一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种水产品深加工领域，属于生物技术领域，尤指一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法和应用。


背景技术：

2.硫酸软骨素( chondroitin sulfate，cs) 是来自动物软骨组织的酸性高分子黏性多糖，cs的糖链由交替的葡萄糖醛酸和n
‑
乙酰半乳糖胺二糖单位组成，其生物结构决定了其具有调节骨关节功能的生物活性。在欧美国家，cs及其衍生物被广泛用于预防和治疗关节炎。在我国，2010 年《中华人民共和国药典》将cs列为防治关节病的常规药物。我国是cs 生产第一大国，国内约有200家生产厂家，产量约占世界总产量的80%，但我国生产的cs主要作为原料出口到欧美、日本等国家，产品附加值低。因此，开发高附加值的硫酸软骨素及其衍生物产品，是非常必要的。
3.锌是一种重要的微量矿物质，常被用作具有抗炎作用的膳食补充剂，若锌摄入量不足，会导致促炎细胞因子的生成而引发炎症，更会影响软骨细胞的增殖。补充锌，可提高局部组织含锌量，发挥其抗炎效果，增加机体抵抗力，改善骨关节炎病痛。市场上现有的硫酸软骨素产品和补锌剂产品均有不足之处。我国市场上现有的硫酸软骨素产品多以钠盐形式存在，摄入过多钠离子会引发人体心脏不适以及对骨关节炎防治效果变差。此外，我国市场上的补锌剂产品多为硫酸锌和葡萄糖酸锌制剂，这些补锌剂多以锌离子形式被人体吸收，而消化道中离子态的锌几乎不能透过肠道粘膜，并且受到膳食中植酸等的影响以及人体胃酸分泌的作用，导致锌离子的大量流失造成吸收率较低，还易引发呕吐或胃肠道疾病，无法满足患者的需求。
4.硫酸软骨素螯合锌盐作为一种硫酸化多糖与锌离子的螯合物，以复合物分子形式进入人体，具有硫酸软骨素的抗骨关节炎生物活性与锌的抗炎活性的协同作用，不仅可弥补传统硫酸软骨素产品不足，还可作为锌的营养强化剂提高锌生物利用度，充分发挥对人体的双重营养功能。然而，目前未见硫酸软骨素螯合锌盐的产品上市，亦未见相关的专利。故，亟待开发一种能够实现产业化的鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法。本案由此产生。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，该方法将硫酸软骨素与无机锌螯合反应，制备鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐，以提升鲨鱼硫酸软骨素金属螯合物在抗炎保健食品、药品中的应用。
6.为了达成上述目的，本发明的技术解决方案是：一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，包括以下步骤：（1）鲨鱼软骨的预处理鲨鱼软骨去除脂肪、鲨鱼肉、钙化骨头，粉粹机粉粹后，获得鲨鱼软骨粉末；（2）酶提取及离心机分离协同纳滤膜分离联动技术制备鲨鱼硫酸软骨素
将上述鲨鱼软骨粉末置于反应釜中，加入水和相当于鲨鱼软骨粉末重量的0.5
‑
10%的蛋白酶进行酶解，酶解温度为45
‑
65℃，酶解ph值为6.5
‑
7.5，酶解时间为1
‑
6h，酶解反应后，利用离心机去除固体杂质，所得清液利用截留相对分子质量为1
‑
5kd的纳滤膜去除杂蛋白后，得到鲨鱼硫酸软骨素溶液；（3）超声波空化协同鲨鱼硫酸软骨素锌螯合技术制备鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品将上述鲨鱼硫酸软骨素溶液置于超声波提取罐中，往反应罐中加入无机锌盐，超声空化螯合反应，得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品；（4）离心机分离、电渗析纯化协同喷雾干燥集成技术制备鲨鱼硫酸软骨素锌盐利用离心机去除上述鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液的固体杂质，所得清液利用电渗析技术去除未螯合的无机锌盐后，利用喷雾干燥快速干燥，得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粉成品。
7.所述步骤（2）中，所用的蛋白酶为中性蛋白酶、动物蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种或任意两种组合组合。
