冰上2min。加入500μl无抗lb培养基，放置于37℃摇床中，120rpm振荡培养1小时；将培养后的感受态细胞于2800rpm离心2min，弃500μl上清，剩余菌体混匀后涂抹在氨苄抗性(amp)的平板上；37℃培养箱中，倒置培养过夜(14-16小时)；挑取单克隆菌落，接种于5mllb培养基(100μg/mlamp)中，放置于37℃摇床中，220rpm振荡培养14-16小时，保存于甘油中，并送测序公司对所得表达质粒进行鉴定。115.实施例2.spike蛋白的改造及滴度测试116.1.spike蛋白的改造117.sars-cov-2的spike蛋白与sars-cov-1的spike蛋白的一个关键位点区别在于，在s1与s2的酶切位点处增加了四个氨基酸，即prra。这四个氨基酸的添加形成了一个新的furin酶酶切位点，对应于seqidno:1的第669-672位氨基酸。因此，本实施例对sars-cov-2的spike蛋白进行改造，并相应构建含有改造的spike蛋白的重组载体，spike蛋白的改造如下：118.(1)将spike蛋白的c端胞内区分别截短13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23个氨基酸，截短后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:2-12所示，按照实施例1所述的步骤构建重组载体，分别命名为pcdna3.1-spike13至pcdna3.1-spike23；119.(2)将spike蛋白的furin酶酶切位点删除，即将seqidno:1的第669-672位对应的氨基酸删除(即prra)，改造后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:13所示，相应构建的重组载体命名为pcdna3.1-furin；120.(3)先将spike蛋白的c端胞内区分别截短13、14、15、16、17、19、20、21、22和23个氨基酸，在此基础上，再将furin酶酶切位点删除，即将seqidno:1的第669-672位对应氨基酸删除(即prra)，改造后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:14-23所示。相应构建的重组载体分别命名为pcdna3.1-spike13-furin至pcdna3.1-spike23-furin。121.具体过程如下：结合环形pcr的原理，以载体pcdna3.1-spike(genebank:mt613044)的序列为模板进行pcr序列扩增；由于pcr产物中存在有模板链，为减少其干扰，提高后续实验的成功率，使用dpni限制性核酸内切酶切除模板链，37℃过夜(其原理是模板dna序列来源于常规大肠杆菌，经过了dam甲基化修饰，对dpni内切酶敏感，从而会被切碎，而体外扩增的dna则没有经过甲基化，因而不会被dpni酶识别)。将pcr产物按照实施例1中描述的方法构建至pcdna3.1 质粒中，并转化至dh5α感受态细胞中，涂板并培养。从每块培养板挑取大约5个单克隆菌落，并分别转移至5ml含有氨苄抗生素的lb液体培养基中，220rpm，37℃摇床中振荡培养16h左右。对菌液进行质粒小量提取，对小提后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小进行初步鉴定。对于初步鉴定结果正确的条带送往测序，进一步确定突变是否成功，并进行接下来的假病毒构建。122.2.滴度测试123.根据lipofectamine3000transfectionreagent(thermofisherscientific,cat.no.l3000015)转染试剂的说明书，将相同量的上述构建的22种重组载体(以载体pcdna3.1-spike作为对照)与骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc(该质粒为本实验室构建，其含有携带cmv启动子的荧光素酶基因(fluc)，该质粒相关信息及序列公开于专利cn201510293955.5)共同转染293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞(购自义翘神州)，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测并计算化学发光值(rlu)。124.结果如图1所示。在spike蛋白c端胞内区截短了13-23个氨基酸后，病毒滴度均提高了10倍左右。将furin酶切位点删除后病毒滴度则提高了40倍左右。将两者同时删除后，病毒滴度有了进一步的提高。特别的，同时将furin酶切位点删除以及截短spike蛋白c端胞内区21个氨基酸后，化学发光值(rlu)达到最高值，经计算与对照相比提高了826倍。125.实施例3.重组载体的改造及滴度测试126.1.信号肽的替换geneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。美国国立卫生研究院(nih)提供了2个以hiv-1为基础构建的骨架质粒，即，不携带fluc基因的质粒psg3.δenv(weix,deckerjm,wangs,huih,kappesjc,wux,salazar-gonzalezjf,salazarmg,kilbyjm,saagms,komarovanl,nowakma,hahnbh,kwongpdandshawgm.antibodyneutralizationandescapebyhiv-1.nature422:307-312,2003.)和携带fluc基因的质粒nl4-3.fluc.r-.e-(connorri,chenbk,choes,landaunr.vprisrequiredforefficientreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustype-1inmononuclearphagocytes.virology206:935–944,1995)。