TLR8基因人源化的非人动物及其构建方法和应用与流程

tlr8基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种tlr8基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.toll样受体(toll
‑
like receptors，tlr)能结合机体自身产生的一些内源性分子(即内源性配体)。免疫佐剂可增强抗肿瘤免疫，其分子和细胞机制得到进一步阐明，tlr也在其中扮演重要角色。由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些能被tlr识别的内源性配体，所以tlr在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用。tlr家族在病原体识别和先天免疫的激活中起着重要作用，其中tlr8基因主要在单核、巨噬细胞和骨髓树突状细胞中表达，并且位于染色体x上的另一个家族成员tlr7附近，tlr8可以与tlr7结合形成异源复合物，两者都能识别单链rna和短双链rna，tlr7主要在类浆细胞的树突状细胞中表达，在b细胞和单核、巨噬细胞中也可表达。
3.tlr8是一种识别单链rna(ssrna)的内体小泡(endosomal)受体，可识别ssrna病毒，如流感、仙台和柯萨奇b病毒(coxsackie b viruses)。与病毒rna的结合会募集myd88并导致转录因子nf
‑
κb的激活和抗病毒反应。同时tlr8可以识别病毒的单链rna，例如hiv和hcv，tlr8可以识别富含gu的单链rna。然而，单链rna中富含gu的序列的存在不足以刺激tlr8。tlr8识别富含g的寡核苷酸。tlr8是i型跨膜蛋白，包括由25个富含亮氨酸的重复序列组成的胞外结构域，一个跨膜区，和胞内的tir结构域(myd88招募在tir结构域)。tlr8似乎在人类和小鼠中的功能不同。例如，人tlr8能够被单链rna(ssrna)激活，但是小鼠的tlr8不能被ssrna和激动剂激活，但是鼠tlr8能够被dsdna牛痘病毒激活。人的tlr8不仅能下调tlr7和tlr9的信号，还可以上调tlr2表达。
4.tlr8基因激动剂(例如vtx
‑
2337)已经在一些癌症的联合治疗中作为免疫刺激剂进行了临床试验，增强利妥昔单抗(rituximab)介导的抗体依赖性细胞毒性，另一种tlr8激动剂(vtx
‑
1463)目前正在开发中，用于过敏性鼻炎的治疗。通过激活tlr8信号，细胞因子反应可以激活抗原细胞，从而诱导th1型免疫反应。tlr8在自身免疫紊乱中起作用，如系统性红斑狼疮(sle)，还有x
‑
linked inflammatory bowel disease(ibd)易感基因，其也与类风湿关节炎、牛皮癣、i型糖尿病有关。
5.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，例如人tlr8和小鼠tlr8蛋白序列的一致性为66.58％，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
6.鉴于tlr8在病原体识别和先天免疫的激活中起着重要作用，为进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域亟需开发涉及tlr8信号通路的非人动物模型。


技术实现要素：

7.本发明的第一方面，提供了一种嵌合tlr8蛋白，所述的嵌合tlr8蛋白包含人tlr8蛋白的全部或部分。
8.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白包含人tlr8蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。
9.进一步优选的，所述的嵌合tlr8蛋白包含人tlr8蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分。
10.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白还包含非人动物tlr8蛋白的部分，优选为非人动物tlr8蛋白的跨膜区、胞质区。
11.进一步优选的，所述的嵌合tlr8蛋白包含信号肽、跨膜区、胞质区和胞外区，其中，所述的胞外区包含人tlr8蛋白胞外区的全部或部分，优选的，所述的人tlr8蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，例如至少200、250、300、350、400、500、600、700、750、770、790、791、791、793、794、795、780、800、801个氨基酸的与人tlr8蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含792个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；优选的，包含c端去除0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区，进一步优选的，包含c端去除9、5或2个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；更进一步优选的，胞外区包含与seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位所示氨基酸序列；所述的信号肽包含人tlr8蛋白信号肽的全部或部分，优选的，所述的人tlr8蛋白信号肽的部分包含至少10、15或20个氨基酸，例如至少10、15、17、20、21、22、23、24、25、26个氨基酸的与人tlr8蛋白信号肽一致，进一步优选的，包含22个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽；优选的，所述的信号肽的部分包含n端去除0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽，进一步优选的，信号肽包含与seq id no：4的第5
‑
26位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含seq id no：4的第5
‑
26位所示的氨基酸序列。
12.优选的，所述的跨膜区、胞质区来源于非人动物，所述的胞外区至多0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白胞外区，信号肽至多0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸序列来源于非人动物，其中，所述的胞外区包含c端0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白胞外区，进一步优选的，包含c端9、5或2个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白胞外区；优选的，所述的信号肽的部分包含n端0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白信号肽，进一步优选的，包含n端4个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白信号肽。
13.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白包含人tlr8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列的全部或部分，优选的，所述的嵌合tlr8蛋白包含人tlr8基因的2号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列的全部或部分；其中，2号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、1000、1500、2000、2200、2400、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2450、2500、3000、3500、4000、4100、4162bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含2442bp的核苷酸序列；优选的，所述人tlr8基因的2号外显子的部分至少包含从编码2