8.所述步骤（2）中，调节ph值所用的酸为硫酸，所用的碱为氢氧化钠。
9.所述步骤（2）、（4）中，所用离心机的转速高于8000rpm。
10.所述步骤（3）中，螯合反应工艺为：鲨鱼硫酸软骨素和无机锌盐的的质量比为0.5:1
‑
5:1，超声空化频率为10
‑
80khz、超声空化功率为300
‑
3000w，超声空化螯合时间为1
‑
10h。
11.所述步骤（4）中，电渗析电流为13
‑
15a，电渗析流量为≥1m3/h。
12.所述步骤（4）喷雾干燥快速干燥工艺为，出风温度为60
‑
85℃，进风温度为120
‑
170℃，物料浓度为质量体积比15
‑
30%。
13.所述步骤（3）中的无机锌盐为硫酸锌。
14.上述方法制备得到的鲨鱼硫酸软骨素锌盐在抗炎保健食品、药品中的应用。
15.采用上述方案后，本发明与已有技术相比具有以下优点：1、现有技术中硫酸软骨素金属螯合物主要的生产方法，如碱法提取硫酸软骨素，螯合反应后，乙醇沉淀法纯化，制备硫酸软骨素金属螯合物，但是该生产方法成本高，环境污染严重。而本发明构建酶提取及离心机协同纳滤膜分离联动技术、超声波空化协同鲨鱼硫酸软骨素锌螯合技术、离心机分离及电渗析纯化协同喷雾干燥集成技术，开发鲨鱼硫酸软骨素锌盐，本发明生产条件温和，清洁环保，质量可控，适合规模化生产。2、本发明生产的鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐，平均相对分子质量集中，产品生物活性高，生物利用率高，安全性高，无毒副作用，可应用在抗炎保健食品、药品领域。
具体实施方式
16.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
17.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将
本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
18.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
19.实施例1一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，包括以下步骤：1、鲨鱼软骨去除脂肪、鲨鱼肉、钙化骨头，粉粹机粉粹后，获得鲨鱼软骨粉末1kg。
20.2、将上述鲨鱼软骨粉末置于反应釜中，加入10kg水，加入5g动物蛋白酶，利用氢氧化钠和硫酸调节ph值，并控制反应体系的ph值为6.5，酶解温度为65℃，酶解时间为6h。酶解反应结束后，利用转速为8000rpm的离心机去除固体杂质，所得清液利用截留相对分子质量为5kd的纳滤膜去除杂蛋白，得到鲨鱼硫酸软骨素溶液。
21.3、将上述鲨鱼硫酸软骨素溶液置于超声波反应罐中，往反应罐中加硫酸锌，硫酸软骨素和硫酸锌的质量比为0.5:1，在超声空化频率为10khz、超声空化功率为300w的条件下，超声螯合反应10h。得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液。
22.4、利用转速为8000rpm的离心机去除上述鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液的固体杂质。清液加入电渗析中，电渗析电流为13a，流量为1m3/h。电渗析去除未螯合的硫酸锌后，浓缩溶液，得到物料浓度为质量体积比15%的鲨鱼硫酸软骨素锌溶液。利用喷雾干燥快速干燥该溶液，出风温度为65℃，进风温度为130℃，喷雾干燥结束得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粉成品。粉成品的平均相对分子质量为10
‑
15kd，锌含量为10%。
23.5、昆明种小白鼠灌胃不同剂量的鲨鱼硫酸软骨素锌盐，各剂量组分别为1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg、15g/kg，各剂量组的动物均无死亡，且无行为异常，体重无明显增长，说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐安全性高，无毒副作用。
24.6、用含10％胎牛血清的dmem培养基培养巨噬细胞(raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于24孔细胞培养板中，放入培养箱中培养，隔天加入不同浓度受试样品。以空白培养基为对照。加入脂多糖（lps，1
