包含茶黄素的用于促进脂肪细胞分化的组合物的制作方法

包含茶黄素的用于促进脂肪细胞分化的组合物
1.对相关申请的交叉参考
2.本技术要求2019年4月25日申请的韩国专利申请案第10
‑
2019
‑
0048189号及2020年3月10日申请的韩国专利申请第10
‑
2020
‑
0029539号的优先权，该申请的全部内容通过引用而包含在本技术中。
技术领域
3.本说明书涉及一种包含茶黄素的用于促进脂肪细胞分化的组合物。


背景技术：

4.皮下脂肪是支撑皮肤的结构的主要皮肤器官之一，不同于内脏脂肪，已知皮下脂肪随着衰老而逐渐失去其功效，丧失作为结构体的功能。因此，为了抑制以及完善脸部的皮肤凹陷现象，想要通过多种方法来实现抗老化，然而作为通过皮下脂肪来实现抗老化的方法，除了靠美学接近的美容方法之外，目前为止尚不存在可以促进皮肤脂肪的脂肪分化的明确方法。


技术实现要素：

5.技术问题
6.在一观点上，本发明所要解决的问题为，提供一种在将茶黄素处理到源自人体的皮下脂肪时能够特异性地积累皮下脂肪的效果，其中，所述茶黄素是各种源自绿茶的多酚中的一者，因为其容易转化成其它物质，所以其功能为不确定的。
7.技术方案
8.在一方面，本发明提供一种用于促进脂肪细胞分化的组合物，所述组合物包含茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物作为有效成分。
9.发明效果
10.在一观点上，本发明促进脂肪细胞分化，从而提供改善皮肤弹性、改善皱纹、增加皮肤体积、改善皮肤再生、改善皮下脂肪的减少的效果。
附图说明
11.图1是各个提取物的hplc成分分析结果：(a)标准化学物质(1；茶黄素(theaflavin；tf)，2；茶黄素
‑3‑
没食子酸酯(theaflavin
‑3‑
gallate；tf3g)，3；茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3
’‑
digallate；tf3’g)，以及4；茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3
’‑
digallate；tfdg))、(b)未发酵绿茶提取物(unfermented green tea extract；gt)、(c)茶黄素浓缩生物发酵提取物(conc entrated and biofermented theaflavin extract；cof
‑
gt)、(d)绿茶发酵提取物(fermented green tea extract；f
‑
gt)；
12.图2是示出茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)、绿茶发酵提取物(f
‑
gt)、茶黄素
(tf)、茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)的细胞增殖功效分析结果；
13.图3是示出茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)、绿茶发酵提取物(f
‑
gt)、茶黄素(tf)、茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)的细胞存活性(72小时)功效分析结果；
14.图4是确认茶黄素(tf)及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)的皮下脂肪分化促进效果的图；
15.图5是确认茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)及绿茶发酵提取物(f
‑
gt)的皮下脂肪分化促进效果的图；
16.图6是示出各自处理茶黄素(tf)、茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)、茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)及绿茶发酵提取物(f
‑
gt)之后，测定皮下脂肪的脂肪生成量的结果的图；
17.图7是示出各自处理茶黄素(tf)、茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)、茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)及绿茶发酵提取物(f
‑
gt)之后，基因表达分析结果的图；
18.图8是示出各自处理茶黄素(tf)、茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(tfdg)、茶黄素浓缩生物发酵提取物(cof
‑
gt)及绿茶发酵提取物(f
‑
gt)之后，脂联素(adiponectin)生成量测定结果的图；
19.图9是示出各个浓度的茶黄素(tf)的细胞增殖功效(24小时)及细胞存活力(72小时)功效分析结果的图；
20.图10是示出各个浓度的茶黄素(tf)的脂肪细胞分化促进功效分析结果的图。
具体实施方式
21.以下，参考附图更加详细说明本技术的实施例。然而，本技术中公开的技术可体现成各种其它形式而不限于在此说明的实施例。提供一实施例以使得本发明变彻底且完整，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。在图中，为了明确表述各个构成要素，构成要素的尺寸诸如宽度、厚度等加以夸示。另外，在一些情况下，为了便于说明，仅展示构成要素的一部分，只要是本领域技术人员将容易地了解构成要素的其余部分。另外，本领域中具有通常知识的人能够将本发明的技术理念体现成各种其它形式而不脱离本发明的技术理念。