号外显子第1
‑
5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至编码胞外区c端1
‑
15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列为止，进一步优选的，从编码2号外显子第4个氨基酸的核苷酸序列开始。
14.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白至少包含seq id no：7编码的氨基酸序列，或包含与seq id no：7编码的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合tlr8蛋白中包含的人tlr8蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
16.a)包含seq id no：4第5
‑
818、1
‑
818、1
‑
822、1
‑
825、5
‑
822或5
‑
825位氨基酸序列的全部或部分；
17.b)包含与seq id no：4的第5
‑
818、1
‑
818、1
‑
822、1
‑
825、5
‑
822或5
‑
825位氨基酸序列同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
18.c)包含与seq id no：4的第5
‑
818、1
‑
818、1
‑
822、1
‑
825、5
‑
822或5
‑
825位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
19.d)包含seq id no：4的第5
‑
818、1
‑
818、1
‑
822、1
‑
825、5
‑
822或5
‑
825位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
20.在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合tlr8蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
21.a)包含seq id no：13氨基酸序列的全部或部分；
22.b)包含与seq id no：13氨基酸序列同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
23.c)包含与seq id no：13所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
24.d)包含seq id no：13所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
25.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
26.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
27.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
28.本发明的第二方面，提供了一种tlr8嵌合基因，所述的tlr8嵌合基因包含人tlr8基因的部分。
29.优选的，所述的tlr8嵌合基因包含编码人tlr8蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的tlr8嵌合基因包含编码人tlr8蛋白的
信号肽和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的胞外区包含人tlr8蛋白胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人tlr8蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，例如至少200、250、300、350、400、500、600、700、750、770、790、791、791、793、794、795、780、800、801个氨基酸的与人tlr8蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含792个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；优选的，包含c端去除0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区，更优选的，包含c端去除9、5或2个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；更进一步优选的，胞外区包含与seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位所示的氨基酸序列；所述的信号肽包含人tlr8蛋白信号肽的全部或部分，优选的，所述的人tlr8蛋白信号肽的部分包含至少10、15或20个氨基酸，例如至少10、15、17、20、21、22、23、24、25、26个氨基酸的与人tlr8蛋白信号肽一致，进一步优选的，包含22个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽；优选的，所述的信号肽的部分包含n端去除0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽，进一步优选的，信号肽包含与seq id no：4的第5
‑
26位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：4的第5
‑
26位所示的氨基酸序列。
30.优选的，所述的tlr8嵌合基因包含编码非人动物的跨膜区、胞质区的核苷酸序列，编码非人动物的胞外区至多0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列，编码非人动物的信号肽至多0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列，其中，所述的胞外区包含c端0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白胞外区，进一步优选的，包含c端前9、5或2个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白胞外区；优选的，所述的信号肽的部分包含n端后0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白信号肽，进一步优选的，包含n端后4个氨基酸序列来源于非人动物tlr8蛋白信号肽。
31.优选的，所述的tlr8嵌合基因编码上述的嵌合tlr8蛋白。
32.优选的，所述的tlr8嵌合基因包含人tlr8基因的1号外显子至2号外显子的全部或部分，优选的，所述的tlr8嵌合基因包含人tlr8基因的2号外显子的全部或部分；其中，2号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、1000、1500、2000、2200、2400、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2450、2500、3000、3500、4000、4100、4162bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含2442bp的核苷酸序列；优选的，所述人tlr8基因的2号外显子的部分至少包含从编码2号外显子第1
‑
5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至编码胞外区c端1
‑
15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列为止，更优选的，从编码2号外显子第4个氨基酸的核苷酸序列开始。