µ
g/ml）培养24小时之后，取上清培养加入griss试剂，在酶标仪上548nm处测吸光度值，通过吸光值的大小与标准曲线对比，计算no浓度。最终确定鲨鱼硫酸软骨素锌盐对脂多糖诱导巨噬细胞no分泌的抑制活性的ic
50
值为83
ꢀµ
m。说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐能够抑制脂多糖诱导巨噬细胞no分泌，能够应用到抗炎保健食品和药品中。
25.实施例2一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，包括以下步骤：1、鲨鱼软骨去除脂肪、鲨鱼肉、钙化骨头，粉粹机粉粹后，获得鲨鱼软骨粉末5kg。
26.2、将上述鲨鱼软骨粉末置于反应釜中，加入50kg水，加入50g菠萝蛋白酶，利用氢氧化钠和硫酸调节ph值，并控制反应体系的ph值为7.5，酶解温度为60℃，酶解时间为5h。酶解反应结束后，利用转速为10000rpm的离心机去除固体杂质，所得清液利用截留相对分子质量为3kd的纳滤膜去除杂蛋白，得到鲨鱼硫酸软骨素溶液。
27.3、将上述鲨鱼硫酸软骨素溶液置于超声波反应罐中，往反应罐中加硫酸锌，硫酸软骨素和硫酸锌的质量比为1:1，在超声空化频率为30khz、超声空化功率为1000w的条件下，超声螯合反应5h。得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液。
28.4、利用转速为10000rpm的离心机去除上述鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液的固体杂质。清液加入电渗析中，电渗析电流为14a，流量为1.5m3/h。电渗析去除未螯合的硫酸锌
后，浓缩溶液，得到物料浓度为质量体积比20%的鲨鱼硫酸软骨素锌溶液。利用喷雾干燥快速干燥该溶液，出风温度为70℃，进风温度为140℃，喷雾干燥结束得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粉成品。粉成品的平均相对分子质量为10
‑
15kd，锌含量为8%。
29.5、昆明种小白鼠灌胃不同剂量的鲨鱼硫酸软骨素锌盐，各剂量组分别为1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg、15g/kg，各剂量组的动物均无死亡，且无行为异常，体重无明显增长，说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐安全性高，无毒副作用。
30.6、用含10％胎牛血清的dmem培养基培养巨噬细胞(raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于24孔细胞培养板中，放入培养箱中培养，隔天加入不同浓度受试样品。以空白培养基为对照。加入脂多糖（lps，1
µ
g/ml）培养24小时之后，取上清培养加入griss试剂，在酶标仪上548nm处测吸光度值，通过吸光值的大小与标准曲线对比，计算no浓度。最终确定鲨鱼硫酸软骨素锌盐对脂多糖诱导巨噬细胞no分泌的抑制活性的ic
50
值为62
ꢀµ
m。说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐能够抑制脂多糖诱导巨噬细胞no分泌，能够应用到抗炎保健食品和药品中。
31.实施例3一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，包括以下步骤：1、鲨鱼软骨去除脂肪、鲨鱼肉、钙化骨头，粉粹机粉粹后，获得鲨鱼软骨粉末10kg。
32.2、将上述鲨鱼软骨粉末置于反应釜中，加入100kg水，分别加入250g菠萝蛋白酶和250g中性蛋白酶，利用氢氧化钠和硫酸调节ph值，并控制反应体系的ph值为7，酶解温度为50℃，酶解时间为3h。酶解反应结束后，利用转速为16000rpm的离心机去除固体杂质，所得清液利用截留相对分子质量为1kd的纳滤膜去除杂蛋白，得到鲨鱼硫酸软骨素溶液。
33.3、将上述鲨鱼硫酸软骨素溶液置于超声波反应罐中，往反应罐中加硫酸锌，硫酸软骨素和硫酸锌的质量比为1:1，在超声空化频率为60khz、超声空化功率为2000w的条件下，超声螯合反应3h。得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液。