在此基础上，我们对fluc基因进行扩增，构建了携带fluc基因的psg3.δenv.fluc载体，然后，在psg3.δenv.fluc载体的基础上添加cmv启动子到fluc基因上游，构建了psg3.δenv.cmvfluc载体(psg3.δenv.fluc和psg3.δenv.cmvfluc的具体信息公开于专利cn201510293955.5)。因此，本实施例使用的3种骨架质粒分别为：(1)pnl4-3.fluc.r-.e-；(2)psg3.δenv.fluc；(3)psg3.δenv.cmvfluc。138.结果如图5所示，与其余相比，使用psg3.δenv.cmvfluc骨架质粒制备的假病毒滴度明显提高。139.2.转染试剂的替换140.参考上述步骤，将重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc分别使用3种转染试剂，共同转染至293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。3种转染试剂分别为：lipofectamine2000、lipofectamine3000和pei。141.结果如图6所示，使用lipofectamine3000转染试剂制备的假病毒滴度更高。142.3.重组载体与骨架质粒的比例143.参考上述步骤，将重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc以不同的质量比，根据lipofectamine3000转染试剂的说明书，分别共同转染至293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。其中，重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc的质量比分别为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3和1：4。144.结果如图7所示，重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc的质量比分别为1：3时，制备的假病毒滴度更高。145.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及基因工程和分子生物学领域，具体涉及截短的spike蛋白或其变体，包含所述蛋白的融合蛋白和类病毒颗粒。所述类病毒颗粒可用于抗sars-cov-2的抗体和药物的筛选(例如，检测sars-cov-2抗体的中和活性，或者在细胞水平上筛选抑制sars-cov-2感染的药物)。本发明还涉及包含上述蛋白的制备方法和试剂盒。
背景技术：
：：2.假病毒(pseudovirus)是病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源核酸形成的类似于真病毒的具有感染性的类病毒颗粒，由于被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列，所以假病毒只有一轮的感染力，操作比较安全。3.假病毒主要通过多质粒共转染293t细胞，在细胞内自行复制、表达组装形成，通过收集培养基上清或者裂解细胞等方法获得。假病毒不仅具备和真病毒一样的感染性，进入细胞的过程和真病毒一样，而且进入细胞后不具有复制产生病毒的能力，因而没有危害，可以更安全地用于中和抗体和抗病毒药物检测。4.传染性强、致病性强的病毒，如sars-cov-2，ebola病毒，狂犬病毒，h7n9等，真病毒研究有极大的危险性，而且数量有限，假病毒安全性好，并可以通过转染技术大量制备，为这些危险性高的病毒研究提供了方便。5.假病毒体系其特点是克服了传统方法的缺陷，使检测技术更安全、简便、快速、高通量，而且使一些本身很难培养的病毒也能采用培养的方法进行检测。6.但是通常利用病毒膜蛋白直接用于假病毒的构建其病毒滴度往往较低，这限制了假病毒的应用。因此，需要进一步提高假病毒的病毒滴度。技术实现要素：7.本技术的发明人经过大量实验和反复摸索，将spike蛋白进行截短并改造，由此获得了高滴度的sars-cov-2假病毒。基于此，进一步通过大量实验对载体进行改造，获得了制备高滴度假病毒的改造的载体和转染条件，并由此完成了本发明。8.因此，在第一方面，本发明提供了截短的spike蛋白或其变体，其中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，(1)所述截短的spike蛋白的c端截短了13-23个氨基酸，和/或，(2)所述截短的spike蛋白在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置；9.其中，所述变体与所述截短的spike蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的保守置换)。10.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，该截短的spike蛋白的c端截短了13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个氨基酸。11.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白还含有缺失，即，在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置。12.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为furin酶切位点。13.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为prra。14.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白在下述位置上的氨基酸被缺失：与seqidno:1的第669-672位对应的位置。