一株肺炎克雷伯菌KP21株及其应用的制作方法

一株肺炎克雷伯菌kp21株及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一株肺炎克雷伯菌kp21株及其应用。


背景技术：

2.肺炎克雷伯氏菌是肠杆菌科克雷氏菌属中非常重要的一类革兰氏阴性杆菌，同时也是人畜共患的病原微生物，在自然界中分布广泛，在人和动物体内主要分布于呼吸道、肠道及泌尿生殖道，是正常机体微生物群的组成部分，但在免疫功能低下等情况下，可成为致病菌引起机会性感染。
3.肺炎克雷伯菌属包括肺炎克雷伯肺炎亚种、臭鼻亚种及鼻硬结亚种3 个亚种，其中肺炎克雷伯肺炎亚种分布最为广泛，是引发多种动物及人肺炎、腹泻、泌尿道、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病的病原菌之一。肺炎克雷伯菌可能对养驴业具有潜在威胁，应引起重视。国内关于驴源肺炎克雷伯菌报道较少。
4.驴本身对常见的疾病有较强的耐受力，尤其是在传统的散养条件下，由于养殖的数量少而且分散，驴出现传染病的概率低。然而在规模化养驴场，由于群体养殖密度的增加，使驴传染病发病几率增加，驴疫病一旦爆发和流行将会给驴产业造成公共卫生安全危机，同时也将给阿胶、驴肉、驴奶等产业带来严重的食品安全威胁和经济损失，因此，在集约化养殖、流动频繁以及动物产品交易国际化背景下，做好疫病防控十分必要。虽然肺炎克雷伯菌细菌暂时没有对养驴业造成影响，但为了促进养驴业的快速发展，尽快净化本病和控制该菌的发生和流行，预防阻断肺炎克雷伯菌对驴的感染，必须分离当地的驴肺炎克雷伯流行株，加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用，实现对当地导致驴肺炎的有效防治。


