一种对胃蛋白酶抗性提高的α-淀粉酶的制作方法

一种对胃蛋白酶抗性提高的
α
‑
淀粉酶
技术领域
1.本发明涉及α
‑
淀粉酶，特别涉及到对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶。


背景技术：

2.α
‑
淀粉酶(ec.3.2.1.1)，又叫做α
‑
1,4
‑
d
‑
葡萄糖苷水解酶，是一类较早发现的糖苷水解酶。它应用广泛，在医药、粮食加工、食品工业、发酵、纺织、酿造等方面都有大量使用。α
‑
淀粉酶可以随机方式切断淀粉分子内的α
‑
1,4
‑
葡萄糖苷键，不能水解支链淀粉的α
‑
1，6
‑
糖苷键。α
‑
淀粉酶的种类繁多，根据使用条件的不同可分为中温型、高温型、耐酸耐碱型。
3.在许多时候，需要把α
‑
淀粉酶作为食品添加剂、饲料添加剂或者辅助成分添加到食品、饲料或药品中。1886年，日本人高峰让吉利用麸皮培养aspergillus oryzae，用水提取后再以酒精沉淀，得到淀粉酶作为消化剂，并在美国设立了高峰制药厂，从事微生物酶的生产和研究。因此，来源于米曲霉的α
‑
amylase又称为taka
‑
淀粉酶(taa)，它可用于人用消化药或者饲料添加剂，一来可以促进胃肠中淀粉消化，减轻胃胀；二来把淀粉降解成单糖，降低粘度，帮助消化，便于机体吸收。
4.在饲料中添加α
‑
淀粉酶，其主要是为了补充动物内源酶的不足，提高饲料中淀粉的利用率，尤其是幼龄动物对淀粉的利用率。但是，在实际应用中还存在许多不足，如稳定性不佳等，这导致α
‑
淀粉酶无法很好的适用于饲用场景。因此对α
‑
淀粉酶进行改造具有十分重要的意义。
5.迄今，有关α
‑
淀粉酶的研究主要集中于通过基因重组方法获得具有不同特征的α
‑
淀粉酶的菌株或突变体，发现或筛选不同微生物来源的产α
‑
淀粉酶的菌株及其编码基因，实际生产生活中α
‑
淀粉酶的应用以及添加了α
‑
淀粉酶的复合酶的制备、应用等。检索中国专利文库，发现有关α
‑
淀粉酶的专利有近2300个，关于通过基因重组方法获得产不同特征的α
‑
淀粉酶的菌株或突变体的研究主要在三个方面，其中，关于获得耐热、耐酸α
‑
淀粉酶的菌株或突变体的专利有：zl201110303402.5、zl201410852880.5、zl201710093614.2、zl201910126303.0、zl201610817210.9；zl201510004498.3、zl201610816934.1、zl202011127739.0、zl200380106514.5、zl201811287140.6、zl201610670173.3等；其中，获得中低温α
‑
淀粉酶的菌株或突变体的专利有：zl201810198358.8、zl201410023676.2、zl201610410715.3、zl201510653698.1、zl201410735023.7、zl201710412132.9等；其中，提高α
‑
淀粉酶活性的专利有：zl201380029784.4、zl201811002140.7、zl201710032196.6、zl201710032308.8、zl201710032298.8、zl201710030849.7、zl201710015951.x等；关于发现或筛选不同微生物来源的产α
‑
淀粉酶的菌株的专利有：zl201510677367.1、zl201410631705.3、zl201610071794.x、zl201410032677.3、zl202010771929.x、zl201610072221.9、zl201410842693.9等；关于发现或筛选来自不同微生物来源的具有不同特征的α
‑
淀粉酶或其编码基因的专利有：zl201410833881.5、zl201410005765.4、zl201810034439.4、zl201310362292.9、zl201610552488.8、zl201910853272.9、
zl201510686340.9、zl201910008932.3、zl200980129658.x等；关于构建产α
‑
淀粉酶基因工程菌方法的专利有：zl201810777468.x、zl201210383398.2、zl201210274173.3、zl200480043512.0、zl201510126887.3、zl201610619242.8、zl201310043628.5、zl201510073078.0、zl200810053625.9、zl201210246909.6、zl201610498392.8、zl201911119796.1、zl200580040659.9等；关于产α
‑
淀粉酶菌株及其突变体的应用的专利有：zl201410032677.3、zl201310688970.0、zl201310076922.6、zl200910224585.4、zl200880018006.4、zl201510677368.6、zl201610238772.8、zl201210281532.8、zl 201310703005.6、zl201810139908.9等；关于利用α
‑
淀粉酶进行生物合成的专利有：zl201210471187.4、zl201310355914.5、zl201710259777.3等；关于在实际生产中有关α
‑
淀粉酶的复合酶应用的专利有：zl201310033964.1、zl201110213357.4、zl201080044924.1、zl201410718814.9、zl201410187376.8、zl201410718815.3、zl200980147153.6等；关于制备α