15.在某些实施方案中，与野生的sars-cov-2的spike蛋白相比，所述截短的spike蛋白的c端还被截短了13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个氨基酸。16.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为furin酶切位点。17.在某些实施方案中，所述被缺失的氨基酸为prra。18.在某些实施方案中，所述的截短的spike蛋白或其变体具有选自下列的氨基酸序列：19.(1)seqidno:2-seqidno:23；20.(2)与seqidno:2-seqidno:23任一项所示的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的保守置换)的氨基酸序列；21.(3)与seqidno:2-seqidno:23任一项所示的序列相比，具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。22.在本发明中，上述变体基本保留了其所源自的蛋白的生物学功能。在本发明中，所述生物学功能主要是指，野生的sars-cov-2的spike蛋白的生物学功能，包括但不限于，与细胞表面受体(ace2)的结合的活性，能够发生构象变化(例如，卷曲折叠形成发夹样结构)，自组装成类病毒颗粒等。23.在第二方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含如上所述的截短的spike蛋白或其变体以及另外的多肽。24.在某些实施方案中，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述蛋白的n端或c端。这类接头是本领域熟知的，其实例包括但不限于，包含一个或多个(例如，1个，2个，3个，4个或5个)氨基酸(如，glu或ser)的肽接头。在某些实施方案中，所述肽接头是柔性的。在某些实施方案中，柔性的肽接头可能是有利的，其能够连接两种蛋白/多肽成分，并且保持其各自的活性和功能。此类肽接头包括但不限于，(ggggs)3。25.在某些实施方案中，所述另外的多肽选自标签、信号肽或导肽、可检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(gfp))，或其任何组合。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与标签序列连接，以便于本发明的蛋白的表达、检测和/或纯化。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与信号肽或导肽序列连接，以引导本发明的蛋白的分泌。在某些实施方案中，可以将本发明的蛋白或其变体与可检测的标记序列连接，以便于对本发明的蛋白进行检测或示踪。26.在某些实施方案中，所述信号肽选自spike蛋白、cd5、cd14、igg重链、免疫球蛋白轻链(immunoglobulinlightchain)、组织型纤溶酶原激活物(tpa)、scgb1d1、血清蛋白前蛋白(serumalbuminpreproprotein)、gluc、il-2和ifnα2的天然信号肽。27.在某些实施方案中，本发明的融合蛋白包含标签，这类标签是本领域技术人员熟知的，所述标签包括但不限于组氨酸标签(his)、谷胱甘肽巯基转移酶标签(gst)、流感病毒血凝素(ha)、flag-tag。本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，蛋白的表达、纯化或检测)选择合适的标签。28.在某些实施方案中，所述信号肽具有选自下列的氨基酸序列：seqidno:24-seqidno:33。29.在某些实施方案中，所述标签具有如seqidno:35所示的氨基酸序列。30.上述融合蛋白/另外的多肽(例如标签或信号肽)不会不利地影响本发明的蛋白的期望活性(例如，与细胞表面受体(ace2)的结合的活性，能够发生构象变化(例如，卷曲折叠形成发夹样结构)，自组装成类病毒颗粒)。31.在第三方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如上所述的截短的spike蛋白或其变体，或者编码如上所述的融合蛋白。32.在第四方面，本发明提供了一种载体，其包含如上所述的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在宿主细胞(例如哺乳动物的细胞，例如人的细胞)内表达本发明的蛋白或如上所述的融合蛋白。33.在某些实施方案中，所述载体为包含如上所述的核酸分子的真核表达质粒。34.在某些实施方案中，所述真核表达质粒选自pcdna3.1 、pcag3.1和pcmv3.1。35.在第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或如上所述的载体。36.在某些实施方案中，所述细胞为哺乳动物的细胞。37.在某些实施方案中，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。38.在某些实施方案中，所述细胞为表达或过表达人ace2蛋白的细胞(例如，293t-ace2)。39.在某些实施方案中，所述宿主细胞还包括包装质粒。40.在第六方面，本发明提供了一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白；或者，所述类病毒颗粒由如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白组成。41.在本发明中，所述截短的spike蛋白或其变体或所述的融合蛋白自组装形成了所述类病毒颗粒的外壳。在某些实施方案中，所述类病毒颗粒还含有核酸组分。此类核酸组分例如被包裹在所述截短的spike蛋白或其变体或所述的融合蛋白自组装形成的外壳内。