WHsAg单克隆抗体作为ELISA检测试剂的应用的制作方法

whsag单克隆抗体作为elisa检测试剂的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及两种能运用于whsag elisa检测的 单克隆抗体及其包被抗体和酶标抗体的最佳浓度。


背景技术：

2.目前慢性乙型肝炎的治疗尚有许多问题有待解决，其相关研究离不开合 适的动物模型。土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,whv)在病毒形态、 基因组结构、复制周期等方面与乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)类似， whv可以自然感染旱獭，且感染后的自然经过与hbv感染类似,因此旱獭是 研究hbv较为理想的动物模型。
3.嗜肝dna病毒表面抗原(hbsag、whsag)是嗜肝dna病毒的外壳蛋白， 是嗜肝dna病毒现症感染的标志。目前检测hbsag已经商品化，包括用于人、 大鼠、小鼠、猪、豚鼠等elisa试剂盒，但尚无商品化的whsag elisa试剂 盒，其检测方法及所需试剂只能自己摸索和制备，本发明专利对于whsagelisa试剂盒的制备具有重要应用价值。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供：
5.whsag单克隆抗体t9g10d4作为whsag elisa酶标抗体，whsag单 克隆抗体t1c3c9作为whsag elisa包被抗体，并确定两者在whsag elisa 应用时的最佳使用浓度。
6.为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
7.whsag单克隆抗体作为elisa检测试剂的应用。
8.一种方式，其中，保藏号为cctcc no：c2019319的whsag单克隆抗 体t9g10d4作为whsag elisa酶标抗体的应用。
9.一种方式，其中，whsag单克隆抗体t9g10d4作为whsag elisa酶 标抗体的应用方法为，
10.多克隆抗体
‑
抗whsab，稀释，包被elisa板子；
11.取出已包被elisa板子；
12.封闭孔板；
13.加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体t9g10d4，t9g10d4用稀释缓冲 液稀释，稀释比例分别为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000；
14.加入0.5
‰
过氧化氢和0.26
‰
四甲基联苯胺显色；
15.加入终止液，酶标仪od450nm读数。
16.一种方式，其中，t9g10d4用稀释缓冲液稀释，稀释比例分别为1:5000、 1:10000、1:20000、1:40000、1:80000中任一。
17.一种方式，其中，单克隆抗体t9g10d4可作为酶标抗体，最佳稀释比例 为1:20000。
18.一种方式，其中，多克隆抗体
‑
抗whsab采用7.2mg/ml，用包被缓冲液 稀释，稀释比例为1:720。
19.一种方式，保藏号为cctcc no：c2019318的whsag单克隆抗体 t1c3c9作为whsag elisa包被抗体的应用。
20.一种方式，whsag单克隆抗体t1c3c9作为whsag elisa包被抗体的 应用方法为，
21.加入单克隆抗体t1c3c9作为包被抗体，分别用包被缓冲液稀释，稀释 比例为1:1000、1:2000、1:4000、1:10000，包被elisa板子；
22.取出已包被elisa板子；
23.封闭孔板；
24.加入whsag阳性血清样本，血清样本用稀释缓冲液1:10稀释；
25.加入辣根过氧化物酶标记的已筛选单克隆抗体t9g10d4，用稀释缓冲液 1:20000稀释；
26.加入0.5
‰
过氧化氢和0.26
‰
四甲基联苯胺显色；
27.加入终止液，酶标仪od450nm读数。
28.一种方式，其中单克隆抗体t1c3c9可作为包被抗体，为提高检出率， 最佳稀释比例为1:2000和1:4000。
29.本发明的有益效果是：
30.whv可自然感染旱獭，且感染后的自然经过与hbv感染类似，因此旱 獭是研究hbv较为理想的动物模型，其中whsag检测是whv感染旱獭模 型的重要检测项目。目前尚无商品化的whsag elisa试剂盒，既往检测方法 中，所用试剂及其实验条件控制不稳定，背景显色很高，急需研究更稳定的 试剂和方法。本发明制备出适合whsag elisa检测的单克隆抗体，包括酶标 抗体和包被抗体，并确定两者在whsag elisa应用时的最佳使用浓度，这不 仅可以优化方法，缩短检测时间，而且可以显著提高阳性样本的od值，降 低阴性样本的od值，提升检测效果，这对于whsagelisa试剂盒的制备具 有重要应用价值。保藏号为cctcc no:c2019319，保藏时间2020年11月17日，保藏 单位中国典型培养物保藏中心，中国武汉，样品名称杂交瘤细胞株t9g10d4；保藏号为cctcc no:c2019318，保藏时间2020年11月17日，保藏 单位中国典型培养物保藏中心，中国武汉，样品名称杂交瘤细胞株t1c3c9；保藏号为cctcc no:c2019317，保藏时间2020年11月17日，保藏 单位中国典型培养物保藏中心，中国武汉，样品名称杂交瘤细胞株t3c10g1。
附图说明
31.图1为酶标抗体t9g10d4不同使用浓度结果示意图；
32.图2为酶标抗体t1c3c9不同使用浓度结果示意图；
33.图3为包被抗体t1c3c9不同使用浓度结果示意图；
34.图4为whsag elisa改进前后阳性和阴性对照对比示意图；
35.图5为whsag elisa改进前后方法示意图。
具体实施方式
36.whsag单克隆抗体作为elisa检测试剂的应用。
37.实施例1
38.a.选用已知的多克隆抗体
‑
抗whsab(7.2mg/ml)，用coating buffer 1:720 稀释，100μl/孔，包被elisa板子，4℃过夜；
39.b.第二天取出已包被elisa板子，washing buffer洗板4次，每次3分 钟；
40.c.blocking buffer封闭，300μl，37℃，1小时；
41.d.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
42.e.加入已知whsag阳性血清样本及阴性对照，血清样本用dilution buffer 1:10稀释，100μl，37℃，1小时；
