一种甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、编码基因及应用的制作方法

一种甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶、编码基因及应用
技术领域
1.本发明涉及一种甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶、编码基因及应用。


背景技术：

2.目前，由条形柄锈菌小麦专化型(puccinia striiformis f.sp.tritici,pst)真菌引起的小麦条锈病是世界性禾谷类作物重要病害之一，全球每年造成经济损失巨大。中国由pst生理小种引发了多次大流行，严重危害小麦生产安全，经过长期不懈的努力，中国在小麦条锈病治理中取得了重大进展，但是pst变异性极强，新的致病类型不断涌现，小麦条锈病仍是中国小麦生产上非常受重视的真菌病害。
3.pst作为活体营养专性寄生菌，需要从寄主小麦获取包括糖类在内的多种营养物质用于菌体生长发育。目前已经明确，包括pst在内的活体营养专性寄生真菌在侵染寄主过程中由菌丝高度特化形成吸器，从同位素标记饲喂实验到转录表达分析均表明吸器具有吸收营养物质的功能。活体营养专性寄生菌吸器穿透寄主细胞壁后并未真正破坏寄主的细胞质膜，寄主细胞质膜内陷包裹吸器但仍保持完整，并且随着吸器体的膨大这部分寄主细胞质膜也相应的扩大包裹面积，吸器与寄主细胞质膜紧密接触却始终未突破寄主细胞质膜进入原生质。组织细胞学表明这部分寄主细胞质膜在结构上与一般的植物细胞膜不同，寄主细胞无法主动调控物质跨膜流动。pst吸器穿透寄主细胞壁后被小麦细胞质膜形成的鞘所包裹，其吸器颈处产生一个颈环连同吸器外基质形成一个特殊封闭的质外体。
4.质外体是植物细胞间营养交流的基础空间，也是病原菌获取寄主的包括糖在内多种营养的重要场所。正常生长条件下植物的源器官叶肉细胞光合反应产生的蔗糖被运输到韧皮部薄壁细胞中，这些运输出来的蔗糖随后被筛管伴胞复合体(sieve element companion cell，se
‑
cc)上的蔗糖/质子转运蛋白(sucrose/proton transporter)吸收进入se
‑
cc，随后进行长距离运输供给不能进行光合反应的库器官。植物在正常生长发育过程中严格调控源
‑
库器官间以及库器官间的糖分配。小麦叶片中韧皮部薄壁细胞和se
‑
cc间几乎没有胞间连丝，蔗糖从薄壁细胞进入se
‑
cc前，先被运输到质外体。发明人发现不同毒力的pst小种侵染小麦造成小麦质外体中的糖浓度发生动态变化，并且质外体中糖类浓度与pst致病性存在功能上的联系。目前在pst中唯一报道的己糖转运基因pshxt1编码产物仅对葡萄糖具有高亲和力。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：pst的蔗糖酶基因psinv编码产物可以高效分解小麦的蔗糖，目前pst中仅发现转运葡萄糖的基因产物，但尚未发现可以转运果糖的基因产物，产生的果糖累积将提高小麦质外体中比值从而激发小麦的抗性反应。成功侵染的pst如何克服果糖累积介导的小麦抗性尚未解决。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：pst基因组中预测编码产物的基因数量众多而已经完成功能注释的数量极少，通常的基因敲除和回补后根据表型分析基因产物功能的方法在活体专性寄生菌pst中难以凑效，增加了甄别糖转运基因的难度。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：获得的具有甘露糖转运功能的甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶基因有助于系统探讨pst
‑
小麦互作机理，并为开发基于核酸的小分子农药提供靶标，具有重要的理论意义及较强的应用潜力。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种条形柄锈菌小麦专化型真菌的甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶、编码基因及应用。
9.本发明提供的蛋白是一种甘露糖转运蛋白，来源于条形柄锈菌小麦专化型真菌，所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶包括：从条形柄锈菌小麦专化型真菌中克隆得到甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶基因psmt1，所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的氨基酸序列由414个氨基酸残基组成。
10.本发明的另一目的在于提供一种应用所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶衍生的蛋白质，所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶衍生的蛋白质是将seq id no：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与甘露糖、果糖转运相关的由所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶衍生的蛋白质。