33.优选的，所述的tlr8嵌合基因中至少包含seq id no：8、9、10或11所示核苷酸序列，或包含与seq id no：8、9、10或11具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。
34.在本发明的一个具体实施方式中，所述的tlr8嵌合基因中包含的人tlr8核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
35.(a)包含seq id no：7所示核苷酸序列的全部或部分；
36.(b)包含与seq id no：7所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
37.(c)包含与seq id no：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
38.(d)具有seq id no：7所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
39.优选的，所述的tlr8嵌合基因还包括非人动物tlr8基因的1号外显子、2号外显子和/或3号外显子的部分；优选的，所述的非人动物tlr8基因的1号外显子、2号外显子和/或3号外显子的部分与nc_000086.7相应的1号至3号外显子至少具有70％、80％、90％或至少95％的同一性；进一步优选的，所述的非人动物tlr8基因的1号外显子、2号外显子和/或3号外显子的部分与seq id no：1相应的1号外显子、2号外显子、3号外显子一致。
40.在本发明的一个具体实施方式中，所述的tlr8嵌合基因的核苷酸序列转录的mrna选自下列组中的一种：
41.(a)包含seq id no：12所示核苷酸序列的全部或部分；
42.(b)包含与seq id no：12所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
43.(c)包含与seq id no：12所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
44.(d)包含seq id no：12所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
45.优选的，所述的tlr8嵌合基因包含编码人tlr8蛋白的cdna。
46.优选的，所述的tlr8嵌合基因包含人tlr8 2号外显子的cdna序列。
47.优选的，所述的tlr8嵌合基因还包含人tlr8非编码区。
48.任选地，所述的tlr8嵌合基因对于被替换的内源tlr8基因座是纯合或者杂合。
49.优选的，所述的tlr8嵌合基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
50.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet
‑
off system/tet
‑
on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
51.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
52.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
53.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
54.本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人tlr8基因的部分。
55.优选的，所述的人tlr8基因的部分包含人tlr8基因的1号至2号外显子的全部或部分；优选的，所述的人tlr8基因的部分包含2号外显子的全部或部分；其中，2号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、1000、1500、2000、2200、2400、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2450、2500、3000、3500、4000、4100、4162bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含2442bp的核苷酸序列；优选的，所述人tlr8基因的2号外显子的部分至少包含从编码第1
‑
5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至编码胞外区c端1
‑
15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列为止，进一步优选的，从编码2号外显子第4个氨基酸的核苷酸序列开始，更优选的，所述的人tlr8核苷酸序列的部分至少包含seq id no：7所示核苷酸序列。
56.优选的，所述的靶向载体包含编码人tlr8蛋白的cdna。
57.优选的，所述的靶向载体包含人tlr8 2号外显子的cdna序列。
58.优选的，所述的靶向载体还包含人tlr8非编码区。
59.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自非人动物tlr8基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000086.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：5至少具有90％同源性，或者如seq id no：5所示。
60.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂，其选自非人动物tlr8基因基因组dna的100
‑
10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000086.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：6至少具有90％同源性，或者如seq id no：6所示。
61.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物trl8基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物trl8基因3号外显子上。
62.优选的，所述的靶向载体还包含seq id no：8、9、10和/或11。
63.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
64.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
65.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
66.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
67.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
68.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdc
scid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、
rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
69.本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
70.本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在tlr8基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
71.本发明的第六方面，提供了一种tlr8基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人tlr8蛋白或嵌合tlr8蛋白。
