乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法与流程

1.本发明属于乳制品中人乳寡糖的检测领域，涉及乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，具体涉及乳制品中乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖的定性定量检测方法。


背景技术：

2.人乳寡糖又称母乳低聚糖(hmos)，其被发现是一类存在于母乳中的独特低聚糖，母乳中未被消化的低聚糖部分刺激了结肠中双歧杆菌的生长，并且这些双歧杆菌对保护、预防肠道感染有益，因此，母乳低聚糖是先天免疫系统的主要成分。人乳寡糖含量的差别是导致母乳喂养较奶粉喂养更有优势的重要原因之一。其中，乳糖
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n
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四糖(lacto
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n
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tetraose，lnt)和乳糖
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n
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三糖(lacto
‑
n
‑
tetriaose ii，lntii)是母乳低聚糖(hmos)中的主要成分，具有多种生理功能，可以减少感染的发生，促进肠道有益菌群的增殖和活性，间接抑制有害菌群生长，维持肠道微生态平衡，从而保护婴儿肠道免受致病菌侵袭。
3.值得注意的是，在山羊奶、绵羊奶以及牛奶等乳制品中几乎没有发现这些人乳寡糖，并且，这些人乳寡糖不存在于人造奶中。目前市场上有些婴儿配方奶粉中添加的大都是低聚乳糖(galactooligosaccharides，gos)和低聚果糖(fructooligosaccharide，fos)，以此来模拟人乳寡糖的部分功能。然而，以上二者的作用远不及人乳寡糖对婴儿的健康生长的作用。所以，向人造奶或乳制品中添加具有生理功能的人乳寡糖，具有明显的社会和经济效益。
4.目前，人乳寡糖的检测方法耗时较长，操作复杂，如中国专利文献cn111239313a(申请号cn201811441066.9)公开了一种人乳寡糖的快速轮廓分析方法，该发明样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，经亲水作用色谱柱分离，以质谱为检测器，得到人乳寡糖组成、结构和含量信息。但是此方法存在着分析仪器昂贵、分析工序耗时不低于3小时、对操作人员要求高等问题。
5.如中国专利文献cn107192771a(申请号cn201710308499.6)公开了一种母乳低聚糖快速定性定量的方法，主要包括以下步骤：步骤1、样品前处理：取150
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250μl母乳，去除脂肪和蛋白质，得最终上清液，加超纯水稀释，得上样样品；步骤2、对标准品采用超高效液相色谱、质谱，建立标准曲线；步骤3、采用超高效液相色谱将所述上样样品内母乳低聚糖进行不同组分的分离，并利用质谱结合标准曲线，进行定量分析，即得母乳低聚糖含量。上述发明在94～106min范围内可检测12种母乳低聚糖，并对12种母乳低聚糖进行了定量。
6.如中国专利文献cn107621399a(申请号cn201610556457.x)公开了一种检测母乳中低聚糖的方法，包括对母乳样品进行前处理的步骤，所述前处理具体为：取母乳样品，离心除去上层脂肪，取下层液体并加入醇类溶剂，于﹣40℃～﹣100℃冷冻5
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15min后，离心，取上清液即得；采用液质法对前处理后的母乳中的低聚糖进行定性和定量检测。检测时间为70～145min。
7.现有技术中，对母乳及动物乳的前处理方法，脱除蛋白质的方法主要有两种，分别是乙醇沉淀法和乙腈沉淀法，脱除脂质的方法主要为离心沉淀法，上述前处理方法对于乳
制品中人乳寡糖的检测效果不佳，不能快速准确地对乳制品中的人乳寡糖进行定性定量分析，相对于乳制品中的天然寡糖，乳制品中另外添加的人乳寡糖含量较少，要尽量减少天然寡糖对于人乳寡糖检测的干扰，提高检测准确率。对于人乳及动物乳的后处理检测方法，多采用液质联用法，但是该检测方法存在分析仪器昂贵、分析耗时长、对操作人员要求高等问题。到目前为止还没有报道快速地对乳制品中人乳寡糖进行定性定量的检测方法。


技术实现要素：

8.发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供了一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，为乳制品的质量控制提供准确、快速的检测方法。
9.术语说明：室温：具有本技术领域公知的含义，一般是指25
±
2℃。
10.本发明的技术方案如下：
11.一种乳制品中人乳寡糖检测的预处理方法，首先通过加热法去除乳制品中的蛋白质，再利用有机溶剂提取法去除脂质，得乳制品供试液，具体如下：
12.步骤1.取乳制品样品，加入1
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10倍体积的超纯水混匀，加热至80
‑
100℃热处理10
‑
30min后，降至室温，然后在0
‑
10℃范围内，2000
‑
20000
×
g离心5
‑
50min，收集上清液，得到去除蛋白质的乳制品样品；
13.优选的，步骤1加入超纯水后，加热至85
‑
100℃热处理20
‑
30min；更优选加热至90
‑
100℃。
14.优选的，步骤1离心条件为0
‑
5℃范围内，5000
‑
15000
×
g离心5
‑
30min；更优选为4℃，10000
‑
15000
×
g离心10
‑
20min。
15.步骤2.取步骤1所得乳制品样品，加入等体积的有机溶剂，振荡或涡旋混匀，于0
‑
10℃范围内离心，2000
‑
20000
×
g离心5
‑
50min除去脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液。