43.f.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
44.g.分别加入hrp标记的单克隆抗体t9g10d4，原始浓度1mg/ml，和 t1c3c9(hrp标记方法来源：hrp conjugation kit， 701
‑
0030)，用dilution buffer稀释，稀释比例分别为1:5000、1:10000、1:20000、 1:40000、1:80000，50μl，37℃，45分钟；
45.h.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
46.i.加入solution a 50ul和solution b 50ul显色，37℃，15分钟；
47.j.加入终止液50μl，酶标仪以od450(检测波长450nm)读数。
48.实验结果：
49.t1c3c9不适合作为酶标抗体，t9g10d4可作为酶标抗体，其最佳使用 浓度为1:20000(如图1和图2所示)，因此t9g10d4可用于旱獭whv感 染模型whsag elisa的检测。
50.实施例2
51.a.加入单克隆抗体t1c3c9作为包被抗体，分别用coating buffer 1:1000、 1:2000、1:4000、1:10000稀释，100μl/孔，包被elisa板子，4℃过夜；
52.b.第二天取出已包被elisa板子，washing buffer洗板4次，每次3分 钟；
53.c.blocking buffer封闭，37℃，1小时；
54.d.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
55.e.加入已知whsag阳性血清样本及阴性对照，血清样本用dilution buffer 1:10稀释，每孔100μl，37℃，1小时；
56.f.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
57.g.加入hrp标记的单克隆抗体t9g10d4，原始浓度1mg/ml，(hrp标 记方法来源：hrp conjugation kit，701
‑
0030)，用dilution buffer稀释，稀释比例为1:20000，50μl，37℃，45分钟；
58.h.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
59.i.加入solution a 50ul和solution b 50ul显色，37℃，15分钟；
60.j.加入终止液50μl，酶标仪以od450(检测波长450nm)读数。
61.实验结果：
62.包被抗体t1c3c9的最佳使用浓度为1:2000(如图3所示)，可用于旱 獭whv感染模型whsag elisa的检测。
63.实施例3：
64.改进前whsag elisa具体方法：
65.a.选用已知的多克隆抗体，anti
‑
whsab(7.2mg/ml)，用coating buffer 1:720稀
释，100μl/孔，包被elisa板子，4℃过夜；
66.b.第二天取出已包被elisa板子，washing buffer洗板4次，每次3分 钟；
67.c.blocking buffer封闭，37℃，1小时；
68.d.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
69.e.加入待检测血清样本及阴性和阳性对照，血清样本用dillution buffer 1:10稀释，每孔100μl，37度，1小时；
70.f.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
71.g.加入biotin标记的anti
‑
whsab(7.2mg/ml)，用dillution buffer 1:300 稀释，37度，45分钟；
72.h.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
73.i.加入hrp
‑
avidin，用dilution buffer 1:200稀释，37℃，45分钟；
74.j.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
75.k.加入solution a 50ul和solutionb 50μl显色，室温，15分钟；
76.l.加入终止液50μl，酶标仪以od450读数。
77.改进后whsag elisa具体方法：
78.a.加入单克隆抗体t1c3c9作为包被抗体，分别用coating buffer 1:2000 稀释，100μl/孔，包被elisa板子，4℃过夜；
79.b.第二天取出已包被elisa板子，washing buffer洗板4次，每次3分 钟；
80.c.blocking buffer封闭，37℃，1小时；
81.d.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
82.e.加入已知whsag阳性血清样本及阴性对照，血清样本用dilution buffer 1:10稀释，每孔100μl，37℃，1小时；
83.f.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
84.g.加入hrp标记的单克隆抗体t9g10d4(hrp标记方法来源： hrp conjugation kit，701
‑
0030)，用dilution buffer稀释， 稀释比例为1:20000，50μl，37℃，45分钟；
85.h.washing buffer洗板4次，每次3分钟；
86.i.加入solution a 50ul和solution b 50μl显色，37℃，15分钟；
87.j.加入终止液50μl，酶标仪以od450(检测波长450nm)读数。
88.在改进前whsag elisa检测方法中，所采用的包被抗体和检测抗体为同 一种抗体，即anti
‑
whsab多克隆抗体，因此背景显色很高。和改进前的方法 对比可知，本发明采用t1c3c9作为包被抗体和t9g10d4作为酶标抗体，不 仅可以优化方法，缩短检测时间，而且可以显著提高阳性样本的od值，降 低阴性样本的od值，提升检测效果(如图4、5所示)。
89.本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情 形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之 内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。