34.4、利用转速为16000rpm的离心机去除上述鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液的固体杂质。清液加入电渗析中，电渗析电流为14a，流量为1.5m3/h。电渗析去除未螯合的硫酸锌后，浓缩溶液，得到物料浓度为质量体积比25%的鲨鱼硫酸软骨素锌溶液。利用喷雾干燥快速干燥该溶液，出风温度为70℃，进风温度为140℃，喷雾干燥结束得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粉成品。粉成品的平均相对分子质量为10
‑
15kd，锌含量为6%。
35.5、昆明种小白鼠灌胃不同剂量的鲨鱼硫酸软骨素锌盐，各剂量组分别为1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg、15g/kg，各剂量组的动物均无死亡，且无行为异常，体重无明显增长，说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐安全性高，无毒副作用。
36.6、用含10％胎牛血清的dmem培养基培养巨噬细胞(raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于24孔细胞培养板中，放入培养箱中培养，隔天加入不同浓度受试样品。以空白培养基为对照。加入脂多糖（lps，1
µ
g/ml）培养24小时之后，取上清培养加入griss试剂，在酶标仪上548nm处测吸光度值，通过吸光值的大小与标准曲线对比，计算no浓度。最终确定鲨鱼硫酸软骨素锌盐对脂多糖诱导巨噬细胞no分泌的抑制活性的ic
50
值58
ꢀµ
m。说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐能够抑制脂多糖诱导巨噬细胞no分泌，能够应用到抗炎保健食品和药品中。
37.实施例4一种鲨鱼硫酸软骨素螯合锌盐的制备方法，包括以下步骤：1、鲨鱼软骨去除脂肪、鲨鱼肉、钙化骨头，粉粹机粉粹后，获得鲨鱼软骨粉末20kg。
38.2、将上述鲨鱼软骨粉末置于反应釜中，加入200kg水，分别加入1kg中性蛋白酶和1kg动物蛋白酶，利用氢氧化钠和硫酸调节ph值，并控制反应体系的ph值为7，酶解温度为45℃，酶解时间为1h。酶解反应结束后，利用转速为16000rpm的离心机去除固体杂质，所得清液利用截留相对分子质量为1kd的纳滤膜去除杂蛋白，得到鲨鱼硫酸软骨素溶液。
39.3、将上述鲨鱼硫酸软骨素溶液置于超声波反应罐中，往反应罐中加硫酸锌，硫酸软骨素和硫酸锌的质量比为5:1，在超声空化频率为80khz、超声空化功率为3000w的条件下，超声螯合反应1h。得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液。
40.4、利用转速为16000rpm的离心机去除上述鲨鱼硫酸软骨素锌盐粗品溶液的固体杂质。清液加入电渗析中，电渗析电流为15a，流量为2m3/h。电渗析去除未螯合的硫酸锌后，浓缩溶液，得到物料浓度为质量体积比30%的鲨鱼硫酸软骨素锌溶液。利用喷雾干燥快速干燥该溶液，出风温度为80℃，进风温度为160℃，喷雾干燥结束得到鲨鱼硫酸软骨素锌盐粉成品。粉成品的平均相对分子质量为10
‑
15kd，锌含量为5%。
41.5、昆明种小白鼠灌胃不同剂量的鲨鱼硫酸软骨素锌盐，各剂量组分别为1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg、15g/kg，各剂量组的动物均无死亡，且无行为异常，体重无明显增长，说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐安全性高，无毒副作用。
42.6、用含10％胎牛血清的dmem培养基培养巨噬细胞(raw264.7)，调整细胞浓度，将其接种于24孔细胞培养板中，放入培养箱中培养，隔天加入不同浓度受试样品。以空白培养基为对照。加入脂多糖（lps，1
µ
g/ml）培养24小时之后，取上清培养加入griss试剂，在酶标仪上548nm处测吸光度值，通过吸光值的大小与标准曲线对比，计算no浓度。最终确定鲨鱼硫酸软骨素锌盐对脂多糖诱导巨噬细胞no分泌的抑制活性的ic
50
值75
ꢀµ
m。说明鲨鱼硫酸软骨素锌盐能够抑制脂多糖诱导巨噬细胞no分泌，能够应用到抗炎保健食品和药品中。