16.优选的，步骤2所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈中的一种或多种。
17.优选的，步骤2所述离心条件为0
‑
5℃，5000
‑
15000
×
g离心5
‑
30min；更优选为4℃，10000
‑
15000
×
g离心10
‑
20min。
18.本发明所述人乳寡糖包括但不限于乳糖
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n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖。
19.一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，包括上述预处理方法，还包括如下步骤：
20.步骤3.用高效液相色谱法建立人乳寡糖标准曲线，并检测步骤2所得乳制品供试液，根据标准曲线对乳制品中人乳寡糖进行定性定量分析。
21.优选的，所述高效液相色谱法所用色谱柱为亲水性色谱柱或疏水性色谱柱。
22.进一步优选的，所述亲水性色谱柱填料为硅胶、极性基团键合相硅胶或葡聚糖；所述极性基团键合相硅胶中的极性基团为酰胺基、脲基、氰基、氨基、羧基、糖基和两性离子中的一种或多种。
23.进一步优选的，所述疏水性色谱柱填料为聚苯乙烯二乙烯苯树脂或聚甲基丙酸酯。
24.优选的，所述高效液相色谱法所用色谱柱为cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱。
25.优选的，所述高效液相色谱法采用的检测器为示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；优选紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长为180
‑
280nm。
26.优选的，所述高效液相色谱法的流动相为水和有机溶剂，其体积比为10/90～90/10，使用等度洗脱或梯度洗脱；所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙腈中的一种或多种。
27.进一步优选的，所述流动相为60
‑
75％(v/v)的乙腈水溶液。
28.优选的，所述高效液相色谱法的流速为0.2
‑
1ml/min，柱温为20
‑
60℃，进样体积为10μl，色谱柱内径为2.0
‑
6.0mm。
29.优选的，所述人乳寡糖标准曲线为乳糖
‑
n
‑
四糖、乳糖
‑
n
‑
三糖中的一种或两种寡糖的标准曲线。
30.一种乳制品中乳糖
‑
n
‑
四糖的定性定量检测方法，包括上述预处理方法，还包括如下步骤：
31.采用高效液相色谱法建立乳糖
‑
n
‑
四糖标准曲线，并检测步骤2所得乳制品供试液，根据标准曲线对乳制品中的乳糖
‑
n
‑
四糖进行定性定量分析。
32.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱。
33.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法采用的检测器为示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；进一步优选为紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长为180
‑
280nm。
34.本发明所述高效液相色谱法的流动相为60
‑
75％(v/v)的乙腈水溶液，使用等度洗脱或梯度洗脱。
35.本发明技术方案中，如果流动相乙腈水溶液浓度低于60％(v/v)或高于75％(v/v)，都会导致色谱峰干扰问题，不能正常检测乳制品中的人乳寡糖含量。
36.本发明所述高效液相色谱法的流动相的流速为0.2
‑
1ml/min，优选0.5ml/min，柱温为20
‑
60℃，进样体积为10μl，色谱柱内径为2.0
‑
6.0mm。
37.一种乳制品中乳糖
‑
n
‑
三糖的定性定量检测方法，包括上述预处理方法，还包括如下步骤：
38.采用高效液相色谱法建立乳糖
‑
n
‑
三糖标准曲线，并检测步骤2所得乳制品供试液，根据标准曲线对乳制品中的乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析。
39.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱。
40.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法采用的检测器为示差折光检测器、紫外检测器或二极管阵列检测器；进一步优选为紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长为180
‑
280nm。
41.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法的流动相为60
‑
75％(v/v)的乙腈水溶液，使用等度洗脱或梯度洗脱。
42.根据本发明优选的，所述高效液相色谱法的流速为0.2
‑
1ml/min，优选0.5ml/min，柱温为20
‑
60℃，进样体积为10μl，色谱柱内径为2.0
‑
6.0mm。
43.有益效果：
44.人乳寡糖的种类超过200多种，结构复杂，不同种类人乳寡糖之间的检测方法差异较大，而且本发明针对乳制品中添加的人乳寡糖进行定性定量检测，乳制品中的天然寡糖对人乳寡糖的检测也存在较大干扰。因此相对于常用的离心除脂质和乙醇/乙腈沉淀除蛋白的预处理方法，本发明采用了加热法除蛋白和有机溶剂除脂质的预处理方法，将乳制品样品进行预处理，去除了乳制品样品中的蛋白质和脂质，大大减少了干扰峰的存在，一定程度保证了检测结果的准确度和可靠性，并通过高效液相色谱利用标准品建立标准曲线，以同样的方式检测所述乳制品样品中人乳寡糖的含量，并结合所述标准曲线得乳制品样品中人乳寡糖的含量。
45.本发明的定性定量检测方法采用高效液相色谱对预处理液进行分离分析，所述高效液相色谱采用cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，更有利于人乳寡糖的分离与检测，所述高效液相色谱系统检测速度快、灵敏度高，最快在1h即可得到检测结果，大大缩短了分析时间，使检测更加快速准确，相较于液质联用，大大降低了检测成本与检测难度。再利用标准曲线，结合乳制品样品检测结果，可实现对乳制品样品中人乳寡糖，尤其是乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖的快速定性定量检测。