72.优选的，所述的非人动物的内源tlr8蛋白表达降低或缺失。
73.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白选自上述的嵌合tlr8蛋白。
74.优选的，所述的非人动物体内包含人tlr8基因的部分，进一步优选的，所述的非人动物体内包含上述的tlr8嵌合基因。
75.优选的，所述的人tlr8基因的部分或tlr8嵌合基因的核苷酸序列可操作的连接至内源调控元件后。
76.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
77.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
78.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod
‑
prkdcscid il
‑
2rγ
null
小鼠、nod
‑
rag 1
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(nrg)小鼠、rag 2
‑
/
‑
‑
il2rg
‑
/
‑
(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
79.本发明的第七方面，提供了一种tlr8基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人tlr8蛋白或嵌合tlr8蛋白。
80.优选的，所述的嵌合tlr8蛋白如上述的嵌合tlr8蛋白。
81.优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人tlr8基因或tlr8嵌合基因，所述的tlr8嵌合基因如上述的tlr8嵌合基因。
82.优选的，所述的非人动物为上述的tlr8基因人源化的非人动物。
83.优选的，所述的人tlr8基因的部分或tlr8嵌合基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。
84.优选的，所述的构建方法包括用包含人tlr8基因的部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座；优选的，用包含人tlr8基因的1号至2号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座，优选的，用包含人tlr8基因的2号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座；其中，2号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、1000、1500、2000、2200、2400、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2450、2500、3000、3500、4000、4100、4162bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含2442bp的核苷酸序列；优选的，所述人tlr8基因的2号外显子的部分至少包含从编码2号外显子第1
‑
5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至编码胞外区c端1
‑
15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列为止，进一步优选的，从编码2号外显子第4个氨基酸的核苷酸序列开始，更优选的，用包含seq id no：7的核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座。
85.优选的，所述的构建方法包括用包含人tlr8基因的2号外显子全部或部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因的3号外显子的全部或部分；所述非人动物tlr8核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从编码非人动物3号外显子第1
‑
5(例如1、2、3、4、5)个氨基酸的核苷酸序列开始至编码胞外区c端1
‑
15(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的核苷酸序列为止，更进一步优选的，从编码非人动物3号外显子第4个氨基酸的核苷酸序列开始。
86.优选的，所述的构建方法包括用包含编码人tlr8蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座；进一步优选的，用包含编码人tlr8蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座，其中，所述的胞外区包含人tlr8蛋白胞外区的全部或部分，优选的，所述的人tlr8蛋白胞外区的部分包含至少200、250、300或350个氨基酸，例如至少200、250、300、350、400、500、600、700、750、770、790、791、791、793、794、795、780、800、801个氨基酸的与人tlr8蛋白胞外区一致，进一步优选的，包含792个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；优选的，包含c端去除0
‑
15(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区，进一步优选的，包含c端去除9、5或2个氨基酸的人tlr8蛋白胞外区；更进一步优选的，胞外区包含与seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：4的第27
‑
818位、第27
‑
822位或第27
‑
825位所示的氨基酸序列；所述的信号肽包含人tlr8蛋白信号肽的全部或部分，优选的，所述的人tlr8蛋白信号肽的部分包含至少10、15或20个氨基酸，例如至少10、15、17、20、21、22、23、24、25、26个氨基酸的与人tlr8蛋白信号肽一致，进一步优选的，包含22个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽；优选的，所述的信号肽的部分包含n端去除0
‑
5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人tlr8蛋白信号肽，进一步优选的，信号肽包含与seq id no：4的第5
‑
26位具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与seq id no：4的第5
‑
26位所示的氨基酸序列。
87.在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人tlr8蛋白的cdna序列导入非人动物tlr8基因座。
88.优选的，所述的构建方法包括用包含所述tlr8嵌合基因的核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座。
89.优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述嵌合tlr8蛋白的核苷酸序列导入非人动物tlr8基因座。
90.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。
91.优选的，所述的插入或替换位点为tlr8基因的内源调控元件之后。
92.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源tlr8基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源tlr8基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
93.优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。