‑
淀粉酶的方法的专利有：zl201610836135.0、zl200810235367.6、zl201210210022.1等；关于α
‑
淀粉酶检测的专利有：zl201410110657.3、zl201510385800.4、zl202010394851.4、zl200710043466.x、zl201410401270.3等。检索中国学位论文库有关α
‑
淀粉酶的主要研究包括对不同微生物来源的α
‑
淀粉酶使用基因工程等方法进行性质改良，如热稳定性、耐酸性等，并研究相关关键氨基酸结构；酶基因克隆与表达、酶学性质分析、催化反应机理、酶活力测定以及在纺织物处理、食品加工等中的应用等；而有关对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶的研究和专利，迄今尚未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的是提供一种对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶。
7.本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶，是由氨基酸序列为seq id no.1的来源于米曲霉(aspergillus oryzae，a.oryzae)的α
‑
淀粉酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第221和375位的氨基酸取代。
8.根据本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶的进一步特征，所述在第221位的氨基酸取代是用天冬氨酸取代赖氨酸；在375位的氨基酸取代是用异亮氨酸取代赖氨酸；所述的α
‑
淀粉酶的氨基酸序列为seq id no.2。
9.本发明的第二个目的是提供一种dna分子，其编码本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶。
10.优选地，所述的dna分子的核苷酸序列为seq id no.3。
11.本发明的第三个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的dna分子。
12.本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的dna分子，或者含有本发明所述的载体。
13.本发明的第五个目的是提供一种如本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶的生产方法，所述方法包括：在适于α
‑
淀粉酶表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的α
‑
淀粉酶。
14.本发明的第六个目的是提供如本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的α
‑
淀粉酶在制备食品添加剂、饲料添加剂或药品辅助成分中的应用。
15.本发明是对野生型α
‑
淀粉酶的基因进行定点突变得到新的α
‑
淀粉酶。由米曲霉
(aspergillus oryzae)中获得的α
‑
淀粉酶，其基因序列的genbank登录号为5993438。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为xm_001821384.1(seq id no.1)。
16.本发明通过对野生型α
‑
淀粉酶进行突变筛选到了一株α
‑
淀粉酶突变体，所获得的α
‑
淀粉酶突变体对可溶性淀粉的水解功能不受影响，胃蛋白酶的抗性半衰期比野生型α
‑
amy
wt
延长约2.54倍，残留酶活力提高了1.42倍，命名为α
‑
amy
k221d/k375i
。
17.本发明所述的α
‑
淀粉酶突变体α
‑
amy
k221d/k375i
在添加了0.05％ca
2
的ypg培养基中培养获得的蛋白，经模拟人工胃液(ph为1.2，浓度为0.76μg/ml的胃蛋白酶(3460u/mg)在37℃条件下)消化处理120分钟后，相对酶活降约55％，其半衰期约89分钟；而野生型α
‑
amy
wt
其半衰期约35分钟。结果显示，突变体α
‑
amy
k221d/k375i
对胃蛋白酶的抗性比野生型α
‑
amy
wt
显著提高了。
18.比酶活测定结果显示，在经胃蛋白酶(人工胃液)消化处理30min时，突变体α
‑
amy
k221d/k375i
的残余相对酶活为80.3％，野生型α
‑
amy
wt
的残余相对酶活为56.4％，突变体的胃蛋白酶抗性是野生型蛋白的1.42倍。表明突变体α
‑
amy
k221d/k375i
相比于野生型α
‑
amy
wt
有更好的抗胃蛋白酶消化的能力。突变体α
‑
amy
k221d/k375i
的其他酶学性质与野生型α
‑
amy
wt
基本一致。
19.当本发明所述的dna分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的dna分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主
‑
载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主
‑
载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。