46.本发明提供了一种乳制品中人乳寡糖的定性定量检测方法，该方法能够准确、快速的检测乳制品中的人乳寡糖。，尤其是对乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖检测方法的提供，对乳制品的质量控制有着积极的意义，有利于人乳寡糖在乳制品行业中进行迅速的推广与运用。
附图说明
47.图1为乳制品中人乳寡糖的定性定量检测分析流程示意图。
48.图2为实施例1中酸奶样品(四糖)的hplc色谱图。
49.图3为实施例2中牛奶样品(三糖)的hplc色谱图。
50.图4为对比例1中酸奶样品的hplc色谱图。
51.图5为对比例2中酸奶样品的hplc色谱图。
52.图6为对比例3中酸奶样品的hplc色谱图。
53.图7为对比例4中酸奶样品的hplc色谱图。
具体实施方式
54.下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的样品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
55.(1)标准品来源：
56.乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖标准品购买自上海甄准生物科技有限公司；其他市购标准品也可用于本发明。
57.(2)样品来源
58.实施例中使用的酸奶、牛奶、奶粉均为普通市售且不含人乳寡糖的乳制品商品。
59.(3)标准品梯度溶液制备：
60.取乳糖
‑
n
‑
四糖标准品0.1mg，溶于100μl的超纯水中，混匀后得1mg/ml的初级标准品溶液，放置
‑
20℃下储藏备用；取初级标准品溶液10μl，加入90μl超纯水，得浓度为100mg/
l标准品溶液，分别逐级稀释成不同的浓度，得到乳糖
‑
n
‑
四糖的标准品梯度溶液；
61.取乳糖
‑
n
‑
三糖标准品0.1mg，溶于100μl的超纯水中，混匀后得1mg/ml的初级标准品溶液，放置
‑
20℃下储藏备用；取初级标准品溶液10μl，加入90μl超纯水，得浓度为100mg/l标准品溶液，分别逐级稀释成不同的浓度，得到乳糖
‑
n
‑
三糖的标准品梯度溶液。
62.(4)上述标准品溶液经高效液相色谱分析后，建立的标准曲线如下：
63.乳糖
‑
n
‑
四糖：二极管阵列检测器线性方程y＝4693150.00x
‑
113708.75，r2＝0.99，流动相65％(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第14.907min；
64.紫外检测器线性方程y＝9676605.8571x
‑
94905.4286，r2＝0.99，流动相65％(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第14.623min。
65.乳糖
‑
n
‑
三糖：二极管阵列检测器线性方程y＝8868477x
‑
250735，r2＝0.96，流动相75％(v/v)乙腈水溶液，柱温30℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第13.327min；
66.二极管阵列检测器线性方程y＝37898702x
‑
6499662.9，r2＝0.98，流动相65％(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第12.240min；
67.紫外检测器线性方程y＝37898702x
‑
6499662.9，r2＝0.98，流动相65％(v/v)乙腈水溶液，柱温25℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第12.573min；
68.示差折光检测器线性方程y＝137467x 200，r2＝1，流动相60％(v/v)乙腈水溶液，柱温30℃，线性范围0.2
‑
1mg/ml，出峰时间为第14.477min。
69.标准品溶液的高效液相色谱条件为：采用4.6
×
250mm，5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以60％,65％或75％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为25℃或30℃，进样体积为10μl，二极管阵列检测器，或紫外检测器，或示差折光检测器，检测波长195nm。
70.本发明实施例中所用乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液的浓度为0.6mg/ml；乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液的浓度为0.6mg/ml。分别取乳糖
‑
n
‑
三糖和乳糖
‑
n
‑
四糖标准品6mg，溶于10ml的超纯水中，混匀后得两种标准品溶液。
71.实施例1
72.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，流程示意图如图1所示，步骤如下：
73.(1)预处理：取1ml酸奶样品(酸奶样品中不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入1ml乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于100℃水浴中处理20min后，降至室温，4℃条件下12000
×
g离心10min，收集上清液，得到去除蛋白质的酸奶样品；然后在上述去除蛋白质的酸奶样品中加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下12000
×
g离心10min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
74.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖
‑
n
‑
四糖进行定性定量分析；
75.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm，5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以65％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为25℃，进样体积为10μl，二极管阵列检测器，检测波长195nm。