在某些实施方案中，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：42.(a)外源dna，或者编码外源蛋白或多肽的外源dna，或者编码rna的外源dna；43.(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源dna；44.(c)外源rna，或者编码外源蛋白或多肽的外源rna；45.(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源rna。46.在本发明中，所述核酸组分可以是双链的，单链的，或其任何组合。在本发明中，所述核酸组分可以是dna，rna，或其任何组合。47.在某些实施方案中，所述核酸组分与如上所述的载体共转染至宿主细胞中并进行自组装，宿主细胞表达的蛋白包裹核酸，形成了类病毒颗粒。48.在某些实施方案中，所述核酸组分为包装质粒。49.在第七方面，本发明提供了一种sars-cov-2假病毒的制备方法，所述方法包括，在合适的宿主细胞中表达如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白。在某些实施方案中，将如上所述的载体转入合适的宿主细胞中，并表达如上所述的截短的spike蛋白或其变体或如上所述的融合蛋白。在某些实施方案中，将如上所述的载体和包装质粒共同转入宿主细胞中。50.在某些实施方案中，将如上所述的载体和包装质粒转染至宿主细胞中。51.在某些实施方案中，转染过程中所使用的载体和所述包装质粒的质量比为1-3:1-4，例如，3：1、2：1、1：1、1：2、1：3或1：4。在某些实施方案中，转染过程中所使用的载体和所述包装质粒的质量比为1：3。52.在某些实施方案中，转染过程中所使用的转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、pei，或其任何组合。53.在某些实施方案中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞。54.在某些实施方案中，所述类病毒颗粒感染的细胞为过表达人ace2蛋白的细胞(例如，293t-ace2)。55.在第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分：如上所述的截短的spike蛋白或其变体、如上所述的融合蛋白、如上所述的分离的核酸分子、如上所述的载体、如上所述的宿主细胞、如上所述的类病毒颗粒。56.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括包装质粒。57.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括转染试剂。58.在某些实施方案中，所述转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、pei，或其任何组合。59.在某些实施方案中，本发明的试剂盒还包括使用说明。在本文中探讨了多种优化方案，以提高制备的假病毒的滴度。例如，包装质粒的选择、表达质粒和包装质粒的比例，转染试剂的选择，转染试剂与质粒的比例、假病毒收获时间等。上述方案均可以列入本发明的试剂盒的使用说明中。60.在第九方面，本发明提供了一种检测sars-cov-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将如上所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒与所述抗体或宿主细胞接触。61.与直接elisa法和单表位竞争elisa法相比，假病毒法更能反映抗体的中和能力，其能够模拟抗体阻断病毒进入细胞的生物过程，能够直接反映抗体的保护效果。所述方法通常在将假病毒与宿主细胞接触之前(即，用假病毒感染宿主细胞之前)，将待测抗体与宿主细胞或类病毒颗粒接触，然后再检测假病毒感染宿主细胞的能力。若假病毒感染活性下降，则表明抗体对假病毒感染细胞具有抑制作用，且对细胞具有保护作用。62.在第十方面，本发明提供了一种筛选能够抑制sars-cov-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将如上所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。63.在某些实施方案中，所述方法通常在将假病毒与宿主细胞接触之前(即，用假病毒感染宿主细胞之前)，将待测候选药物与宿主细胞或类病毒颗粒接触，然后再检测假病毒感染宿主细胞的能力。若假病毒感染活性下降，则表明候选药物对假病毒感染细胞具有抑制作用，且对细胞具有保护作用。64.在第十一方面，本发明提供了如上所述的截短的spike蛋白或其变体、如上所述的融合蛋白、如上所述的分离的核酸分子、如上所述的载体、如上所述的宿主细胞、如上所述的类病毒颗粒用于检测或筛选抗sars-cov-2抗体或药物的用途。65.术语定义66.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。67.如本文中所使用的，术语“sars-cov-2”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2)”的简称，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-ncov”，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：mn908947。sars-cov-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars-cov-2的受体与sars-cov一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后，病毒进行膜融合和入胞，s蛋白在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。