11.本发明的另一目的在于提供一种多肽，所述多肽是编码含有与seq id no：1所示的至少80％相同的氨基酸序列的多肽，且与甘露糖、果糖转运相关。
12.本发明的另一目的在于提供一种编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的核苷酸，所述编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的核苷酸序列包括如下
①‑③
中的任意一种：
13.①
所述编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的dna核苷酸序列如seq id no：2所示，所述核苷酸全长1774bp；所述编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的cdna核苷酸序列如seq id no：3所示，所述核苷酸全长1245bp；
14.②
所述编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的核苷酸为在严格条件下与编码包括如seq id no：2所示序列的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，且所述核苷酸序列编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶；
15.③
与
①
或
②
的多核苷酸互补的多核苷酸。
16.本发明的另一目的在于提供一种引物，所述引物是由扩增所述多核苷酸序列全长或任一片段得到。
17.本发明的另一目的在于提供一种所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶在作为小分子核苷酸农药的目的基因中的应用。
18.本发明的另一目的在于提供一种所述编码所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶的核苷酸在作为小分子核苷酸农药的目的基因中的应用。
19.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶，来源于条形柄锈菌小麦专化型真菌。本发明甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶psmt1为己糖转运蛋白家族成员，具有甘露糖转运功能，在催化果糖转化为甘露糖过程中起重要作用。通过基因工程技术抑制psmt1基因表达，能够影响小麦条锈菌的菌体生长，降低小麦条锈菌的致病性，在开发小分子核苷酸农药防治小麦条锈病方面具有良好的应用前景。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是本发明实施例提供的在psmt1基因5’引入bamhi，在3’引入xhoi酶切位点后的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图；m：从上到下依次是2000,1000,750,500,250,100bp；1：psmt1的扩增产物。
22.图2是本发明实施例提供的psmt1基因克隆到pdr196载体的菌落pcr鉴定琼脂糖凝胶电泳图；c1
‑
c3：转化pdr196空载体；t1
‑
t4：带psmt1基因的转化子。
23.图3是本发明实施例提供的己糖吸收功能缺陷型酵母eby.vw4000导入本发明提供的psmt1基因后在多种单糖或蔗糖为唯一碳源的培养基上生长情况；c代表转化pdr196空载体的酵母菌；t代表转化psmt1基因的酵母菌；(a)甘露糖；(b)半乳糖；(c)葡萄糖；(d)蔗糖。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种甘露糖
‑1‑
磷酸鸟苷酰转移酶、编码基因及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
26.条形柄锈菌小麦专化型：天津市农作物研究所保存。
27.酵母突变体eby.vw4000：中国农业大学眭晓蕾教授惠赠。
28.质粒pdr196：中国农业大学眭晓蕾教授惠赠。
29.seq id no：1为：
30.met ala ser lys ala val tyr leu leu gly gly pro ser lys gly thr
31.arg met arg pro leu thr leu asp ile pro lys pro leu phe pro leu
32.ala gly arg ala ile ile trp his gly ile gln ala leu ser lys ile
33.pro asp leu lys glu val leu leu ile gly phe tyr glu asp ser val
34.leu ala pro phe ile lys gln ala ser arg asp phe pro ser val gln
35.ile lys tyr met arg glu tyr glu ala leu gly thr ala gly gly leu
36.tyr his phe arg asp ala ile leu lys gly ser pro glu gln ile tyr
37.val leu his ser asp ile ala ser ser phe pro leu leu glu leu lys
38.his phe his asp lys his arg gly val gly thr leu met ala val arg