76.酸奶样品的高效液相色谱图如图2所示，结合标准曲线，计算得到所述酸奶样品中
乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.576mg。
77.实施例2
78.牛奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
79.(1)预处理：取1ml牛奶样品(牛奶样品中不含人乳寡糖)，向牛奶样品中加1ml乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于90℃水浴中处理30min后，降至室温，4℃条件下10000
×
g离心20min，收集上清液，得到去除蛋白质的牛奶样品；然后在上述去除蛋白质的牛奶样品中加入等体积的乙腈，振荡混匀，于4℃条件下15000
×
g离心10min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
80.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对牛奶样品中的乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析；
81.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm、5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以65％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为25℃，进样体积为10μl，二极管阵列检测器，检测波长195nm。
82.牛奶样品的高效液相色谱图如图3所示，结合标准曲线，计算得到所述牛奶样品中乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.564mg。
83.实施例3：
84.奶粉样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
85.(1)预处理：取1ml奶粉样品(奶粉样品中不含人乳寡糖)，向奶粉样品中加1ml乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于90℃水浴中处理30min后，降至室温，4℃条件下10000
×
g离心10min，收集上清液，得到去除蛋白质的奶粉样品；然后在上述去除蛋白质的奶粉样品中加入等体积的乙腈，振荡混匀，于4℃条件下15000
×
g离心10min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
86.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对奶粉样品中的乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析；
87.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm、5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以75％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为10μl，二极管阵列检测器，检测波长195nm。
88.结合本奶粉样品高效液相图谱和标准曲线，计算得到所述奶粉样品中乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.543mg。
89.实施例4：
90.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
91.(1)预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于100℃水浴中处理30min后，降至室温，4℃条件下15000
×
g离心50min，收集上清液，得到去除蛋白质的酸奶样品；然后在上述去除蛋白质的酸奶样品中加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下15000
×
g离心50min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
92.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖
‑
n
‑
四糖、乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析；
93.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm、5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以65％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为25℃，进样体积为10μl，二极管阵列检测器，检测波长195nm。
94.结合酸奶样品的高效液相色谱图和标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.113mg，乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.110mg。
95.实施例5：
96.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
97.(1)预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于80℃水浴中处理10min后，降至室温，4℃条件下5000
×
g离心5min，收集上清液，得到去除蛋白质的酸奶样品；然后在上述去除蛋白质的酸奶样品中加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下5000
×
g离心5min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
98.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖
‑
n
‑