68.如本文中所使用的，术语“表面刺突蛋白”、“spike蛋白”和“s蛋白”是指sars-cov-2的一种膜蛋白，它们具有相同的含义，可互换使用。69.如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“covid-19”是指，因sars-cov-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。70.如本文中所使用的，术语“sars-cov”或“sars-cov-1”为“严重急性呼吸综合征冠状病毒1(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus1)”的简称，其属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。sars-cov-1的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如genbank：aap13567.1。由sars-cov-1所导致的肺炎被称为sars。71.如本文中所使用的，术语“野生的”或“天然的”可互换地使用。当这些术语用于描述核酸分子、多肽或蛋白时，其表示该核酸分子、多肽或蛋白在自然界中存在，发现于自然界，并且未经过人工的任何修饰或加工。如本文中所使用的，野生的sars-cov-2的spike蛋白是指天然存在的，具有生物学活性的spike蛋白。本领域技术人员可以方便地从各种公共数据库(例如genbank数据库)获得spike蛋白的氨基酸序列。例如，野生的sars-cov-2的spike蛋白的氨基酸序列可如seqidno：1所示。72.如本文中所使用的，术语“c端截短x个氨基酸”是指，c端最末端连续的x个氨基酸被截短。73.如本文中所使用的，术语“对应位置”是指，当对两个序列进行最优比对时，即当两个序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的两个序列中位于等同位置的氨基酸位置。例如，表述“与seqidno:1的第669-672位对应的位置”是指，当对某一序列与seqidno:1进行最优比对时，即当某一序列与seqidno:1进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的该序列中位于与seqidno:1的第669-672位等同位置的氨基酸位置。74.如本文中所使用的，术语“假病毒”和“类病毒”二者具有相同的含义，可互换使用；其是指，由病毒蛋白自组装形成的一种类似于病毒的颗粒，其不包裹核酸或者包裹了其他核酸，从而，所述假病毒或类病毒虽然能够感染宿主细胞，但不具有自主复制能力。因此，与真正的病毒相比，其生物安全性高。假病毒的包装系统一般由两部分组成，即包装组分和表达组分。包装组分由病毒(例如，hiv-1)基因组去除了包装、逆转录和整合所需的遗传信息而构建，提供假病毒颗粒所必须的蛋白；表达组分则与包装组分互补，含有包装、逆转录和整合所需的遗传信息，同时含有外源目的基因。将包装组分与载体组分共同转染宿主细胞，即可在细胞上清中收获假病毒颗粒。75.如本文中所使用的，术语“骨架质粒”和“包装质粒”具有相同的含义，可以互换使用。如本领域技术人员通常理解的，病毒载体系统(特别是慢病毒载体系统)可以由两部分组成，即，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)和载体成分(例如，携带目的基因的重组表达载体)；其中，包装成分(例如包装质粒或骨架质粒)可提供转录和包装遗传物质(例如rna)到重组的假病毒颗粒内所需要的所有辅助蛋白。由此，可通过下述方式产生高滴度的假病毒颗粒：用重组表达载体和包装质粒共转染细胞，然后在细胞中进行假病毒的包装，随后包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。此类包装质粒或骨架质粒是本领域技术人员熟知的，例如，以hiv-1为基础构建的骨架质粒：包括但不限于，psg3.δenv(weix等人，antibodyneutralizationandescapebyhiv-1.nature422:307-312,2003)和nl4-3.fluc.r-.e-(connorri,等人，vprisrequiredforefficientreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustype-1inmononuclearphagocytes.virology206:935–944,1995)，以及本技术实施例中构建的psg3.δenv.fluc和psg3.δenv.cmvfluc。76.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。77.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。78.如本文中所使用的，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。79.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。80.本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等。81.如本文中所使用的，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防或治疗疾病(例如轮状病毒感染)有效量是指，能够有效预防、阻止或延迟疾病(例如轮状病毒感染)的发生、或缓解、减轻或治疗已有的疾病(例如由轮状病毒感染所导致的疾病)的严重程度的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。82.