94.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含tlr8嵌合基因。
95.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人tlr8蛋白或嵌合tlr8蛋白。
96.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
97.优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
98.本发明的第八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
99.i)提供上述的tlr8基因人源化的非人动物或tlr8基因敲除的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的tlr8基因人源化的非人动物；
100.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
101.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因cd3、pd
‑
l1、pd
‑
1等人源化的非人动物。
102.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
103.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
104.本发明的第九方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代，所述的非人动物或其子代选自tlr8基因人源化的非人动物、tlr8基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物。
105.本发明的第十方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
106.本发明的第十一方面，提供了一种动物模型的制备方法，所述的制备方法包括上述构建tlr8基因人源化的非人动物、tlr8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤；优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
107.本发明的第十二方面，提供了上述tlr8基因人源化的非人动物、上述tlr8基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的tlr8基因人源化的非人动物、上述tlr8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
108.本发明的第十三方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
109.本发明的第十四方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
110.本发明的第十五方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的
非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
111.本发明的第十六方面，提供了一种tlr8基因人源化的细胞，所述的细胞表达人tlr8蛋白或嵌合tlr8蛋白。
112.优选的，所述的细胞中内源tlr8蛋白的表达降低或缺失。
113.优选的，所述的细胞的基因组中包含人tlr8核苷酸序列的部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的tlr8嵌合基因。
114.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
115.本发明的第十七方面，提供了一种tlr8基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失tlr8基因的全部或部分核苷酸序列。
116.优选的，所述的细胞缺失tlr8基因的3号外显子的全部或部分核苷酸序列。
117.本发明的第十八方面，提供了一种表达上述的嵌合tlr8蛋白的构建体。优选的，所述的构建体中包含上述tlr8嵌合基因。
118.优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
119.本发明的第十九方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
120.本发明的第二十方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。
121.本发明的第二十一方面，提供了来源于上述的嵌合tlr8蛋白、上述的tlr8嵌合基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究tlr8功能、人tlr8信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。
122.优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
123.本发明的第二十二方面，提供了上述tlr8基因人源化的非人动物、上述tlr8基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的tlr8基因人源化的非人动物、上述tlr8基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备人tlr8特异性调节剂或者筛选人tlr8特异性调节剂的产品中的应用。
124.本发明的第二十三方面，提供了一种人tlr8特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。
125.优选的，所述的调节剂选自car
‑
t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
126.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
127.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
128.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
129.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
130.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
131.优选的，所述人tlr8特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
132.本发明的第二十四方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。
133.优选的，所述的干预方案选自car
‑
t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。
134.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
135.优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
136.本发明的第二十五方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的肿瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。
137.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括b或t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞白血病(aml)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)、鼻咽癌、肺癌。