四糖、乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析；
99.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm、5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以65％(v/v)的乙腈水溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为25℃，进样体积为10μl，紫外检测器，检测波长195nm。
100.结合酸奶样品的高效液相色谱图和标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.126mg，乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.115mg。
101.实施例6：
102.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，步骤如下：
103.(1)预处理：取1ml酸奶样品(奶粉样品中不含人乳寡糖)，向奶粉样品中加1ml乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于100℃水浴中处理20min后，降至室温，4℃条件下12000
×
g离心10min，收集上清液，得到去除蛋白质的酸奶样品；然后在上述去除蛋白质的酸奶样品中加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下12000
×
g离心10min去除脂质，收集上清液，得到去除蛋白质和脂质的乳制品供试液；
104.(2)hplc检测：将步骤(1)得到的乳制品供试液稀释后，经0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱法进行样品检测，根据标准曲线对酸奶样品中的乳糖
‑
n
‑
三糖进行定性定量分析；
105.其中，高效液相色谱法的条件为：采用4.6
×
250mm、5μm的cosmosil sugar
‑
d氨基色谱柱，以60％乙腈溶液为流动相等度洗脱；流速为0.5ml/min，柱温为30℃，进样体积为10μl，示差折光检测器，检测波长195nm。
106.对照乳糖
‑
n
‑
三糖标准品酸奶样品的高效液相色谱图，在14.477min的出峰为乳糖
‑
n
‑
三糖。根据其线性方程计算得出酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.576mg。这说明当
进行hplc检测时，使用示差折光检测器也能比较灵敏地检测出乳糖
‑
n
‑
三糖。
107.对比例1：采用专利cn2017201710308499.6的方法对样品进行预处理
108.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法采用离心除脂质和乙腈沉淀除蛋白的处理方式，步骤如下：
109.预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品中不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，5000r/min，2℃离心8min后，去除上层脂肪，然后加入400μl的纯乙腈，涡旋混匀后超声8min，8000r/min，2℃离心12min后取上清，再将上清液离心，以8000r/min的速度在2℃下，将所述上清液离心12min后，取最终上清液，得到去除蛋白质和脂质的预处理上清液；
110.hplc检测均按照实施例4所述的方法进行。
111.酸奶样品的高效液相色谱图如图4所示，结合标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.057mg，乳糖
‑
n
‑
三糖没有出峰，未被检测出。
112.对比例2：采用专利cn201610556457.x的方法对样品进行预处理
113.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法采用离心除脂质和乙醇沉淀除蛋白的处理方式，步骤如下：
114.预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，经2000g、20min、2℃离心除去上层脂肪，取下层样液加入两倍体积66.7％乙醇，
‑
80℃冷冻10min，取出后离心，离心条件为10000r/min、10min，离心后取上层清液，得到去除蛋白质和脂质的预处理上清液；
115.hplc检测均按照实施例4所述的方法进行。
116.酸奶样品的高效液相色谱图如图5所示，结合标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.050mg，乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.052mg。
117.对比例3：
118.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法仅采用有机溶剂处理，步骤如下：
119.预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品中不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
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四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，于4℃条件下5000
×
g离心5min，收集上清液，得到预处理上清液；
120.hplc检测均按照实施例5所述的方法进行。
121.酸奶样品的高效液相色谱图如图6所示，结合标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
‑
n
‑
四糖的含量为0.076mg，乳糖
‑
n
‑
三糖的含量为0.057mg。
122.对比例4：
123.酸奶样品中人乳寡糖的定性定量检测，其中预处理方法仅采用加热处理，步骤如下：
124.预处理：取200μl酸奶样品(酸奶样品中不含人乳寡糖)，向酸奶样品中加入200μl乳糖
‑
n
‑
四糖标准品溶液、200μl乳糖
‑
n
‑
三糖标准品溶液，加入等体积的超纯水混匀，于80℃水浴中处理10min后，降至室温，4℃条件下5000
×
