一种CO靶向递送系统及其构建方法与应用与流程

一种co靶向递送系统及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及co靶向递送的技术领域，尤其是指一种co靶向递送系统及其构建方法与应用。


背景技术：

2.长期以来，一氧化碳(co)被公认为是一个有毒气体，该气体能与血红蛋白结构中的血红素结合，且亲和力是氧气的200倍，从而阻断血红蛋白的供氧功能。内源性的一氧化碳(co)是由血红素通过血红素加氧酶催化生成的。在过去二三十年的时间里，一氧化碳(co)已经证实是体内非常重要的气体信使小分子之一。如同一氧化氮(no)和硫化氢(h2s)一样，co在哺乳动物体内发挥着重要的生理调节作用。据报道，一氧化碳(co)在抗菌、抗炎、抗肿瘤、心脑血管疾病以及器官移植和保存等都表现出很好的治疗效果，这些发现都使一氧化碳(co)具有广阔的临床应用前景。美国fda已批准co气体的临床实验研究(clinicaltrials.gov：nct03799874，nct01214187等)。但是以气体作为临床输送co的方式存在很大缺陷：(1)以吸入形式的给药只能在医院才能进行，病人携带较为不便。(2)co气体剂量很难控制，且给药方式严重依赖病人是否具有健全的肺部功能。(3)co气体释放不可控，由此带来的脱靶效应也不容小觑。因此，co药物的安全可控递送是co临床转化亟待解决的瓶颈问题。
3.前药策略是解决药物安全递送一个十分有效的方法。然而，与传统小分子前药研发不同，co前药的研发是一项非常具有挑战性的课题。首先，co是一个气体分子，在化学上非常的惰性。其次，co结构非常简单，缺乏相应的官能团进行化学衍生化。因此，传统的前药策略很难适用于co前药的研发。已报道的co前药主要包括重金属co络合物及有机co前药(图13)。
4.基于重金属
‑
co络合物(corm
‑
s1～3)虽然在研究co生理作用方面做出重要贡献，但是由于重金属固有的毒性问题，这类co前药很难用于临床开发。另外一类co前药是无重金属的有机小分子co前药，这类前药又可分为需要光激活(photo
‑
corm，图13)和非光激活(org
‑
corm，图13)两类。由于光对机体组织穿透性差等固有缺陷，使得photo
‑
corm类co前药也很难应用于临床。无重金属、无需光激活的co前药org
‑
corm利用分子内的dielsalder环加成反应在生理条件下释放co，这类前药虽然规避了重金属毒性和需要光激活的缺陷，但是这类co前药也存在一些固有问题：如co释放不具有靶向性(不需要任何的刺激激活，一旦溶于水溶液中便开始释放co)，以及前药结构中存在一个迈克尔加成受体(环戊二烯酮骨架)，存在毒性的风险。因此，急需开发具有全新释放机理的co前药来解决这些瓶颈问题。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种co靶向递送系统及其构建方法与应用。本发明为了规避光对机体组织穿透性差的缺陷，利用化学能来激发photo
‑
corm释放co，h2o2与不同取代的草酸酯反应，会生成一个处于激发态的高能中间体过氧化草酸酯，这个高能
中间体通过化学能量转移给photo
‑
corm，激发后者到激发态而释放co，最终实现靶向递送的目的。
6.一种co靶向递送系统，所述靶向递送系统为一氧化碳前药与草酸酯类化合物形成的纳米粒；所述草酸酯类化合物包括草酸酯和/或草酸酯聚合物。
7.在本发明的一个实施例中，所述一氧化碳前药的结构如式(1)所示：
[0008][0009]
其中，y＝o或s；x＝o、s或n；
[0010]
r1‑
r4独立为烷烃基、烷氧基、胺基、卤素、氰基、羧基、烷硫基、烷氧甲酰基或胺甲酰基；
[0011]
r5为芳基、杂芳基或烷基。
[0012]
在本发明的一个实施例中，所述草酸酯聚合物的结构如式(2)、(3)所示：
[0013][0014]
其中，n为20
‑
200的整数，m＝10
‑
200的整数。
[0015]
在本发明的一个实施例中，所述草酸酯的结构如式(4)所示：
[0016]
其中r1为芳基或烷烃基，r2为芳基或烷烃基。
[0017]
在本发明的一个实施例中，所述纳米粒通过以下方法制备得到：在有机溶剂中，将所述草酸酯类化合物与所述一氧化碳前药混合，加入乳化剂混合均匀，减压蒸馏即得所述纳米粒。
[0018]
在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙醚和三氯甲烷中的一种或多种。
[0019]
在本发明的一个实施例中，所述草酸酯类化合物与一氧化碳前药的质量比为0.1：1
‑
70：1。
[0020]
在本发明的一个实施例中，所述乳化剂与草酸酯类化合物的摩尔比为0.1：1
‑
20：1。
[0021]
在本发明的一个实施例中，所述草酸酯类化合物的浓度为40
‑
1000μm；所述一氧化
碳前药的浓度为5
‑
100μm。
[0022]
在本发明的一个实施例中，所述乳化剂为聚乙烯醇溶液或/和人血清白蛋白溶液。
[0023]
在本发明的一个实施例中，所述聚乙烯醇溶液质量浓度为0.5％
‑
5％；所述人血清白蛋白溶液质量浓度为2
‑
10mg/ml。
[0024]
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0025]
本发明为了规避光对机体组织穿透性差的缺陷，利用化学能来激发photo
‑
corm释放co，h2o2与不同取代的草酸酯类化合物反应，会生成一个处于激发态的高能中间体过氧化草酸酯，这个高能中间体通过化学能量转移给photo
‑