138.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。在本发明的
一个具体实施方式中。所述的免疫相关疾病为类风湿性关节炎。
139.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
140.本发明所述的tlr8基因人源化的非人动物体内可以正常表达人tlr8蛋白或嵌合tlr8蛋白。可用于针对人tlr8靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究tlr8蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
141.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
142.本发明所述的“嵌合tlr8蛋白”，包含来源于人tlr8蛋白的部分和非人tlr8蛋白的部分。其中，所述的“人tlr8蛋白”同“人tlr8蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人tlr8蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人tlr8蛋白的部分”，为连续或间隔的5
‑
1041个氨基酸序列与人tlr8蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔10
‑
814，10
‑
818,10
‑
821，10
‑
822，10
‑
825，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、814、818、821、822、825、900、1000、1010、1020、1030、1040、1041个氨基酸序列与人tlr8蛋白的氨基酸序列一致。
143.本发明所述的“人tlr8蛋白的跨膜区的全部”、“人tlr8蛋白的胞质区的全部”或“人tlr8蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人tlr8蛋白的跨膜区、胞质区或胞外区的全长氨基酸序列一致。
144.本发明所述的“人tlr8蛋白的信号肽的部分”，为连续或间隔5
‑
26个氨基酸序列与人tlr8蛋白的信号肽氨基酸序列一致，优选为连续或间隔5
‑
22个，更优选为连续5、10、20、21、22、23、24、25、26个氨基酸序列与人tlr8蛋白的信号肽氨基酸序列一致。
145.本发明所述的“人tlr8蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5
‑
801个氨基酸序列与人tlr8蛋白的胞外区氨基酸序列一致，优选为连续或间隔5
‑
792个，5
‑
796个,5
‑
799个，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、350、400、500、600、700、750、760、770、780、790、792、796、799、800、801个氨基酸序列与人tlr8蛋白的胞外区氨基酸序列一致。
146.本发明所述的“tlr8嵌合基因”，包含来源于人tlr8核苷酸序列的部分和非人tlr8基因的部分。其中，所述的“人tlr8核苷酸序列”同“人tlr8核苷酸序列的全部”，即其核苷酸序列与人tlr8核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人tlr8核苷酸序列的部分”为连续或间隔的20
‑
16549bp个核苷酸序列与人tlr8核苷酸序列一致，优选为20
‑
2442个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、2442、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、16549bp个核苷酸序列与人tlr8核苷酸序列一致。
147.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至3号外显子”包含1号外显子、1
‑
2号内含子、2号外显子、2
‑
3号内含子、3号外显子的全部核苷酸序列。
148.本发明所述的“x
‑
xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如
“1‑
2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
149.本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人tlr8核苷酸序列的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5
‑
4125bp个，优选10
‑
2441bp个核苷酸序列与人tlr8核苷酸序列的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“tlr8嵌合基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子第2个核苷酸开始至2号外显子的最后一个核苷酸序列为止。
150.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“tlr8基因座”表示tlr8基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。优选为1号外显子、2号外显子、3号外显子的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分。
151.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre
‑
mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
152.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
153.本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
154.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
155.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes iand ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，
vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expressiontechnology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
156.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
157.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠及nod、nod/scid、nod
‑
prkdcscid il
‑
2rgnull背景的小鼠。
158.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
159.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
160.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
161.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
162.图1：小鼠tlr8基因座和人tlr8基因座对比示意图(非按比例)；
163.图2：小鼠tlr8基因人源化改造示意图(非按比例)；