39.val ser lys gln leu ser thr lys phe gly cys ile val thr asn pro
40.glu thr ser gln ala leu his tyr val glu lys pro glu ser phe leu
41.ser glu ile ile asn thr gly val tyr leu phe asp lys ser ile phe
42.asp glu ile lys ala ala met asp leu lys val lys gln ser val asp
43.asp pro leu ser arg gln asp asp leu leu arg leu glu gln asp val
44.ile ser pro leu ala asp arg gly lys leu tyr val tyr glu thr lys
45.ser leu trp lys gln ile lys thr ala gly ser ala leu pro ala asn
46.thr leu val leu glu ser tyr lys ser asn asn pro val leu leu arg
47.arg arg ser pro thr ile ile ala lys ala pro pro thr asn val leu
48.gly pro glu ile val glu pro cys tyr ile asp glu thr ala val ile
49.asp pro ser ala lys ile gly pro asn val ser ile gly ala asn val
50.lys ile gly phe gly val arg val arg asp ser ile val leu asp asn
51.ser val leu glu gln asn ser cys val met phe ser ile leu ser glu
52.asp thr lys ile gly pro trp ala arg val glu gly cys pro asp val
53.ser asp ala ser asp asn lys phe ser ile ser val leu ala lys asp
54.val glu val lys ser glu ile his val arg ser cys ile val leu pro
55.his lys thr leu gly arg ser ser ala asn glu val leu leu
56.seq id no：2为：
57.atggcttcgaaagctgtctatctactcggcggtcctagcaaggtaaagagacgaataccgaccacaatttcgaatgctacgttccgatcttgagaagcttaactgaccctttcttactactaaacctatgtctagggtactcgaatgcgtcccttgacgctcgatatccccaagccgctgtttccactcgccggtagagcaatcatctggcatgggatccaagccctgtccaagattcccgatctgaaggaagtcctacttatcggattctacgaggactcggtactggctccatttatcaagcaggctagccgggacttcccttccgttcaaatcaagtcagccccctcctttccctccatccgacatcatccgaattatcgttgactgacgctcgatcgatcgtctttaccgatatgatgtgacagatacatgcgcgaatacgaagcgcttggtacggctggagggctctatcatttccgagatgcgatcctgaaaggctcgcccgaacagatctacgtgctccactcagacatagcctcctcgttcccgctcctcgagctgaagcactttcacgataagcatcgtggcgtgggcaccctcatggccgttcgggtctccaagcaactctcgaccaagttcggttgtatcgtcaccaacccagagacctctcaggctctgcattacgtcgagaaaccggaatcattcctctccgaaatcatcaatactggcgtctatctcttcgataaatctatcttcgatgaaatcaaagccgccatggatctaaaggtcaaacagtcggtgtgagtttttcgtcttctctctctcactttcacgccaaaaaatcatcttcaacgttcggctttaattaactggattggttctgtgttcttgcttcaagtgatgaccctctttctcgtcaggacgatctattacgacttgaacaagacgtcatctcccccttagccgatcgtggaaaactctacgtatacgagaccaagtcgctttggaaacaaatcaagacagctgggtgagtcagctacattttgattttttttacttaaggacctgggaagcgtggcgctaacagccccccgatcgttttacagctctgccttaccggccaacacgcttgttctcgaatcgtacaagtccaacaatccagtgcttctccgtcgacgatcgccaacgatcatcgccaaagcgccaccaacgaacgtactcggaccggagattgtagaaccctgttacatcgatgagacggcggtaattgacccatcggccaagattggtccgaacgtctctattggtgccaacgtcaagattggctttggtgtccgggtcagggactcgatcgtcctcgataatagcgtcctcgaagtgagttcgaccctccccacacatctgaaattcccggttctaattcattttatcccagcaaaatagctgcgtcatgttctccatcctcagtgaggacaccaagattggtccatgggcccgagtcgaaggctgtcccgacgtcagcgatgccagtgacaacaaattcagtatctcagtcttgggtaagcgaaagatccctgatctatcttttctcatgatcctagtctgttatttttttgtcacgtgatactgatcaatcttttatctctgtacgatcgccctcgtgatggtagccaaggatgtcgaagtcaagagcgagatacacgtcaggagttgtatcgttttgccccacaagactttgggtagatcgtccgccaacgaggtcttgttatga
58.seq id no：3为：
59.atggcttcgaaagctgtctatctactcggcggtcctagcaagggtactcgaatgcgtcccttgacgctcgatatccccaagccgctgtttccactcgccggtagagcaatcatctggcatgggatccaagccctgtccaagattcc
cgatctgaaggaagtcctacttatcggattctacgaggactcggtactggctccatttatcaagcaggctagccgggacttcccttccgttcaaatcaaatacatgcgcgaatacgaagcgcttggtacggctggagggctctatcatttccgagatgcgatcctgaaaggctcgcccgaacagatctacgtgctccactcagacatagcctcctcgttcccgctcctcgagctgaagcactttcacgataagcatcgtggcgtgggcaccctcatggccgttcgggtctccaagcaactctcgaccaagttcggttgtatcgtcaccaacccagagacctctcaggctctgcattacgtcgagaaaccggaatcattcctctccgaaatcatcaatactggcgtctatctcttcgataaatctatcttcgatgaaatcaaagccgccatggatctaaaggtcaaacagtcggttgatgaccctctttctcgtcaggacgatctattacgacttgaacaagacgtcatctcccccttagccgatcgtggaaaactctacgtatacgagaccaagtcgctttggaaacaaatcaagacagctggctctgccttaccggccaacacgcttgttctcgaatcgtacaagtccaacaatccagtgcttctccgtcgacgatcgccaacgatcatcgccaaagcgccaccaacgaacgtactcggaccggagattgtagaaccctgttacatcgatgagacggcggtaattgacccatcggccaagattggtccgaacgtctctattggtgccaacgtcaagattggctttggtgtccgggtcagggactcgatcgtcctcgataatagcgtcctcgaacaaaatagctgcgtcatgttctccatcctcagtgaggacaccaagattggtccatgggcccgagtcgaaggctgtcccgacgtcagcgatgccagtgacaacaaattcagtatctcagtcttggccaaggatgtcgaagtcaagagcgagatacacgtcaggagttgtatcgttttgccccacaagactttgggtagatcgtccgccaacgaggtcttgttatga
60.下面结具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
61.实施例1重组质粒构建
62.1.引物设计
63.参照pdr196载体多克隆位点以及psmt1基因cds的酶切位点，在基因5’引入bamhi，在3’引入xhoi酶切位点。引物序列如下：
64.primeridprimersequence(5
’‑3’
)pmtfcggaattcatggcttcgaaagctgtctpmtrccgctcgagtcataacaagacctcgttgg
65.2.模版扩增
66.所用保证酶为toyobo公司kod(kod
‑
101)，反应体系配置如下：
67.componentvolume(μl)10
×
kodbuffer52mmdntps5gdna1216(10μm)1217(10μm)1koddnapolymerase1ddh2o36total50
68.1)pcr反应程序如下：
[0069][0070]
3.pcr产物回收
[0071]
2)加入4倍体积(800μl)的buffer cp到1.5ml离心管(含有pcr反应体积200μl，扩增4管50μl)；剧烈震荡，短暂离心；
[0072]
3)把吸附柱放在收集管里；
[0073]