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。83.发明的有益效果84.与现有技术相比，本技术制备的sars-cov-2的假病毒滴度提高了至少10倍，最高将滴度提高了826倍。本技术的假病毒的研制，使得sars-cov-2的研究不局限于高等生物安全条件的实验室。并且，所述假病毒能够应用于抗体中和能力的检测，为sars-cov-2疫苗、药物评价、及病毒致病机制的研究提供了良好的技术支撑手段。85.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明86.图1显示了实施例1中22种截短的spike蛋白所制备的假病毒的荧光值(rlu)。87.图2显示了融合了10种信号肽的spike蛋白所制备的假病毒的荧光值(rlu)。88.图3显示了构建的经改造的3种载体所制备的假病毒的荧光值(rlu)。89.图4显示了构建的经改造的4种载体所制备的假病毒的荧光值(rlu)。90.图5显示了3种骨架质粒所制备的假病毒的荧光值(rlu)。91.图6显示了使用3种不同的转染试剂所制备的假病毒的荧光值(rlu)。92.图7显示了重组载体与骨架质粒的不同质量比所制备的假病毒的荧光值(rlu)。93.序列信息94.本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。95.表1：序列的描述96.97.98.99.100.101.102.103.104.105.106.107.108.具体实施方式109.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。110.除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等常规技术，可参见萨姆布鲁克(sambrook)、弗里奇(fritsch)和马尼亚蒂斯(maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.奥苏贝尔(f.m.ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(methodsinenzymology)系列(学术出版公司)：《pcr2：实用方法》(pcr2:apracticalapproach)(m.j.麦克弗森(m.j.macpherson)、b.d.黑姆斯(b.d.hames)和g.r.泰勒(g.r.taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。111.另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。112.实施例1.重组载体pcdna3.1-spike的构建113.根据质粒pcdna3.1 (购自invitrogen，货号v79020)上的bamh1和xho1酶切位点，将编码sars-cov-2spike蛋白(seqidno:1)的核苷酸序列和编码天然信号肽(seqidno:34)的核苷酸序列连接到pcdna3.1 质粒上，构建重组载体pcdna3.1-spike(genebank:mt613044)。114.具体过程如下：将双酶切后的质粒pcdna3.1 回收，与目的片段混匀，加入infusion酶，置于pcr仪上，50℃连接15分钟。取上述连接产物转入50μldh5α感受态细胞中，冰上放置30min。将感受态细胞取出后，于42℃水浴中热激45-60s，迅速放置冰上2min。加入500μl无抗lb培养基，放置于37℃摇床中，120rpm振荡培养1小时；将培养后的感受态细胞于2800rpm离心2min，弃500μl上清，剩余菌体混匀后涂抹在氨苄抗性(amp)的平板上；37℃培养箱中，倒置培养过夜(14-16小时)；挑取单克隆菌落，接种于5mllb培养基(100μg/mlamp)中，放置于37℃摇床中，220rpm振荡培养14-16小时，保存于甘油中，并送测序公司对所得表达质粒进行鉴定。115.实施例2.spike蛋白的改造及滴度测试116.1.spike蛋白的改造117.sars-cov-2的spike蛋白与sars-cov-1的spike蛋白的一个关键位点区别在于，在s1与s2的酶切位点处增加了四个氨基酸，即prra。这四个氨基酸的添加形成了一个新的furin酶酶切位点，对应于seqidno:1的第669-672位氨基酸。因此，本实施例对sars-cov-2的spike蛋白进行改造，并相应构建含有改造的spike蛋白的重组载体，spike蛋白的改造如下：118.(1)将spike蛋白的c端胞内区分别截短13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23个氨基酸，截短后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:2-12所示，按照实施例1所述的步骤构建重组载体，分别命名为pcdna3.1-spike13至pcdna3.1-spike23；119.(2)将spike蛋白的furin酶酶切位点删除，即将seqidno:1的第669-672位对应的氨基酸删除(即prra)，改造后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:13所示，相应构建的重组载体命名为pcdna3.1-furin；120.(3)先将spike蛋白的c端胞内区分别截短13、14、15、16、17、19、20、21、22和23个氨基酸，在此基础上，再将furin酶酶切位点删除，即将seqidno:1的第669-672位对应氨基酸删除(即prra)，改造后的spike蛋白所对应的氨基酸序列如seqidno:14-23所示。相应构建的重组载体分别命名为pcdna3.1-spike13-furin至pcdna3.1-spike23-furin。121.