22.在一实施例中，本发明可提供包含茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物作为有效成分的组合物。
23.在本说明书中，「异构体」不仅包括光学异构体，例如，基本上纯的对映异构体、基本上纯的非对映异构体或其混合物，而且包括构象异构体，亦即，一个以上的化学键仅其角度不同的异构体、位置异构体、尤其互变异构体、或几何异构体(例如，顺
‑
反异构体)。
24.在本说明书中，“基本上纯的(essentially pure)”是指，例如针对对映异构体或者非对映异构体进行使用时，可以举出的对映异构体或者非对映异构体的具体的化合物存在约90％以上，优选为约95％以上，更加优选为约97％以上或者约98％以上，进一步优选为约99％以上，更加进一步优选为约99.5％以上(w/w)。
25.在本说明书中，“药学上可接受”是指按照通常的药物剂量(medicinal dosage)使用时，避免相当的毒性效果，从而能够得到政府可用于动物，更加具体为可用于人类的认可或者遵守其的管理机构的认可或者得到认可，或者是药典上举例或者其他一般药典上记载
的内容。
26.在本说明书中，“药学上可接受的盐”是指药学上可接受且具有母体化合物(parent compound)的优选药理活性的根据本发明的一方面的盐。所述盐可以包括(1)由诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成；或者由诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3
‑
(4
‑
羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2
‑
乙烷二磺酸、2
‑
羟乙基磺酸、苯磺酸、4
‑
氯苯磺酸、2
‑
萘磺酸、4
‑
甲苯磺酸、樟脑磺酸、4
‑
甲基二环[2,2,2]
‑
辛
‑2‑
烯
‑1‑
羧酸、葡庚糖酸、3
‑
苯丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、已二烯二酸的有机酸形成的酸附加盐(acid addition salt)；或者(2)母体化合物中存在的酸性质子被取代时形成的盐。
[0027]
在本说明书中，“水合物(hydrate)”是指结合有水的化合物，是在水和化合物之间没有化学结合力的包合物在内的广义的概念。
[0028]
在本说明书中，“溶剂化物”是指在溶质的分子或者离子和溶剂的分子或者离子之间产生的高价化合物。
[0029]
在另一实施例中，可提供所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物用于制备供促进脂肪细胞分化的组合物的用途。在另一实施例中，可提供促进脂肪细胞分化的方法，包括将有效量的所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物向需要的对象给药的步骤。在另一实施例中，可提供所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物作为用于供促进脂肪细胞分化的组合物中的有效成分。在另一实施例中，可提供茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物用于促进脂肪细胞分化的用途。在另一实施例中，可提供所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物作为用于促进脂肪细胞分化的有效成分的非治疗性用途。
[0030]
本发明通过包含所述茶黄素(theaflavin)、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物作为有效成分，从而处理到源自人体的例如脸部的皮下脂肪细胞时，可以展现以下效果。具体为，茶黄素为水溶性，易溶于水且可容易地与其它成分混合，并且不论浓度，在处理到源自人体的皮下脂肪细胞时，不展现细胞增殖以及毒性的变化。其它茶黄素类展现以往作为抗肥胖功效周知的抑制脂肪分化功效，但是作为本发明的有效成分的茶黄素以浓度依赖方式促进皮下脂肪分化。在一实施例中，所述组合物可通过促进脂肪细胞分化来增加皮肤体积。在一实施例中，所述组合物可通过促进脂肪细胞分化来抑制皮下脂肪的减少。
[0031]
在一实施例中，包含在所述组合物中的茶黄素(theaflavin)、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的含量可相对于组合物的总重量为例如0.01～100重量％，具体为0.01～50重量％，但是不限于此。更加具体地，茶黄素(theaflavin)、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物可相对于组合物的总重量，含有0.01重量％以上、、0.1重量％以上、1重量％以上、5重量％以上、10重量％以上、15重量％以上、20重量％以上、25重量％以上、30重量％以上、35重量％以上、40重量％以上、45重量％以上、50重量％以上、55重量％以上、60重量％以上、65重量％以上、70重量％以上、75重量％以上、80重量％以上、85重量％以上、90重量％以上、或95重量％以上。更加具体地，茶黄素