20.本发明所采用的载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。
附图说明
21.图1是sds
‑
page蛋白电泳图，黑色箭头所指处为目的蛋白条带，大小为52kd左右。其中，泳道1为不含目的基因的毕赤酵母gs115对照样品；泳道2为突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白；泳道3为突变体α
‑
amy
k221d/k375i
(ca
2
孵育)蛋白；泳道4为野生型α
‑
amy
wt
蛋白；泳道5为野生型α
‑
amy
wt
(ca
2
孵育)蛋白。
22.图2是本发明所述的野生型α
‑
amy
wt
蛋白和突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白在人工胃液处理前和经人工胃液处理0min、15s、2min、5min、30min后的残余比酶活，人工胃液中含胃蛋白酶。
具体实施方式
23.本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。
[0024]“α
‑
amy
wt”表示野生型α
‑
淀粉酶，其基因以斜体“α
‑
amy
wt”表示。
[0025]“α
‑
amy
k221d/k375i”表示突变体α
‑
淀粉酶，其基因以斜体“α
‑
amy
k221d/k375i”表示。
[0026]
实施例1：α
‑
淀粉酶基因的合成
[0027]
本发明采用米曲霉来源的野生型α
‑
淀粉酶的基因(genbank注册号为5993438)，由华大基因生物公司合成(其它具有全基因合成的商业公司同样可以完成)。
[0028]
实施例2：biobrick元件质粒的酶切鉴定
[0029]
biobrick parts包括
‑
amy
wt
‑
(1515bp)、
‑
taox
‑
pght
‑
(3740bp)、
‑
paox
‑
pgap
‑
ss1
‑
(1800bp)。
[0030]
1.将全基因合成的含α
‑
amy
wt
目的基因的puc质粒和克隆载体taox
‑
pght
‑
分别用限制性内切酶ecori和psti于37℃酶切1h，酶切体系如下：
[0031]
组分体积(μl)10
×
buffer1质粒1ecori0.5psti0.5ddh2o7total volume10
[0032]
2.基因片段paox
‑
pgap ss1由发明人保存的克隆载体paox ss1 pb中调出，使用限制性内切酶ecori和psti于37℃酶切1h。
[0033]
实施例3：α
‑
淀粉酶基因与克隆载体taox pght pb的连接
[0034]
1.将实例2中获得的目的片段α
‑
amy
wt
与克隆载体taox pght pb分别用限制性内切酶ecori和xbai/spei于37℃酶切1h，酶切条件如下：
[0035][0036]
2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用t4dna连接酶连接，连接体系如下：
[0037]
α
‑
amy
wt
酶切产物0.3pmol克隆载体酶切产物0.03pmolt4dna连接酶1.0μlt
4 dna连接酶缓冲液2.5μlddh2oupto25.0μl
[0038]
用dna连接酶16℃连接16h，连接产物转化dh5α感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用ecori和psti双酶切后跑电泳结果显示有5.2kb和3.8kb两条带，表明连接成功，通过dna测序，确定为α
‑
淀粉酶。
[0039]
实施例4：基因片段paox pgap ss1与克隆载体m taox pght pb连接
[0040]
1.基因片段paox
‑
pgap ss1由发明人保存的克隆载体paox ss1 pb中调出，使用ecori和spei内切酶双酶切并纯化回收获得；
[0041]
2.克隆载体m taox pght pb由实施例3获得，基因片段paox pgap ss1与克隆载体m taox pght pb的连接方法同实施例3。
[0042]
实施例5：定点突变
[0043]
经过利用酶促反应过渡态理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法在discovery studio 4.5软件平台上进行，发明人确定对第221位、和第375位氨基酸进行定点突变，突变后的突变体α
‑
amy
k221d/k375i
基因由华大基因生物公司合成。也可以由其它具有全基因合成的商业公司完成基因合成。
[0044]
实施例6：野生型α
‑
amy
wt
基因与突变体α
‑
amy
k221d/k375i
基因分别整合毕赤酵母基因组及重组蛋白的分泌表达
[0045]
为提高单拷贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，用限制性内切酶spei和xbai将表达盒paox ss1 m taox pght从paox ss1 m taox pght pb上切下来并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母gs115，电转化后使用md平板进行初步筛选，然后挑取md平板上的单克隆于2ml的ypg液体培养基中培养14～16h后抽取毕赤酵母基因组进行pcr验证并进一步使用碘熏蒸法以及96孔板微量酶活活力测定法筛选阳性克隆重组子。
[0046]
实施例7：野生型α
‑
amy
wt
及突变体α
‑