164.图3：tlr8基因打靶策略及靶向a片段设计示意图(非按比例)；
165.图4：tlr8重组后细胞southern blot结果，其中wt为野生型对照；
166.图5：tlr8小鼠人源化frt重组过程示意图(非按比例)；
167.图6：tlr8人源化小鼠f1代基因型鉴定结果，其中，wt为野生型，h2o为水对照，pc为阳性对照。
具体实施方式
168.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
169.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
170.econi、scai、draiii酶购自neb，货号分别为r0521、r3122、r3510；
171.lipopolysaccharides from escherichia coli o111:b4购自sigma，货号：l2630；
172.attune nxt acoustic focusing cytometer购自thermofisher，型号attunenxt；
173.primescript 1ststrandcdnasynthesiskit购自takara，型号6110a；
174.heraeus
tm fresco
tm 21microcentrifuge购自thermofisher，型号fresco 21；
175.brilliant violet 711
tm anti
‑
mouse tcrβchain购自biolegend，货号：109243；
176.brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45购自biolegend，货号：103138；
177.pe/cy
tm 7anti
‑
mouse/rat foxp3购自ebioscience
tm
，货号：25
‑
5773
‑
82；
178.brilliant violet 421
tm anti
‑
mouse cd4购自biolegend，货号：100438；
179.percp anti
‑
mouse ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)antibody购自biolegend，货号：108426；
180.fitc anti
‑
mouse f4/80购自biolegend，货号：123108；
181.v450 rat anti
‑
mouse cd11b购自biolegend，货号：560455；
182.apc anti
‑
human cd288(tlr8)antibody购自biolegend，货号：395505；
183.tlr8 monoclonal antibody(44c143),pe购自invitrogen，货号：ma5
‑
16194；
184.brilliant violet 605
tm
anti
‑
mouse cd11c购自biolegend，货号：117334；
185.pe mouse igg1,κisotype ctrl购自biolegend，货号：400112；
186.apc mouse igg2a,k isotype ctrl(fc)购自biolegend，货号：400222。
187.实施例1tlr8基因人源化小鼠
188.本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码嵌合tlr8蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达嵌合tlr8蛋白(即人源化tlr8蛋白)。小鼠tlr8基因(ncbi gene id：170744，primary source：mgi：2176887，uniprot id：p58682，位于x染色体nc_000086.7的第167241123至167264329位，基于转录本nm_133212.3(seq id no：1)及其编码蛋白np_57345.2(seq id no：2)和人tlr8基因(ncbi gene id：51311，primary source：hgnc:15632，uniprot id：q9nr97，位于x染色体nc_000023.11的第12906620至12923169位，基于转录本nm_138636.5(seq id no：3)及其编码蛋白np_619542.1(seq id no：4)，小鼠tlr8基因座与人tlr8基因座对比示意图如图1所示。
189.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源tlr8基因座引入部分编码人tlr8蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化tlr8蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术将小鼠tlr8基因的3号外显子2415bp核苷酸序列用对应的人tlr8基因的2号外显子2442bp核苷酸序列替换，得到人源化tlr8基因(即tlr8嵌合基因)序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠tlr8基因的人源化改造。
190.如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠tlr8基因上游和下
游的同源臂序列，以及包含人tlr8基因序列的a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000086.7的第167245841至167252904位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：6)与ncbi登录号为nc_000086.7的第167237001至167240744位核苷酸序列相同；a片段上包含人tlr8基因的2号外显子部分序列的基因组dna序列(seq id no：7)，该dna序列与ncbi登录号为nc_0000023.11的第12919053至12921494位核苷酸序列相同；a片段中人tlr8序列上游与小鼠tlr8基因的连接设计为5
’‑
tacaatactttcattgttggtattccttaggaaaacatgttcattgttggtattccttaggaaaacatgtcagtcgtcaatgctgacctgcattttcctgctaat
‑3’
(seq id no：8)，其中序列“acatg”中的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“ttcct”中的第一个“t”是人的第一个核苷酸；人tlr8序列下游与小鼠tlr8基因的连接设计为5
’‑
cctggggatcaaagagggaagagtattgtgagtctggaggacttgtgtatcggataccactgcagctgt
‑3’
(seq id no：9)，其中序列“tggag”中的最后一个“g”是人的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。
191.靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为5
’‑
gaccaagctacaccaccatatatgcagatggtcttgctccggtatcgataagcttgatatcgaattccgaagttcctattctctagaaagtatagga
‑3’
(seq id no：10)，其中序列“tgctc”中的最后一个“c”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“gtcga”中的第一个“g”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为5
’‑
agtataggaacttcatcagtcaggtacataatggtgaggctccctggttagtggttcagtctctgtgagcccctg
‑3’