(theaflavin)、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物可相对于组合物的总重量，含有100重量％以下、95重量％以下、90重量％以下、85重量％以下、80重量％以下、75重量％以下、70重量％以下、65重量％以下、60重量％以下、55重量％以下、50重量％以下、45重量％以下、40重量％以下、35重量％以下、30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、15重量％以下、10重量％以下、5重量％以下、1重量％以下、或0.1重量％以下。
[0032]
在一实施例中，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物在组合物内的浓度可为0.01～10,000mg/kg，并且可取决于组合物的给药途径而变化。在一实施例中，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的给药量可为0.01～10,000mg/kg/日，并且可取决于组合物的给药途径而变化。更加具体地，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的每日给药量可为0.01mg/kg以上、0.1mg/kg以上、0.5mg/kg以上、1mg/kg以上、2mg/kg以上、3mg/kg以上、4mg/kg以上、5mg/kg以上、10mg/kg以上、15mg/kg以上、20mg/kg以上、25mg/kg以上、30mg/kg以上、35mg/kg以上、40mg/kg以上、45mg/kg以上、50mg/kg以上、55mg/kg以上、60mg/kg以上、65mg/kg以上、70mg/kg以上、75mg/kg以上、80mg/kg以上、85mg/kg以上、90mg/kg以上、95mg/kg以上、100mg/kg以上、200mg/kg以上、300mg/kg以上、400mg/kg以上、500mg/kg以上、600mg/kg以上、700mg/kg以上、800mg/kg以上、900mg/kg以上、1,000mg/kg以上、2,000mg/kg以上、3,000mg/kg以上、4,000mg/kg以上、5,000mg/kg以上、6,000mg/kg以上、7,000mg/kg以上、8,000mg/kg以上、9,000mg/kg以上。更加具体地，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的浓度可为10,000mg/kg以下、9,000mg/kg以下、8,000mg/kg以下、7,000mg/kg以下、6,000mg/kg以下、5,000mg/kg以下、4,000mg/kg以下、3,000mg/kg以下、2,000mg/kg以下、1,000mg/kg以下、900mg/kg以下、800mg/kg以下、700mg/kg以下、600mg/kg以下、500mg/kg以下、400mg/kg以下、300mg/kg以下、200mg/kg以下、100mg/kg以下、95mg/kg以下、90mg/kg以下、85mg/kg以下、80mg/kg以下、75mg/kg以下、70mg/kg以下、65mg/kg以下、60mg/kg以下、55mg/kg以下、50mg/kg以下、45mg/kg以下、40mg/kg以下、35mg/kg以下、30mg/kg以下、25mg/kg以下、20mg/kg以下、15mg/kg以下、10mg/kg以下、5mg/kg以下、1mg/kg以下、0.5mg/kg以下、或0.1mg/kg以下。
[0033]
具体为，口服给药时，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的浓度或每日给药量可为0.01～1,000mg/kg，但是不限于此。涂敷在皮肤上时，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的浓度或每日给药量可为0.01～3,000mg/kg，但是不限于此。直接皮下给药时，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的浓度或每日给药量可为0.01～100mg/kg，但是不限于此。
[0034]
在一实施例中，茶黄素可包含于发酵绿茶提取物中。亦即，所述组合物可包含含有茶黄素的发酵绿茶提取物。
[0035]
茶是加工属于山茶科(theaceae)、山茶属(camellia)的茶树(camellia sinensiso，kuntze)的芽或叶子，茶叶包含75～80％水及20～25％固体份。固体份包括诸如儿茶素、咖啡因、氨基酸、纤维素、果胶等的有机物质、脂质、树脂类、精油、维生素、叶绿素等各种成分。茶通常根据发酵程度来分类成三个群组：具有0％的发酵度的非发酵茶(绿茶)，具有20～60％的发酵度的半发酵茶(白茶、花茶、蒲种茶及乌龙茶)；及具有80％以上的发酵
度的发酵茶(红茶)。传统发酵茶被称为酶发酵茶，因为其通过包含在茶叶中的酶来发酵，作为酶发酵茶的红茶类通过以下方法来制备：在收获叶子后，通过枯萎过程来使茶叶软化，诱导香气生成中所需的生物化学反应，经由轧制过程来促进氧化酶与多酚的反应，经由发酵过程来促进儿茶素类的氧化聚合而生成茶黄素类，经由褐变来提供香气及风味。在酶发酵茶的发酵期间，通过氧化酶使诸如表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等儿茶素类的氧化聚合，从而生成红黄色的茶黄素(theaflavins)，主要报告有茶黄素、茶黄素
‑3‑