amy
k221d/k375i
重组蛋白的sds
‑
page电泳检测
[0047]
(1)配置10ml 12％的分离胶，混匀后用微量移液器往玻璃板中灌胶，直到离短玻璃板上沿2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；
[0048]
(2)配置4ml 5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的梳子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；
[0049]
(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去梳子；
[0050]
(4)依次点样，点样量不宜过多，20μl每孔为合适；
[0051]
(5)电泳开始时先设置80v跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为150v继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于maker的相应条带，事先可获知)；
[0052]
(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝r
‑
250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；
[0053]
(7)凝胶成像并观察结果。sds
‑
page蛋白电泳结果如图1所示。
[0054]
实施例7：电泳检测野生型α
‑
amy
wt
及突变体α
‑
amy
k221d/k375i
重组蛋白的胃蛋白酶抗性检测
[0055]
将野生型α
‑
amy
wt
和突变体α
‑
amy
k221d/k375i
用人工胃液(ph为1.2，浓度为0.76μg/ml的胃蛋白酶在37℃条件下)消化(野生型α
‑
amy
wt
蛋白与突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白的添加量相同，人工胃液和酶蛋白含量按照质量比为1：3.33的比例)分别在0s、15s、2min、5min、30min取出15μl并加入5μl蛋白电泳缓冲液终止消化并立即煮沸5min，然后进行sds
‑
page电泳检测胃蛋白酶的消化效果，对sds
‑
page电泳蛋白条带进行灰度扫描检测残留蛋白量。
[0056]
实施例8：野生型α
‑
amy
wt
及突变体α
‑
amy
k221d/k375i
重组蛋白的胃蛋白酶抗性检测和
酶比活力测定
[0057]
1.制作野生型α
‑
amy
wt
与突变体α
‑
amy
k221d/k375i
的蛋白定量标准曲线，吸光度值均在标准曲线范围之内。
[0058]
2.将野生α
‑
amy
wt
和突变体α
‑
amy
k221d/k375i
用人工胃液(ph为1.2，浓度为0.76μg/ml的胃蛋白酶在37℃条件下)消化(野生型α
‑
amy
wt
蛋白与突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白的添加量相同，人工胃液和酶蛋白含量按照质量比为1：3.33的比例)30min取出15μl并加入5μl蛋白电泳buffer终止消化并立即煮沸5min，然后进行酶活力测定，比较野生α
‑
amy
wt
和α
‑
amy
k221d/k375i
突变体蛋白在处理前后的比酶活。
[0059]
3.酶活力和酶比活力的测定：
[0060]
酶活力定义：在一定的ph和t条件下(本实验为ph5.0，50℃)，水解1％可溶性淀粉，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(u)。
[0061]
酶比活力定义：将每毫克蛋白质中的酶的单位数，定义为比活力(u/mg)
[0062]
(1)反应体系
[0063][0064]
在od
540nm
处测定对照(a0)和样品(a)吸光值，a
‑
a0为实测吸光值。
[0065]
(2)根据已制作的葡萄糖标准曲线计算葡萄糖的浓度，再根据酶活力计算公式计算酶活力。
[0066]
(3)酶活力计算公式：
[0067]
其中，c为代入标曲的还原糖浓度(mg/ml)；v1为反应体积(ml)；n为稀释倍数；v2为所用酶量(ml)；t为酶反应时间；1000为释放的还原糖量mg换算成μg；180为葡萄糖相对分子质量。
[0068]
(4)酶比活力计算公式：
[0069]
其中，u为酶总活力(u/ml)；m为样品中蛋白重量(mg)。
[0070]
酶比活力测定结果(如图2所示)显示：野生型α
‑
amy
wt
蛋白在胃蛋白酶(人工胃液)
处理前酶比活力为4.91u/mg，经胃蛋白酶(人工胃液)处理30min后残留酶比活力为2.773u/mg；突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白在胃蛋白酶(人工胃液)处理前酶比活力为2.933u/mg，经胃蛋白酶(人工胃液)处理30min后残留酶比活力为2.355u/mg；突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白经胃蛋白酶(人工胃液)处理30min后的残留酶比活力比野生型α
‑
amy
wt
提高了1.42倍。依据残余酶活力计算其半衰期，野生型α
‑
amy
wt
蛋白半衰期为35min，突变体α
‑
amy
k221d/k375i
蛋白半衰期为89min，突变体比野生型提高了2.54倍。