corm，激发后者到激发态而释放co。由于高能中间体过氧化草酸酯半衰期非常短，为了保障能量转移的效率，需要借助一些药物载体的手段，如纳米粒等，将二者共递送到靶部位。本发明co前药一方面规避了重金属毒性的问题，另一方面由于不使用外加光源，克服了光难以穿透皮肤和组织的缺陷，此外通过特应性的响应过氧化氢，能够在过氧化氢高表达的肿瘤或炎症细胞靶向释放一氧化碳。
附图说明
[0026]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0027]
图1是本发明原理示意图。
[0028]
图2是本发明测试例1中纳米粒a的不同时间点的紫外吸收谱图。
[0029]
图3是本发明测试例1中1
‑
s的降解产物核磁谱图。
[0030]
图4是本发明测试例2中纳米粒b的不同时间点的紫外吸收谱图。
[0031]
图5是本发明测试例2中1
‑
s的降解产物核磁谱图。
[0032]
图6是本发明测试例3中检测实施例1中纳米粒a的肌红蛋白检测一氧化碳结果示意图。
[0033]
图7是本发明实施例5
‑
实施例7制备得到的纳米粒和对比例1
‑
5中得到纳米粒的co释放动力学的研究。
[0034]
图8是本发明实施例1
‑
s、2
‑
s、3
‑
s和对比例1
‑
5中4
‑
s、5
‑
s、6、7、8的分子结构式。
[0035]
图9是本发明测试例5中草酸酯聚合物a用量对co释放的影响结果图。
[0036]
图10是本发明测试例6中co释放特异性结果图。
[0037]
图11是本发明测试例7中ph对co释放速率影响结果图。
[0038]
图12是本发明测试例8中h2o2含量对co释放的结果图。
[0039]
图13是本发明测试例9细胞毒性实验结果。
[0040]
图14和图15是本发明测试例10细胞内co成像实验结果。
[0041]
图16是本发明测试例11细胞对纳米粒的摄取实验结果。
[0042]
图17是本领域中重金属co络合物及有机co前药分子结构图。
具体实施方式
[0043]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0044]
实施例1
[0045]
1.草酸酯聚合物的合成方法：
[0046][0047]
氮气氛围下，将4
‑
羟基苯甲醇(16mmol)与1,8
‑
辛二醇(2.4mmol)溶解于无水四氢呋喃(10ml)，然后在0℃下向该混合液滴加三乙胺(40mmol)，加闭，搅拌5min。在0℃将该上述混合物缓慢滴加到草酰氯(溶解于20ml无水四氢呋喃)中，加闭，将反应恢复至室温，并搅拌反应12h。使用饱和氯化钠溶液淬灭，并用乙酸乙酯(50ml
×
3)进行萃取，有机相使用无水硫酸钠干燥并减压蒸发溶剂得到粗品，聚合物通过使用二氯甲烷/正己烷(1:1)进行析出纯化草酸酯聚合物a，其中n＝20
‑
50。草酸酯聚合物a的核磁数据为：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.54
‑
7.45(m,2h),7.24
‑
7.16(m,2h),5.40
‑
5.31(m,2h),4.40
‑
4.26(m,4h),1.82
‑
1.66(m,4h),1.47
‑
1.28(m,8h)。
[0048]
2.硫代羰基一氧化碳前药1
‑
s的合成方法
[0049][0050]
氮气保护下，将3
‑
羟基
‑2‑
苯基
‑
4h
‑
苯并[g]色烯
‑4‑
酮(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药1
‑
s。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.14(s,1h),8.61(s,1h),8.48(d,j＝6.8hz,2h),8.11(d,j＝11.3hz,2h),7.94(d,j＝8.3hz,1h),7.68
‑
7.47(m,5h)；
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ189.4,147.3,145.3,141.9,135.6,131.2,131.0,129.7,129.4,129.2,128.9,128.8,127.2,126.5,126.3,114.7.
[0051]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0052]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药1
‑
s(0.5mg)溶于500μl二氯甲烷中，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒a。
[0053]
实施例2
[0054]
1.草酸酯聚合物的合成与实施例1中相同。
[0055]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成方法
[0056][0057]
氮气保护下，将3
‑
羟基黄酮(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完
毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药2
‑
s。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.71(s,1h),8.57(d,j＝8.1hz,1h),8.38(d,j＝7.1hz,2h),7.71(t,j＝7.4hz,1h),7.64(d,j＝8.3hz,1h),7.59
‑
7.51(m,3h),7.46(t,j＝7.5hz,1h)；
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ188.2,150.5,146.3,141.4,133.3,131.0,130.9,128.9,128.8,128.1,125.9,118.5。