没食子酸酯、茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯等四种。此等茶黄素类已知具有抗氧化及抗诱变等效果，通过氧化酶的作用而生成氧化聚合物，由此茶的红色增加并且存在香气和味道的差异，在生成物的体内生理活性中也存在差异。
[0036]
在本说明书中，“发酵绿茶”是指已发酵的绿茶，包括所有的发酵程度的差异。
[0037]
根据本发明的一实施例的所述发酵绿茶提取物包含茶黄素类，该茶黄素类包括茶黄素、茶黄素
‑3‑
没食子酸酯、茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯，此时，相对于所述茶黄素类的总重量，可包含30～50重量％的茶黄素作为本发明的有效成分。
[0038]
在一实施例中，所述发酵绿茶提取物可为通过包括以下步骤的方法来制备的提取物：(a)混合绿茶及茼蒿来制备混合物的步骤；(b)在减压状态下将混合物发酵并且干燥的步骤；及(c)提取发酵及干燥的混合物的步骤。
[0039]
作为制备本发明的发酵绿茶的方法的一实施例中，所述步骤(a)为混合绿茶及茼蒿来制备混合物的步骤。
[0040]
在本发明中，绿茶可包括选自由绿茶叶、绿茶茎及绿茶根组成的群组的一种以上，例如，可包括绿茶叶。另外，生长绿茶可用作所述绿茶以便促进酶反应。
[0041]
在本发明的一实施例中，所述茼蒿可作为促进绿茶的发酵的发酵添加组合物来使用。由于所述茼蒿包含多酚氧化酶及过氧化物酶，因此可促进绿茶的发酵。在本发明的一实施例中，所述茼蒿可以使用粉末型的茼蒿磨碎物或汁液形态。所述粉末型可没有特定限制地通过在此项技术中已知的方法来获得。其可在研磨机(grinder)上以1～500μm程度的细微粉末再次粉碎在破碎机(crusher)上第1次粉碎的粉末来制备，或者，在没有第1次粉碎的情况下，细微粉末可使用球磨机(ball mill)或者锤磨机(hammer mill)等来制备。所述汁液可没有特定限制地通过在此项技术中已知的方法来获得。
[0042]
在一实施例中，所述绿茶及茼蒿可以以1:1～99:1的重量比、具体为以20:1～5:1的重量比、更加具体地以10:1的重量比来混合。含有所述茼蒿的量大于绿茶的重量，则虽然可在较短时间内达成绿茶的发酵，但是由于氧化速度变快而可以减少茶黄素类，并且若绿茶及茼蒿的重量比超过99:1，则由于包含在绿茶中的酶而导致茶黄素类中茶黄素的含量不增加。
[0043]
作为一实施例，混合所述绿茶及茼蒿来获得的混合物可进一步包含蒸馏水、离子水、自来水、含有矿物质的地下水以及不足30％的醇作为溶剂。在一实施例中，相对于绿茶的100重量份，所述溶剂可以以50～200重量份，具体为80～150重量份的量包含在内。
[0044]
在一实施例中，所述步骤(b)为在减压状态下将在步骤(a)中制备的混合物发酵并且干燥的步骤。在本说明书中，“发酵”是指由于在绿茶中天然存在的氧化酶的作用而发生的过程。所述减压状态可为与氧气的接触得以阻断的状态，在一实施例中，发酵及干燥可在10～50mmhg的减压状态下进行。具体为，在所述减压状态下的发酵可在20～50℃下进行1～
10小时，更加具体地2～5小时。若所述发酵温度低于20℃，则发酵时间可变长，若发酵温度超过50℃，则可由于酶的失活速度变快而进行不完全的发酵。另外，在所述步骤(b)中，干燥经发酵的混合物，所述干燥可以为冷冻干燥。所述冷冻干燥可没有特定限制地通过在此项技术中已知的方法来进行。
[0045]
在一实施例中，所述步骤(c)为提取在步骤(b)中发酵并且干燥的混合物的步骤。所述提取使用提取溶剂来执行，并且提取溶剂可包括选自由水及c1～c5醇组成的群的一种以上，具体为选自由水及乙醇组成的群组的一种以上。提取温度及提取时间不受特别限制，例如，提取温度可为室温至80℃，并且提取时间为1～24小时。在所述步骤(c)中，发酵及干燥混合物可通过各种方法来提取，例如，可以为利用热水提取物或c1～c5低级醇提取物的方法。
[0046]
例如，作为第一实现例，所述发酵及干燥的混合物首先通过添加10～30倍数程度的水，在100℃下第1次提取4小时，并且通过相同方法第2次提取4小时之后，混合第1次以及第2次提取液进行过滤，然后使用浓缩器浓缩过滤液。使用喷雾干燥机或真空冷冻干燥机来干燥所述浓缩的提取液。作为第二实现例，70％乙醇提取物的制备方法为，添加发酵及干燥混合物重量的10～30倍数程度的70％乙醇，在50～80℃下提取30分钟至3小时之后进行过滤，利用浓缩器浓缩过滤液。使用喷雾干燥机或真空冷冻干燥机来干燥所述浓缩的提取液。作为第三实现例，95％乙醇提取物的制备方法为，添加发酵及干燥混合物重量的10～30倍数程度的95％乙醇，在室温下提取1～3天并且每隔6小时反复进行振荡(shaking)操作而进行提取之后，通过相同的方法重复两次，得到提取液。混合所述第1次以及第2次提取液并且过滤之后，用浓缩器来浓缩过滤液。使用喷雾干燥机或真空冷冻干燥机来干燥所述浓缩的提取液。
[0047]
通常，发酵绿茶提取物随着发酵而通过氧化酶产生诸如表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等儿茶素类的氧化聚合反应，从而生成红黄色茶黄素类，所述茶黄素类包含茶黄素、茶黄素
‑3‑
没食子酸酯、茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯及茶黄素
‑
3,3
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二没食子酸酯。
[0048]
根据所述一实施例的本发明的发酵绿茶包含与其它茶黄素类相比具有更高含量的茶黄素并且展现通过促进源自人体的皮下脂肪细胞的分化来诱导脂肪细胞的产生的效果。具体为，相对于茶黄素类的总重量，所述发酵绿茶提取物可包含30～50重量％的茶黄素。