具体过程如下：结合环形pcr的原理，以载体pcdna3.1-spike(genebank:mt613044)的序列为模板进行pcr序列扩增；由于pcr产物中存在有模板链，为减少其干扰，提高后续实验的成功率，使用dpni限制性核酸内切酶切除模板链，37℃过夜(其原理是模板dna序列来源于常规大肠杆菌，经过了dam甲基化修饰，对dpni内切酶敏感，从而会被切碎，而体外扩增的dna则没有经过甲基化，因而不会被dpni酶识别)。将pcr产物按照实施例1中描述的方法构建至pcdna3.1 质粒中，并转化至dh5α感受态细胞中，涂板并培养。从每块培养板挑取大约5个单克隆菌落，并分别转移至5ml含有氨苄抗生素的lb液体培养基中，220rpm，37℃摇床中振荡培养16h左右。对菌液进行质粒小量提取，对小提后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小进行初步鉴定。对于初步鉴定结果正确的条带送往测序，进一步确定突变是否成功，并进行接下来的假病毒构建。122.2.滴度测试123.根据lipofectamine3000transfectionreagent(thermofisherscientific,cat.no.l3000015)转染试剂的说明书，将相同量的上述构建的22种重组载体(以载体pcdna3.1-spike作为对照)与骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc(该质粒为本实验室构建，其含有携带cmv启动子的荧光素酶基因(fluc)，该质粒相关信息及序列公开于专利cn201510293955.5)共同转染293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞(购自义翘神州)，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测并计算化学发光值(rlu)。124.结果如图1所示。在spike蛋白c端胞内区截短了13-23个氨基酸后，病毒滴度均提高了10倍左右。将furin酶切位点删除后病毒滴度则提高了40倍左右。将两者同时删除后，病毒滴度有了进一步的提高。特别的，同时将furin酶切位点删除以及截短spike蛋白c端胞内区21个氨基酸后，化学发光值(rlu)达到最高值，经计算与对照相比提高了826倍。125.实施例3.重组载体的改造及滴度测试126.1.信号肽的替换geneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。美国国立卫生研究院(nih)提供了2个以hiv-1为基础构建的骨架质粒，即，不携带fluc基因的质粒psg3.δenv(weix,deckerjm,wangs,huih,kappesjc,wux,salazar-gonzalezjf,salazarmg,kilbyjm,saagms,komarovanl,nowakma,hahnbh,kwongpdandshawgm.antibodyneutralizationandescapebyhiv-1.nature422:307-312,2003.)和携带fluc基因的质粒nl4-3.fluc.r-.e-(connorri,chenbk,choes,landaunr.vprisrequiredforefficientreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustype-1inmononuclearphagocytes.virology206:935–944,1995)。在此基础上，我们对fluc基因进行扩增，构建了携带fluc基因的psg3.δenv.fluc载体，然后，在psg3.δenv.fluc载体的基础上添加cmv启动子到fluc基因上游，构建了psg3.δenv.cmvfluc载体(psg3.δenv.fluc和psg3.δenv.cmvfluc的具体信息公开于专利cn201510293955.5)。因此，本实施例使用的3种骨架质粒分别为：(1)pnl4-3.fluc.r-.e-；(2)psg3.δenv.fluc；(3)psg3.δenv.cmvfluc。138.结果如图5所示，与其余相比，使用psg3.δenv.cmvfluc骨架质粒制备的假病毒滴度明显提高。139.2.转染试剂的替换140.参考上述步骤，将重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc分别使用3种转染试剂，共同转染至293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。3种转染试剂分别为：lipofectamine2000、lipofectamine3000和pei。141.结果如图6所示，使用lipofectamine3000转染试剂制备的假病毒滴度更高。142.3.重组载体与骨架质粒的比例143.参考上述步骤，将重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc以不同的质量比，根据lipofectamine3000转染试剂的说明书，分别共同转染至293t细胞。48h左右收取上清，将收集的假病毒感染293t-hace2细胞，48小时后弃掉上清，使用briteliteplusreportergeneassaysystem(perkinelmer,cat.no.6066769)荧光素酶检测试剂盒，检测化学发光值。其中，重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc的质量比分别为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3和1：4。144.结果如图7所示，重组载体pcdna3.1-spike和骨架质粒psg3.δenv.cmvfluc的质量比分别为1：3时，制备的假病毒滴度更高。145.尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