[0058]
3.化学能纳米粒b的制备方法
[0059]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)溶于500μl二氯甲烷中，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(将聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒b。
[0060]
实施例3
[0061]
1.草酸酯聚合物的合成与实施例1中相同。
[0062]
2.硫代羰基一氧化碳前药3
‑
s的合成方法
[0063][0064]
氮气保护下，将3
‑
羟基
‑
4h
‑
色烯
‑4‑
酮(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药3
‑
s。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.60(d,j＝8.3hz,1h),8.06(s,1h),7.71(t,j＝8.3,7.2hz,1h),7.67(s,1h),7.57(d,j＝8.5hz,1h),7.48(t,j＝7.6hz,1h)；
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ190.0,151.0,149.2,133.4,133.0,129.0,128.5,126.1,119.0。
[0065]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒c的制备方法
[0066]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药3
‑
s(0.5mg)溶于500μl二氯甲烷中，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒c。
[0067]
实施例4
[0068]
1.草酸酯聚合物的合成与实施例1中相同。
[0069]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0070]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒d的制备方法
[0071]
将草酸酯聚合物(2.24mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.16mg)溶于250μl的二氯甲烷，加入5ml的4mg/ml的人血清白蛋白，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒d。
[0072]
实施例5
‑
7中一氧化碳靶向递送系统即纳米粒制备同实施例1，区别点在于实施例5
‑
7中的一氧化碳前药分别为1
‑
s、2
‑
s、3
‑
s，其中一氧化碳前药摩尔数均为n＝1.97μmol，制备得到的纳米粒分别为e
‑
1，e
‑
2，e
‑
3。
[0073]
实施例8
‑
12
[0074]
实施例8
‑
12中纳米粒制备同实施例1，区别点在于实施例8
‑
12中的一氧化碳前药均为2
‑
s，且一氧化碳前药均为2
‑
s和草酸酯聚合物a用量分别为0.1mg/7.0mg；0.3mg/7.0mg；0.5mg/7.0mg；0.8mg/7.0mg；1.0mg/7.0mg。制备得到纳米材料分别为f
‑
1、f
‑
2、f
‑
3、f
‑
4、f
‑
5。
[0075]
实施例13
[0076]
1.其中草酸酯b为：
[0077][0078]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0079]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0080]
将草酸酯b(1mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒h。
[0081]
实施例14
[0082]
1.草酸酯1的制备：
[0083][0084]
氮气氛围下，将对甲基苯酚(1.05ml,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物1(2.04g)，收率98％。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ7.21(d,j＝8.6hz,1h),7.07(d,j＝8.4hz,1h),4.44(q,j＝7.1hz,1h),2.35(s,2h),1.43(t,j＝7.1hz,2h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,150.1,134.4,129.6,121.3,61.4,21.15(s),14.7。
[0085]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0086]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法：
[0087]
将草酸酯1(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒1。
[0088]
实施例15
[0089]
1.草酸酯2的制备：
[0090][0091]
氮气氛围下，将3,4,5
‑