[0049]
作为一实施例，包含在根据本发明的组合物中的所述发酵绿茶提取物的含量不受特别限制，作为一例，相对于组合物的总重量，可以以0.01～99.9重量％，具体为0.1～50重量％的含量包含在内。在上述范围内，可适当地达成本发明所需的效果，同时满足组合物的稳定性及安全性全部，而且该范围在成本有效性方面可为合乎需要的。
[0050]
在一实施例中，所述根据本发明的组合物可为化妆料组合物。所述化妆料组合物可含有化妆品学或皮肤科学上可接受的介质或基剂而成为剂型化。其作为适合局部使用的所有剂型，可以为经皮给药。例如，其可以以溶液、凝胶、固体、糊剂无水生成物、在水相分散油相得到的乳状液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微粒球、离子(脂质体)或非离子型小囊分散体形态，或者霜、乳剂、粉、软膏、喷雾剂或遮瑕棒形式提供。另外，其也可以作为进一步包含泡沫(foam)类型或压缩推进剂的气溶胶组合物形式来使用。作为其他例，其可以为诸如填充剂(filler)的注射剂、栓剂、贴片等剂型，但是不限于此。此等组合物可根据在此项技术中
常见方法来制备。
[0051]
在一实施例中，除了有效成分以外，所述根据本发明的组合物可进一步包含可在不影响主要效果的范围内提供对主要效果起协同效果的其它成分，可以根据化妆料组合物的剂型或使用目的，本领域技术人员没有困难地适当地选择除了本发明的有效成分以外的其他成分进行配制。另外，在必要时，根据本发明的一实施例的化妆料组合物可与所述成分一起包含通常用于化妆料组合物中的其它成分。例如，可使用保湿剂、润滑剂、有机或无机颜料、有机粉末、uv吸收剂、防腐剂、灭菌剂、抗氧化剂、植物提取物、ph调节剂、醇、色素、香料、血液循环促进剂、凉感剂、止汗药、净化水等。可包含于本发明的化妆料组合物中的其它成分不限于此，并且成分的量可以在不影响本发明的目的及效果的范围内进行确定。
[0052]
根据本发明的实施例的组合物可为包含所述有效成分的食品组合物。例如，其可加工成包含所述有效成分的功能性食品，诸如发酵乳、奶酪、酸酪乳、果汁、益生菌以及保健食品等，除此之外，还可以作为各种食品添加剂的形态来使用。在一实施例中，组合物可为保健食品组合物。在一实施例中，所述保健食品组合物可被配制成丸剂、胶囊剂、锭剂、颗粒、焦糖剂或者饮品剂等。在另一个一实施例中，其可加工成液体、粉末、颗粒、锭剂或者茶包等形态。所述组合物可通过各种方法给药，包括简单饮用、注射、喷雾或者挤压等。所述组合物可包含可在不影响本发明的主要效果的范围内对主要效果起协同效果的其它成分。例如，其可进一步包含改善物性的添加剂，诸如香料、色素、灭菌剂、抗氧化剂、防腐剂、保湿剂、增稠剂、无机盐类、乳化剂以及合成高分子物质等。除此之外，其还可以包含佐剂诸如水溶性维生素、油溶性维生素、高分子肽、高分子多醣以及海藻提取物等。根据剂型或使用目的，所述成分可由本领域技术人员适当地选择进行配制，并且其添加量可在不影响本发明的目的及效果的范围内选择。例如，以组合物的总重量为基准，所述成分可以以0.0001～99.9重量％的量添加。
[0053]
根据本发明的实施例的组合物可为包含所述有效成分的药剂学组合物。所述药剂学组合物可进一步包含药剂学佐剂诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化促进剂、用于调节渗透压的盐及/或缓冲剂等及其它治疗上有用物质。
[0054]
在一实施例中，药剂学组合物可为口服给药剂，所述口服给药剂可为例如锭剂、丸剂、硬质或软质胶囊剂、液体、悬浮液、乳状液、糖浆、粉剂、散剂、细微颗粒、颗粒、球剂等。除了有效成分以外，所述剂型可包含表面活性剂、稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素及甘氨酸)、及润滑剂(例如，硅石、滑石、硬脂酸及其镁或钙盐，及聚乙二醇)。另外，锭剂可包含黏合剂诸如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及聚乙烯吡咯啶，并且在必要时可包含例如，淀粉、琼脂、褐藻酸或其钠盐的崩解剂、吸收剂、色素、、香味剂以及甜味剂等药学添加剂。所述锭剂可通过常见混合、造粒或涂布方法来制备。
[0055]
在一实施例中，所述药剂学组合物可为非口服给药剂，所述非口服给药剂可为直肠、局部、皮下或经皮给药型剂型。例如，可为诸如填充剂(filler)的注射剂、点滴剂、软膏、化妆水、乳液、凝胶、霜、喷雾剂、悬浮液、乳剂、栓剂、贴片等剂型，但是不限于此。
[0056]
作为一实施例，所述药剂学组合物的给药量根据待治疗的受试者的年龄、性别及体重、待治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药途径及诊断者的判断而不同。基于此等因素来确定给药量在本领域技术人员的水平范围内。例如，所述给药量
可以是将0.01～10,000mg每天分一次至三次给药，然而，本发明的范围无论如何不受给药量限制。
[0057]
用于实施发明的形态
[0058]
在下文，本发明经由实施例、比较例及试验例来详细描述。然而，以下实施例仅出于说明性目的并且本发明的范围不受实施例、比较例及试验例限制。
[0059]
[实施例1]增强茶黄素含量的cof
‑
gt(共生物发酵绿茶；co
‑
biofermented green tea)分馏的生产
[0060]
将绿茶及茼蒿的叶子用去离子水洗净两次之后，轻拍来去除多余的水。将叶子浸没于液体氮中，磨碎然后储存于
‑
80℃下。如下制备cof