技术实现要素：

5.为了预防及阻断肺炎克雷伯菌对驴的感染，同时为了促进养驴业的快速发展，本发明从得肺炎的驴中分离出一株肺炎克雷伯菌，然后经过培养后获得中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；将其进行小鼠侵染实验，与该株肺炎克雷伯菌对驴造成的肺炎症状一致；同时用其制备该菌的灭活菌苗，对于有效预防当地流行菌株引起的驴肺炎以及加强病原生化和分子鉴定等研究和可能应用均有重要价值。
6.本发明的技术方案如下：一株肺炎克雷伯菌株klebsiella pneumoniae kp21，所述的肺炎克雷伯菌株klebsiella pneumoniae kp21的微生物保藏号为cgmcc22865，保藏日期：2021年07月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.所述的肺炎克雷伯菌株klebsiella pneumoniae kp21来源于驴源；在营养琼脂培养基中培养，得到中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起的菌落；接种至营养肉汤的菌液中，利用革兰氏染色观察，得到革兰氏阴性、较短粗的杆菌。
8.所述的肺炎克雷伯菌株klebsiella pneumoniae kp21的16s rdna序列如seqid no.1所示。
9.所述的16s rdna的pcr扩增细菌16s rdna的通用引物为：f27序列如seqid no.2所示：5
′‑
agagttgatcctggctcag
‑3′
；r1492序列如seqid no.3所示：5
′‑
aaggaggtgatccaaccgca
‑3′
。
10.上述的肺炎克雷伯菌株klebsiella pneumoniae kp21在制备灭活菌苗中的应用。
11.有益效果本发明提供了一株分离自山东地区导致驴肺炎的驴源肺炎克雷伯菌优势流行株。从驴肺炎的病料中仅分离出肺炎克雷伯菌致病菌，为导致驴肺炎的致病源提供准确的依据。在小鼠侵染实验中，表明该株细菌对小鼠的致病能力较强，同时症状与该株肺炎克雷伯菌对驴造成的肺炎症状一致；用其制备该菌的灭活菌苗免疫性好，对于有效预防当地流行菌株引起的驴肺炎以及其他动物肺炎有重要价值。
附图说明
12.图1为驴源肺炎克雷伯菌株kp21的革兰氏染色形态；图2为pcr扩增产物 m：marker；1：分离菌株kp21。
具体实施方式
13.以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下属实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
14.实施例 11材料与方法1.1病料2021年4月在山东东阿某驴场发生小规模驴肺炎的情况，该小型驴场总计250头驴，肺炎驴69头，病驴出现呼吸急促及呼吸困难，或有嗜睡、食欲减退等，并相继死亡。对30头死驴的尸检结果显示全部出现肺叶充血、水肿，更进一步有肺叶质实如肝，明显肿胀，呈灰白色，大面积出血。采集1例死驹的纵隔淋巴结、心、肺、肾、肝、脾组织样品进行细菌学检测和病毒筛查等试验。
15.1.2主要试剂普通琼脂以及普通营养肉汤培养基购自青岛海博生物有限公司；生化鉴定管购自于青岛海博生物有限公司；药敏片购自 oxoid 公司。
16.1.3 菌株的分离培养将1.1中采集的病料组织置于超净工作台中，用接种环取病料组织内部接种至普通琼脂培养基中，置于 37℃温箱培养 24h，观察其菌落形态。挑取显色培养基中单一菌落，接种至营养肉汤培养基，放入 37℃温箱培养24h，将培养物革兰氏染色镜检，观察菌株形态特征、是否纯化。
17.1.4生化鉴定将分离纯化的菌株接种于新型微生物微量生化鉴定管，置于37℃温箱培养24h，观察其底部和斜面颜色变化，按照《伯杰细菌鉴定手册》标准判断结果。
18.1.5分离菌16srdna的pcr测序1.5.1pcr模板的制备挑取该分离株致病菌纯培养单菌落，普通营养肉汤培养基增菌后，用easypurebacteriagenomicdnakit提取菌液dna。
19.1.5.216srdna的pcr扩增细菌16srdna的通用引物序列为f27：5
′
－agagttgatcctggctcag－3
′
，r1492：5
′
－aaggaggtgatccaaccgca－3
′
；欲扩增片段大小为1500bp左右，上述引物由北京擎科生物科技有限公司合成；反应体系（25μｌ）：2xtaqpcrmastermix12.5μｌ、ddh2o9μｌ、上下游引物各（10mmol/l）1μｌ、模板1.5μｌ；反应程序为95℃5min，95℃变性40s、56℃退火40s、72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
20.1.5.3测序比对分析单一条目的条带pcr产物，送北京擎科生物科技有限公司，序列为seqidno.1所示。将测序结果通过blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在gen
‑
bank中进行比对。
21.1.6药敏试验采用纸片扩散k
‑
b法进行药敏试验，挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，37℃培养18h后，用无菌pbs缓冲液稀释菌液，使其在600nm波长吸光度为0.1；将稀释后的菌液均匀涂布于hm固体培养基表面，每块培养基贴4个纸片，37℃培养18h后量取抑菌圈直径，重复3次，计平均值。参照美国临床和实验室标准化委员会（clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi）药敏结果判定标准（2013版）进行结果判定。
22.实施例2小鼠致病性试验2.1实验动物spf昆明小鼠，42只，体重约20ｇ，雌雄各半，购自山东大学实验动物中心。
23.2.2测定ld50将小鼠随机分为7组，其中6个试验，1个对照组，每组6只，雌雄各半，菌液按照1.8
×
109‑
1.8
×
104cfu/ml。采用腹腔注射，用培养８ｈ的菌液等容量不等浓度接种小鼠，0.2ml／只，对照组注射等量生理盐水。攻毒后，连续观察10ｄ。
24.2.3剖检小鼠、回收细菌及pcr鉴定对攻毒后死亡的小鼠，剖检观察各组织脏器病变。取小鼠的肺、肝、脾脏接种营养琼脂培养基，回收细菌，试剂盒提取细菌dna。pcr检测脏器和流产小鼠中是否存在肺炎克雷伯菌。
25.实施例3小鼠免疫试验3.1将分离扩增的菌加0.4%甲醛灭活36～48h，离心弃去清。沉淀以灭菌pbs（10mmolph7)稀释至1
×
106cfu/ml。经过无菌检验和安全检验后合格的灭活菌液与等量的氟氏完全佐剂和氟氏不完全佐剂乳化制备免疫原。
26.3.2将15g体重的小鼠12只分成2组，其中6只用制备的灭活抗原0.3ml/只皮下注射，另6只用0.9%的生理盐水0.3ml/只皮下注射作对照,各组均在首免后20天后进行2免，2免后15d按照1.7进行免疫保护实验。
27.实施效果例结果与分析1、菌株培养结果该菌命名为kp21，保藏号（cgmcc22865）。该菌在营养琼脂培养基中培养菌落呈中等大小、边缘整齐、光滑湿润、圆形凸起。接种至营养肉汤的菌液37℃培养24h后，利用革兰
氏染色观察，该菌获得纯化，为革兰氏阴性、为较短粗的杆菌，单独、成双或短链状排列，无芽胞，无鞭毛。(图1)。
28.2、生化试验结果判定结果：kp21与《伯杰细菌鉴定手册》上的肺炎克雷伯菌生化特性一致。生化鉴定结果见表1。
29.表1kp21生化鉴定3、菌株16srdna的pcr扩增分析kp21菌株16srdnapcr扩增产物，在1500bp左右处出现明显的目的条带（图2）。对该株分离菌进行16srdnapcr测序，序列经blast比对，结果显示，分离菌的16srdna序列为肺炎克雷伯菌。
30.4、药物敏感性分析纸片药敏性试验结果显示，该株细菌产生了较强的耐药性（表2）。
31.表2细菌的药敏试验结果
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5、菌株致病性试验结果该株肺炎克雷伯菌可以感染小鼠，接种36h后，接种浓度为1.8
×
10
9 cuf/ml 的试验组小鼠最先出现发病症状，发病小鼠被毛粗乱，精神萎靡，食欲不振，对小鼠的感染情况见表3。根据 reed
‑
muench 法，计算出kp21对小鼠的ld50 值为 1.8
×
107cfu/ml。
32.表3 不同剂量沙门氏菌对小鼠的感染致死情况6、剖检小鼠、回收细菌鉴定结果对感染小鼠进行剖检，发现感染后的小鼠肺脏出血且明显肿胀，呈灰白色，脾脏肿
大；从小鼠的肺、肝、脾脏和流产小鼠胚胎中重新接种营养琼脂培养基，37℃培养24h，经革兰氏染色镜检与之前注射小鼠的菌株形态一致。从病料中没有检测到其他病原微生物，可以认为该株肺炎克雷伯菌kp21是导致驴和鼠肺炎的致病菌。
33.7、灭活菌苗免疫效果kp21经消化道感染引起小鼠出现精神沉郁、呼吸困难、死亡，感染导致小鼠肺叶质实如肝，明显肿胀，呈灰白色，大面积出血，脾脏出现肿大、坏死。而用该菌株在普通营养肉汤培养增菌后（36
±
1℃培养不少于6h），制备的灭活菌苗（0 .4%甲醛），经两次免疫后的血清抗体效价为1:5.2
×
104，免疫组的未出现肺炎症状，免疫组的免疫保护力可达100%。