三甲氧基苯酚(1.83g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物2(2.69g)，收率95％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ6.44(s,2h),4.18(s,2h),3.83(s,6h),3.71(s,3h),1.25(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,155.7,148.8,135.7,99.8,61.5,60.7,56.8,14.7.
[0092]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0093]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法：
[0094]
将草酸酯2(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒2。
[0095]
实施例16
[0096]
1.草酸酯3的制备：
[0097][0098]
氮气氛围下，将对氰基苯酚(1.18g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物3(2.01g)，收率92％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.89(d,j＝14.8hz,2h),7.38(d,j＝15.0hz,2h),4.18(q,j＝11.8hz,2h),1.25(t,j＝11.8hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,156.6,133.2,123.8,118.9,109.9,61.4,14.7.
[0099]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0100]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法：
[0101]
将草酸酯3(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒3。
[0102]
实施例17
[0103]
1.草酸酯4的制备：
[0104][0105]
氮气氛围下，将对甲氧基苯酚(1.24g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物4(2.15g)，收率96％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.21(d,j＝15.0hz,2h),6.99(d,j＝15.0hz,2h),4.18(q,j＝11.8hz,2h),3.79(s,3h),1.25(t,j＝11.8hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,156.8,145.1,123.1,114.6,61.4,56.1,14.7。
[0106]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0107]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法：
[0108]
将草酸酯4(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒4。
[0109]
实施例18
[0110]
1.草酸酯5的制备：
[0111][0112]
氮气氛围下，将对三氟甲基苯酚(1.63g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物5(2.38g)，收率91％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.50(d,j＝15.0hz,2h),7.11(d,j＝15.0hz,2h),4.18(q,j＝11.8hz,2h),1.25(t,j＝11.8hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,154.3,129.3(q,j
c
‑
f
＝32.4hz),127.4(q,j
c
‑
f
＝3.7hz),123.6(q,j
c
‑
f
＝268.1hz),121.7,61.4,14.7.
[0113]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0114]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0115]
将草酸酯5(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒5。
[0116]
实施例19
[0117]
1.草酸酯6的制备：
[0118][0119]
氮气氛围下，将对氟苯酚(1.12g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物6(1.91g)，收率90％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.18
‑
7.17(m,2h),7.16
‑
7.14(m,2h),4.18(q,j＝11.8hz,2h),1.25(t,j＝11.8hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ161.2,159.5,159.2,158.1,148.6(d,j
c
‑
f
＝3.7hz),121.48(d,j
c
‑
f
＝7.6hz),115.4(d,j
c
‑
f
＝20.0hz),61.4,14.6.