‑
gt。将绿茶粉末(100g)及冷冻茼蒿(50mg)的混合物进行发酵。进行反应3小时之后，混合物用70％乙醇(v/v)提取2小时。使固体份及残留物穿过90网目筛子之后，用0.22μm过滤器(dow corning,corning,ny,usa)进行过滤。将过滤的样品用hei
‑
vap旋转式浓缩蒸发器(heidolph instruments,schwabach,germany)蒸发，然后使用freezone冷冻干燥机(labconco,kansas city,mo,usa)来粉末化。
[0061]
[比较例1]通常发酵的f
‑
gt(通常发酵绿茶)分馏的生产
[0062]
f
‑
gt是将生绿茶的叶子用去离子水洗净两次之后，轻拍来去除多余的水。将叶子浸没于液体氮中，磨碎然后储存于
‑
80℃下。通过在37.5℃下、使用保温套曲拐式混料机(ika,staufen im breisgau,germany)使冷冻绿茶粉末(100g)发酵来制备f
‑
gt。进行反应3小时的后，混合物用70％乙醇(v/v)提取2小时。使固体份及残留物穿过90网目筛子之后，用0.22μm过滤器(dow corning,corning,ny,usa)进行过滤。将过滤的样品用hei
‑
vap旋转式浓缩蒸发器(heidolph instruments,schwabach,germany)进行蒸发，然后使用freezone冷冻干燥机(labconco,kansas city,mo,usa)来粉末化。
[0063]
[试验例1]cof
‑
gt及f
‑
gt分馏的hplc分析
[0064]
将各个样品(8g)超声波处理30分钟并且溶解于100ml的dmso/甲醇/乙醇混合物(5:45:50，v/v)之后，进行离心分离，然后用0.45μm聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene；ptfe)注射过滤器(pall corp.,port washington,ny,usa)进行过滤。将82ml样品填充于50ml样品回路中并且注射至装配有光电二极管组件检测器的(ge healthcare,stockholm,sweden)之后，在275及365nm下进行分析。使用aq
‑
hg十八烷基甲硅烷基柱(10μm,20x 250mm,柱容积(column volume)＝78.5ml；ymc co.,kyoto,japan)进行提纯分离。经由纯水(溶剂a)及乙腈(溶剂b)进行梯度洗脱。一次注射8.2ml样品溶液，并且将移动相的流动速率设定为10ml/min。将所有溶剂过滤、脱气并且在合适压力下使用。样品注射之后，收集分馏(110ml)。各个周期获得四个分馏物并且收集至个别瓶中，持续10个周期。将每四个分馏合并，并且在hei
‑
vap旋转式蒸发器(heidolph instruments)中去除溶剂，经由冷冻干燥来粉末化之后，在
‑
20℃下进行储存直到分析为止。
[0065]
为了检测所述发酵茶的茶黄素成分，利用hplc(高效能液相层析；high
‑
performance liquid chromatography)分析所述实施例1及比较例1中制备的发酵绿茶提取物的茶黄素(theaflavin；tf)、茶黄素
‑3‑
没食子酸酯(theaflavin
‑3‑
gallate；tf
‑
3g)、茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯(theaflavin
‑3’‑
gallate；tf
‑3’
g)及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3
’‑
digallate；tf
‑
3,3’dg)的含量。标准茶黄素购自wako公司并且将试料
溶解于50％乙醇溶剂中，进行超声波提取之后，用0.45μm pvdf过滤器过滤，然后注射到设备中。设备使用hplc(waters alliance 2695系统(waters,usa))，在270nm区域分析检测波长。使用optimapak c18柱(150x 4.6mm,5μm)，通过使用0.05％三氟乙酸(trifluoroacetic acid；tfa)及乙腈(acetonitrile；acn)溶剂的浓度梯度溶剂组成法进行分析，溶剂的浓度组成比展示于以下表1中。所有分析溶剂使用了hplc等级试剂，并且使用empower 3程序(waters)进行数据处理。
[0066]
[表1]
[0067]
时间流动速率(ml/min)％a％b曲线0.001.0802065.001.08020635.01.07030637.51.03070642.51.03070643.01.08020645.01.080206
[0068]
其结果，如图1所示，应用现有的绿茶发酵方法(比较实施例1)的绿茶发酵提取物(fermented green tea extract；f
‑
gt)其四种主要多酚成分均匀增加，但是应用共发酵方法的茶黄素浓缩及生物发酵提取物(concentrated and biofermented theaflavin extract；cof
‑
gt，实施例1)首先生成更多的是茶黄素(1)的含量。
[0069]
[试验例2]细胞培养、分化及细胞存活性的分析
[0070]
细胞培养及分化
[0071]
源自人体的皮下脂肪细胞(human
‑
derived subcutaneous fat cell；hscf)及未分化皮下脂肪细胞的培养基购自zenbio(research triangle park,nc,usa)。hscf在培养期间，在5％co2培养器中进行培养。为了诱导分化，在与10μg/ml胰岛素、0.5mm 3