(seq id no：11)，其中序列中的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列“aggct”中的“a”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠tlr8的mrna序列如seq id no：12所示，表达的蛋白序列如seq id no：13所示。
192.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用econi或draiii或scai消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果见如图4所示，检测结果表明3个经pcr验证为阳性的克隆，经测序发现除3
‑
g01外，其余3个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为3
‑
f05、4
‑
d08、4
‑
e07。
193.表1：具体探针及目的片段长度
194.限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小econi3’probe9.7kb11.6kbdraiii5’probe
‑
a22.5kb17.1kbscaineo probe(3’)—9.0kb
195.其中，pcr测定包括下述引物：
[0196][0197]
southern blot检测包括如下探针引物：
[0198]5’
探针(5’probe
‑
a)：
[0199]5’
probe
‑
a
‑
f：5
’‑
tcctcaggagaactgaaggccatgt
‑3’
(seq id no：20)，
[0200]5’
probe
‑
a
‑
r：5
’‑
gcacccacaaaagattcaagtctgcc
‑3’
(seq id no：21)；
[0201]3’
探针(3’probe)：
[0202]3’
probe
‑
f：5
’‑
attttccacagcatttgagtcttgc
‑3’
(seq id no：22)，
[0203]3’
probe
‑
r：5
’‑
gtatgtggtaaatttgaggatgccc
‑3’
(seq id no：23)；
[0204]
neo探针(neo probe)：
[0205]
neo probe(3’)
‑
f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagat
‑3’
(seq id no：24)，
[0206]
neo probe(3’)
‑
r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggc
‑3’
(seq id no：25)。
[0207]
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到tlr8基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图6的a
‑
d，其中，编号为f1
‑
01、f1
‑
02、f1
‑
03、f1
‑
06、f1
‑
07、f1
‑
08和f1
‑
09的7只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的tlr8人源化基因工程小鼠。
[0208]
表2：引物名称及具体序列
[0209][0210]
进一步采用流式细胞术检测tlr8基因人源化小鼠体内tlr8蛋白的表达情况。选取9周龄野生型c57bl/6小鼠和tlr8基因人源化纯合子小鼠各1只，安乐死后取脾脏细胞，分别用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm anti
‑
mouse cd45(mcd45)、抗鼠cd4抗体brilliant violet 605
tm anti
‑
mouse cd4 antibody(mcd4)、抗鼠cd8a抗体brilliant violet 711
tm anti
‑
mouse cd8a(mcd8a)，抗鼠gr
‑
1抗体percp anti
‑
mouse ly
‑
6g/ly
‑
6c(gr
‑
1)antibody(mgr
‑
1)、抗鼠f4/80抗体fitc anti
‑
mouse f4/80antibody(m f4/80)、抗鼠cd11b抗体v450 rat anti
‑
mouse cd11b(mcd11b)、抗人cd288抗体apc anti
‑
human cd288(htlr8)antibody(htlr8)、人鼠tlr8蛋白交叉识别抗体pe tlr8 monoclonal antibody(44c143)(mtlr8)、抗鼠cd11c抗体brilliant violet 605
tm
anti
‑
mouse cd11c(mcd11c)识别染色后进行流式检测。
[0211]
结果表明，c57bl/6小鼠脾脏中树突细胞(dc细胞)(特征为mcd45 mtcrβ
‑
mcd11c )有35.8％mtlr8阳性细胞(特征为mcd45 mtcrβ
‑
mcd11c mtlr8 ),有0.86％htlr8阳性细胞(特征为mcd45 mtcrβ
‑
mcd11c htlr8 )，tlr8基因人源化纯合子小鼠脾脏中树突细胞(dc细胞)有24.5％mtlr8阳性细胞，有25.8％htlr8阳性细胞；
[0212]
c57bl/6小鼠脾脏中单核细胞(特征为mcd45 mgr
‑1‑
mcd11b mf4/80
‑
)有2.37％mtlr8阳性细胞(特征为mcd45 mgr
‑1‑
mcd11b mf4/80
‑
mtlr8 )，有0.39％htlr8阳性细胞(特征为mcd45 mgr
‑1‑
mcd11b mf4/80
‑
htlr8 )，tlr8基因人源化小鼠脾脏中单核细胞有3.27％mtlr8阳性细胞，有3.15％htlr8阳性细胞。
[0213]
在上述实验中，人鼠tlr8蛋白交叉识别抗体pe tlr8 monoclonal antibody(44c143)(mtlr8)可交叉识别鼠tlr8蛋白和人tlr8蛋白，因此在tlr8基因人源化小鼠dc细胞和单核细胞中均检测到阳性信号；抗人cd288抗体apc anti
‑
human cd288(htlr8)antibody(htlr8)为特异性结合人tlr8蛋白的抗体，在tlr8基因人源化小鼠dc细胞和单核细胞中均检测到htlr8信号，而未检测到mtlr8。综上结果表明，仅在tlr8基因人源化纯合子小鼠的脾脏中检测到人源化tlr8蛋白表达。
[0214]
实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
[0215]
利用本方法或制得的tlr8小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有cd3、pd
‑
l1、pd
‑
1等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在tlr8人源化小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基
因重组打靶技术，获得tlr8与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的tlr8小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到tlr8与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的人源化杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人tlr8和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0216]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0217]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0218]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。