g离心5min，收集上清液，得到预处理上
清液；
125.hplc检测均按照实施例5所述的方法进行。
126.酸奶样品的高效液相色谱图如图7所示，结合标准曲线，计算得到所述酸奶样品中乳糖
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n
‑
四糖的含量为0.080mg，乳糖
‑
n
‑
三糖含量为0.064mg。
127.结果分析：
128.上述实施例1～6和对比例1～4的乳糖
‑
n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖检测分析结果如表1所示。
129.表1.本发明实施例1～4和对比例1～4的检测分析结果
[0130] 乳糖
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n
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四糖乳糖
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n
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四糖回收率乳糖
‑
n
‑
三糖乳糖
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n
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三糖回收率实施例10.576mg96.00％————实施例2————0.564mg94.00％实施例3————0.543mg90.50％实施例40.113mg94.17％0.110mg91.67％实施例50.126mg105％0.115mg95.83％实施例6————0.576mg96.00％对比例10.057mg47.50％nd——对比例20.050mg41.67％0.052mg43.33％对比例30.076mg63.33％0.057mg47.50％对比例40.080mg66.67％0.064mg53.33％
[0131]
注：nd表示未检测到。
[0132]
由以上数据可知，按照本发明的定性定量检测方法，可以检测乳制品中的乳糖
‑
n
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四糖或乳糖
‑
n
‑
三糖，或者同时检测乳制品中乳糖
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n
‑
四糖和乳糖
‑
n
‑
三糖，检测过程快速、准确。
[0133]
通过比较实施例2和实施例3的检测分析结果可知，不同的乳制品样品，其人乳寡糖的回收率也会有所差异，实施例2中牛奶的乳糖
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n
‑
三糖的回收率略高于实施例3中奶粉的乳糖
‑
n
‑
三糖回收率，可能是因为不同乳制品中含有的干扰性物质不同，干扰性物质会对其人乳寡糖的检出率产生影响。
[0134]
通过比较实施例4
‑
5的检测分析结果可知，采用本发明的检测方法，可以同时定性定量检测乳制品中的乳糖
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n
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四糖和乳糖
‑
n
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三糖，且乳糖
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n
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四糖和乳糖
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n
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三糖的回收率均可达到90％以上。与现有的预处理方法相比(对比例1和对比例2)，本发明技术方案的检测准确度更高。相对于单独使用加热法或有机溶剂法(对比例3和对比例4)，本发明意外发现采用加热法和有机溶剂相结合的预处理方法对于乳糖
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n
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三糖和乳糖
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n
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四糖检测效果更佳。
[0135]
对比例1和对比例2分别采用专利cn2017201710308499.6和cn201610556457.x的方法对酸奶样品中人乳寡糖进行定性定量检测，可能由于本发明中采用的是酸奶制品，相较于其发明专利中的母乳而言，蛋白质、脂质等的含量更多，只通过简单的离心预处理除杂，会导致干扰过多，影响检测效果。
[0136]
综上，由上述检测分析结果可知，本发明的检测方法对于乳制品中乳糖
‑
n
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四糖和/或乳糖
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n
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三糖的定性定量检测检测具有结果准确、灵敏度高的特点，相较于液质联用
法，大大降低了检测成本与检测难度，可实现对乳制品样品中人乳寡糖，尤其是乳糖
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n
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四糖和乳糖
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n
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三糖的快速定性定量检测。