‑
异丁基
‑1‑
甲基黄嘌呤(3
‑
isobutyl
‑1‑
methylxanthine)、1μm地塞米松(dexamethasone)及1μg曲格列酮(troglitazone)(全部购自sigma
‑
aldrich(usa))一起含有10％胎牛血清(paa，walkersville，md，usa)的杜氏磷酸盐缓冲液(dulbecco`s modified eagle`s medium；lonza,walsvill,md,md,usa)中培养21天。每隔一天更换培养基。
[0072]
细胞存活性的分析
[0073]
使用ez
‑
cytox检测套组(daeil lab service,seoul,korea)按照制造商的说明书来测定hscf的存活性。简言之，培养7天的细胞在药物处理之后，以0.1、0.5、1、5及10μg/ml的多种浓度各自处理茶黄素浓缩及生物发酵提取物(concentrated and biofermented theaflavin extract；cof
‑
gt)、绿茶发酵提取物(fermented green tea extract；f
‑
gt)、茶黄素(theaflavin；tf)及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3
’‑
digallate；tfdg)24小时和72小时。将ez
‑
cytox溶液(10μl)添加至各孔之后，在37℃下培养2小时。使用分光光度计(syergenergy h2；biotek,winooski,vt,usa)测定450nm下的吸光度。将实验重复3次并且用相对于对照组的比较活性比率(％)表示吸光度值。
[0074]
确认所述各个处理物质对hscfs产生影响力的浓度的结果，确认到在将所述处理物质全部处理24小时的增殖效果实验(图2)和处理72小时的毒性确认实验(图3)所有浓度
and biofermented theaflavin extract；cof
‑
gt)及绿茶发酵提取物(fermented green tea extract；f
‑
gt)，然后分化21天。将培养基回收并且在13,000rpm下离心分离15分钟以去除杂质。按照制造商的说明书使用elisa(enzo life sciences,farmingdale,ny,usa)测定洗脱的脂联素的水平。其结果，如图8所示，当用茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯(theaflavin
‑
3,3
’‑
digallate；tfdg)以及绿茶发酵提取物(fermented green tea extract；f
‑
gt)处理时，在脂肪分化后洗脱至培养基中的源自脂肪细胞的激素之一脂联素减少。相比之下，当用根据本发明的一实施例的茶黄素(theaflavin；tf)以及茶黄素浓缩及生物发酵提取物(concentrated and biofermented theaflavin extract；cof
‑
gt)处理时，随着浓度的增加，脂联素的量也增加。此结果也与上述实验例3及4的实验结果一致。
[0084]
[试验例6]茶黄素(theaflavin；tf)的各个浓度的细胞培养、分化及细胞存活性的分析
[0085]
以与试验例2相同的方式确认0.01～100μg/ml茶黄素(theaflavin；tf)对hscf产生影响力的浓度，并在图9中示出。其结果，在处理24小时的细胞增殖效果试验和处理72小时的毒性确认试验全部中，在处理的所有浓度下，除了轻微的细胞增殖效果以外，没有任何的毒性效果而为安全物质。
[0086]
[试验例7]茶黄素(theaflavin；tf)的各个浓度的甘油三酯(triglyceride；tg)增加功效的分析
[0087]
以与所述试验例3相同的方法分析对于0～100μg/ml的茶黄素(theaflavin；tf)，各个浓度的皮下脂肪细胞的分化功效。
[0088]
其结果，如图10所示，茶黄素(theaflavin；tf)到50μg/ml为止，以浓度依赖性方式促成脂肪分化，在100μg/ml下，与50μg/ml相比，脂肪分化能力稍微减弱。
[0089]
在下文，本发明经由根据本说明书的一实施例的组合物的剂型例来详细描述，然而，也可以应用为其他多种剂型，其仅出于说明性目的并且本发明的范围不受其限制。
[0090]
[剂型例1]柔性化妆水(化妆水乳液)
[0091]
按照以下表中记载的组分，通过通常的方法制备柔性化妆水。
[0092]
[表2]
[0093]
成分含量(wt％)茶黄素10甘油3.0丁二醇2.0丙二醇2.0羧乙烯基聚合物0.1peg
‑
12壬基苯基醚0.2聚山梨醇酯800.4乙醇10.0三乙醇胺0.1防腐剂、色素、香料适量净化水余量
[0094]
[剂型例2]营养性化妆水(牛奶润肤露)
[0095]
按照以下表中记载的组分，通过通常的方法制备营养性化妆水。
[0096]
[表3]
[0097]
成分含量(wt％)茶黄素10甘油3.0丁二醇3.0丙二醇3.0羧乙烯基聚合物0.1蜂蜡4.0聚山梨醇酯601.5辛酸/癸酸甘油三酯5.0角鲨烷5.0山梨坦倍半油酸酯1.5液体石蜡0.5鲸蜡硬脂基醇1.0三乙醇胺0.2防腐剂、色素、香料适量净化水余量
[0098]
[剂型例3]按摩霜
[0099]
按照以下表中记载的组分，通过通常的方法制备按摩霜。
[0100]
[表4]
[0101]
成分含量(wt％)茶黄素10甘油8.0丁二醇4.0液体石蜡45.0β
‑