4)把混合物转入吸附柱(每次750μl，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心)；
[0074]
5)13000g离心1min，弃滤液；
[0075]
6)加入700μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；
[0076]
7)加入500μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；
[0077]
8)13000g离心2min，甩吸附柱上的乙醇；
[0078]
9)把吸附柱转到一个新的1.5ml离心管，在吸附柱中心加入30μl ddh2o，室温放置1min；13000g离心2min，滤液即是回收的dna；
[0079]
对回收的dna进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
[0080]
4.pcr产物连接表达载体
[0081]
4.1 pdr196双酶切
[0082]
1)双酶切按下表配制连接体系：
[0083][0084]
37℃酶切1h，然后加无水乙醇沉淀产物。10μl ddh2o溶解待用。
[0085]
2)连接按下表配制连接体系：
[0086]
componentvolume(μl)5
×
ligationmix2target5pdr1963total10
[0087]
3)轻轻摇匀，短暂离心。
[0088]
4)50℃放置15min。
[0089]
5)连接产物直接转化。
[0090]
6)取出化学感受态细胞dh5a放于冰水混合物中解冻。
[0091]
7)加入连接产物，冰上放置30min。
[0092]
8)将管放于42℃水浴恰好90s，不可摇动。
[0093]
9)快速将管移到冰浴上2min，室温放置5min。
[0094]
10)每管加800μl没有抗生素的lb液体培养基，37℃振荡45min复苏。
[0095]
11)8000rpm离心1min，将上清液去掉800μl，重悬后均匀涂布到kan抗性平板上。
[0096]
12)平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12
‑
16h长出菌落。
[0097]
13)进行菌落pcr鉴定和测序鉴定。
[0098]
5.菌落pcr、测序鉴定
[0099]
挑单菌落溶解于含kan的lb 200μl，吸1μl作为模版加入配好的pcr体系中。pcr体系配制如下：
[0100]
componentvolume(μl)2
×
sgpcrmastermix10t7promoterprimer(10μm)0.5t7terminatorprimer(10μm)0.5菌液1ddh2o7total20
[0101]
以t7 promoter和terminatorprimer为通用测序引物用作菌落鉴定。引物tm为50℃，35个循环扩增后，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
[0102]
同时选阳性克隆进行测序鉴定。测序正确，pdr196
‑
psmt1构建完成。
[0103]
实施例2 psmt1产物的功能验证
[0104]
1、重组质粒转化酵母感受态
[0105]
100℃煮沸1ml鲑鱼精dna 5min，迅速冰浴以制备单链dna。
[0106]
1.5ml离心管中加入100μl酵母感受态细胞，5
‑
10μg待转化重组质粒dna，50μg变性的ss
‑
dna，轻轻涡旋混匀使菌体完全分布均匀。
[0107]
加入600μl灭菌的含0.1m licl/peg4000溶液，涡旋混合10s。
[0108]
30℃230rmp水浴孵育30min。
[0109]
加入70μl dmso，轻轻颠倒混匀。
[0110]
42℃温浴15min，冰上冷却1
‑
2min。
[0111]
室温下14000rmp离心5min，弃上清。
[0112]
500μl灭菌的1
×
te buffer(ph7.4)重悬细胞，室温14000rmp离心3
‑
5s，弃上清。
[0113]
加入300
‑
500μlypd液体培养基，30℃水浴摇床孵育1
‑
4h，分别取100μl涂于含2％麦芽糖的sd
‑
ura(ph5.8)培养基和2％葡萄糖的sd
‑
ura(ph5.8)培养基上，30℃培养生长3
‑
5d。
[0114]
2.重组酵母菌pdr196
‑
psmt1
‑
eby.vw4000的鉴定
[0115]
挑取在含2％葡萄糖的sd
‑
ura(ph5.5)的培养基上生长旺盛的酵母单菌落，接种于
ypd液体培养基中，30℃230rmp水浴孵育振荡过夜。根据酵母质粒小提试剂盒说明书提取质粒。以提取的酵母质粒为模板进行pcr鉴定，并对提取的酵母质粒进行bamhi和xhoi双酶切鉴定。
[0116]
3.糖吸收功能互补试验
[0117]
挑取生长旺盛的酵母(实验组：酵母转化体pdr196
‑
psmt1
‑
eby.vw4000，阴性对照组：pdr196
‑
eby.vw4000)单克隆于含有2％麦芽糖的sd
‑
ura(ph5.8)缺陷型培养基中，振荡培养至od
623
为0.6，并用玻棒划线接种于甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖为唯一碳源的固体培养基上，以转化空载体的为阴性对照。30℃培养2
‑
4天后观察，实验结果如图3的(a)部分
‑
(d)部分所示。
[0118]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。