[0120]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0121]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0122]
将草酸酯6(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒6。
[0123]
实施例20
[0124]
1.草酸酯7的制备：
[0125][0126]
氮气氛围下，将对氯苯酚(1.28g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物7(2.05g)，收率90％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.41(d,j＝15.2hz,2h),7.35(d,j＝15.2hz,2h),4.18(q,j＝11.8hz,2h),1.25(t,j＝11.8hz,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,150.2,131.8,129.7,122.2,61.4,14.7.
[0127]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0128]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0129]
将草酸酯7(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒7。
[0130]
实施例21
[0131]
1.草酸酯8的制备：
[0132][0133]
氮气氛围下，将对庚基苯酚(1.92g,1.0当量)和三乙胺(2.8ml,2.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯单乙酯(2.1ml,2.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物8(2.48g)，收率85％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.16(d,j＝15.2hz,2h),7.12(d,j＝15.2hz,2h),4.16(q,j＝11.8hz,2h),2.63(t,j＝15.7hz,2h),1.63(tt,j＝30.7,15.2hz,2h),1.30
‑
1.21(m,12h),0.95
‑
0.83(m,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ159.5,158.1,150.4,138.5,128.1,122.2,61.4,36.3,31.7,30.1,28.9,28.9,23.2,14.7,14.0.
[0134]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0135]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0136]
将草酸酯8(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒8。
[0137]
实施例22
[0138]
1.草酸酯9的制备：
[0139][0140]
氮气氛围下，将3,4,5
‑
三甲氧基苯酚(1.83g,4.0当量)和三乙胺(2.8ml,4.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯(227μl,1.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物9(971mg)，收率92％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ6.44(s,4h),3.83(s,12h),3.71(s,6h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ155.7,155.1,148.8,135.7,99.8,60.7),56.8.
[0141]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0142]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0143]
将草酸酯9(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇
[0144]
(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒9。
[0145]
实施例23
[0146]
1.草酸酯10的制备：
[0147][0148]
氮气氛围下，将对甲氧基苯酚(1.05ml,4.0当量)和三乙胺(2.8ml,4.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯(227μl,1.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物10(740mg)，收率98％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.21(d,j＝15.0hz,4h),6.99(d,j＝15.0hz,4h),3.79(s,6h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ156.8,155.1,145.1,123.1,114.6,56.1.
[0149]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0150]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0151]
将草酸酯10(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒10。
[0152]
实施例24
[0153]
1.草酸酯11的制备：
[0154][0155]
氮气氛围下，将对三氟甲基苯酚(1.63g,4.0当量)和三乙胺(2.8ml,4.0当量)溶于二氯甲烷(20ml)置于50ml双颈瓶，在0℃下滴加草酰氯(227μl,1.0当量)，加毕继续反应10分钟，通过薄层色谱监测反应，反应完毕，旋干溶剂，通过柱层析色谱法(pe:ea＝20:1)分离纯化得到化合物11(832mg)，收率88％。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.53
‑
7.45(m,2h),7.14
‑
7.08(m,2h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ155.1,154.3,129.3(q,j＝32.4hz),127.4(q,j＝3.7hz),123.6(q,j＝268.1hz),121.7(d,j＝1.5hz).
[0156]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0157]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0158]
将草酸酯11(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒11。
[0159]
实施例25
[0160]
1.其中草酸酯为：
[0161][0162]
2.硫代羰基一氧化碳前药2
‑
s的合成与实施例2相同。
[0163]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0164]
将草酸酯12(4mg)和一氧化碳前药2
‑
s(0.5mg)，plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)(7mg)一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒12。
[0165]
实施例26
[0166]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0167]
2.硫代羰基一氧化碳前药21的合成方法
[0168][0169]
氮气保护下，将21
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药21。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.71
‑
7.57(m,2h),7.39(d,j＝9.0hz,4h),7.32
‑
7.17(m,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ198.9,174.8,137.4,135.8,134.5,131.2,130.8,130.6,130.3,128.7,128.7,127.6,127.1.