葡聚糖7.0卡波姆0.1辛酸/癸酸甘油三酯3.0蜂蜡4.0鲸蜡硬脂基葡糖苷1.5山梨坦倍半油酸酯0.9凡士林3.0石蜡1.5防腐剂、色素、香料适量净化水余量
[0102]
[剂型例4]锭剂
[0103]
混合100mg茶黄素、400mg乳糖、400mg玉米淀粉及2mg硬脂酸镁后，按照通常的锭剂的制备方法，压片制成锭剂。
[0104]
[剂型例5]胶囊剂
[0105]
混合100mg茶黄素、400mg乳糖、400mg玉米淀粉及2mg硬脂酸镁之后，按照通常的胶囊剂的制备方法，填充在明胶胶囊中，制成胶囊剂。
[0106]
[剂型例6]颗粒剂
[0107]
混合50mg茶黄素、250mg无水结晶葡萄糖及550mg淀粉，使用流化床制粒机成型为颗粒之后，填充在小袋中。
[0108]
[剂型例7]饮品剂
[0109]
混合50mg茶黄素、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸及25g液状低聚糖之后，添加300ml净化水，向每个瓶中填充200ml。填充到瓶中之后，在130℃下灭菌4～5秒，制备饮品剂。
[0110]
[剂型例8]焦糖剂型
[0111]
混合50mg茶黄素、1.8g玉米糖浆(corn syrup)、0.5g脱脂乳、0.5g大豆卵磷脂、0.6g黄油、0.4g氢化植物油、1.4g糖、0.58g人造黄油及20mg食盐，成型焦糖。
[0112]
[剂型例9]保健食品
[0113]
[表5]
[0114][0115]
虽然将比较适合保健食品的成分作为示例混合组成维生素及无机质混合物的组成比，但是混合比可根据需要来改变，可以按照通常的保健食品制备方法，混合上述成分之后，制成颗粒，并且按照通常的方法使用在保健食品组合物的制备中。
[0116]
[剂型例10]健康饮料
[0117]
[表6]
[0118]
成分含量茶黄素10mg柠檬酸1000mg低聚糖100g青梅浓缩物2g牛磺酸1g净化水余量总体积900ml
[0119]
如上表所示，添加剩余量的净化水以使总体积为900ml，并按照通常的健康饮料制备方法混合上述成分之后，在85℃下搅拌加热约1小时，然后将所得溶液进行过滤，填充于灭菌的2l容器中，进行密封、灭菌之后，冷藏保存，从而可用于健康饮料组合物的制备中。
[0120]
[剂型例11]注射剂
[0121]
按照以下表中记载的组分，通过通常方法制备注射剂。
[0122]
[表7]
[0123]
成分含量茶黄素10～50mg注射用灭菌蒸馏水适量ph调节剂适量
[0124]
本发明作为一实施例可以提供以下实施形态。
[0125]
第一实施形态可提供作为有效成分含有茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的用于促进脂肪细胞分化的组合物。
[0126]
第二实施形态可提供根据第一实施形态的组合物，其中，所述组合物包含发酵绿茶提取物，所述发酵绿茶提取物包含茶黄素。
[0127]
第三实施形态可提供根据第一实施形态以及第二实施形态中的任一个的组合物，其中，所述发酵绿茶提取物包含茶黄素类，所述茶黄素类包括茶黄素、茶黄素
‑3‑
没食子酸酯、茶黄素
‑3’‑
没食子酸酯及茶黄素
‑
3,3
’‑
二没食子酸酯，相对于所述茶黄素类的总重量，以30
‑
50重量％含有所述茶黄素。
[0128]
第四实施形态可提供根据第一至第三实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述发酵绿茶提取物通过包括以下步骤的方法来制备：
[0129]
(a)混合绿茶及茼蒿来制备混合物的步骤；
[0130]
(b)在减压状态下将所述混合物发酵并且干燥的步骤；及
[0131]
(c)提取所述经发酵并且干燥的混合物的步骤。
[0132]
第五实施形态可提供根据第一至第四实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物在组合物内的浓度为0.01～10,000mg/kg。
[0133]
第六实施形态可提供根据第一至第五实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述茶黄素、其异构体、其药学上可接受的盐、其水合物或其溶剂化物的给药量为0.01～10,
000mg/kg/日。
[0134]
第七实施形态可提供根据第一至第六实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物通过促进脂肪细胞分化来增加皮肤体积。
[0135]
第八实施形态可提供根据第一至第七实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物通过促进脂肪细胞分化来抑制皮下脂肪的减少。
[0136]
第九实施形态可提供根据第一至第八实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物用于经皮给药。
[0137]
第十实施形态可提供根据第一至第九实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物为化妆料组合物。
[0138]
第十一实施形态可提供根据第一至第十实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物为药学组合物。
[0139]
第十二实施形态可提供根据第一至第十一实施形态中的一个以上的组合物，其中，所述组合物为食品组合物。
[0140]
所述实施形态出于说明目的来提供并且不意欲限制本发明的范畴。因此，本技术领域的通常的技术人员可作出各种修改、变化及取代而不脱离本发明的含义及范畴。