[0170]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0171]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药21(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒21。
[0172]
实施例27
[0173]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0174]
2.硫代羰基一氧化碳前药22的合成方法
[0175][0176]
氮气保护下，将22
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳
前药22。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.77
‑
7.67(m,2h),7.57
‑
7.49(m,3h),7.42(td,j＝15.0,3.0hz,1h),7.12(dd,j＝14.5,3.0hz,1h),6.81
‑
6.68(m,2h),3.36(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ178.3,154.2,140.3,138.8,135.7,132.9,129.5,129.3,128.0,127.7,127.0,124.4,117.1,40.3.
[0177]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0178]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药22(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒22。
[0179]
实施例28
[0180]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0181]
2.硫代羰基一氧化碳前药23的合成方法
[0182][0183]
氮气保护下，将23
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药23。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.77(ddd,j＝10.2,5.8,2.9hz,2h),7.51
–
7.42(m,3h),7.11(dd,j＝14.9,3.0hz,1h),6.63(d,j＝3.1hz,1h),3.77(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ208.3,156.1,147.7,147.6,146.7,132.3,130.5,130.2,129.3,128.6,124.7,119.6,110.8,56.1.
[0184]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0185]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药23(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒23。
[0186]
实施例29
[0187]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0188]
2.硫代羰基一氧化碳前药24的合成方法
[0189][0190]
氮气保护下，将24
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋
干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药24。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.83
‑
7.69(m,2h),7.55
‑
7.44(m,3h),7.42
‑
7.40(m,2h),6.95(d,j＝2.1hz,1h),2.42(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ208.3,151.2,147.7,146.7,137.7,135.4,132.3,130.2,129.3,128.6,127.7,125.1,117.0,21.2.
[0191]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0192]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药24(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒24。
[0193]
实施例30
[0194]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0195]
2.硫代羰基一氧化碳前药25的合成方法
[0196][0197]
氮气保护下，将25
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药25。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.85
‑
7.74(m,3h),7.71(d,j＝3.1hz,1h),7.52
‑
7.43(m,3h),6.96(d,j＝15.0hz,1h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ208.3,159.0,147.7,146.7,141.4,132.3,130.2,129.3,128.6,128.6,124.4,120.5,118.8,108.6.
[0198]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0199]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药25(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒25。
[0200]
实施例31
[0201]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0202]
2.硫代羰基一氧化碳前药26的合成方法
[0203][0204]
氮气保护下，将26
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳
前药26。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.93
‑
7.67(m,2h),7.57
‑
7.39(m,3h),7.30
‑
7.08(m,2h),6.88
‑
6.75(m,1h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ188.9,154.3,147.6,145.5,134.4,132.3,130.2,130.1,129.3,128.6,126.2,126.0,116.1.
[0205]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0206]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药26(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒26。
[0207]
实施例32
[0208]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0209]
2.硫代羰基一氧化碳前药27的合成方法
[0210][0211]
氮气保护下，将27
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药27。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.77
‑
7.6(m,2h),7.53
‑
7.41(m,3h),6.94(d,j＝2.0hz,2h),6.48
‑
6.34(m,1h),2.45(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,155.5,147.7,146.7,146.4,133.8,132.3,130.2,129.3,128.6,123.8,117.4,116.2,16.7.
[0212]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0213]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药27(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒27。
[0214]
实施例33
[0215]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0216]
2.硫代羰基一氧化碳前药28的合成方法
[0217][0218]
氮气保护下，将28
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药28。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.23(dd,j＝14.7,3.2hz,1h),8.16(dd,j＝15.0,3.1hz,
1h),7.97(t,j＝14.9hz,1h),7.82
‑
7.72(m,2h),7.53
‑
7.42(m,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ190.3,154.7,153.0,148.6,146.9,145.8,132.3,130.2,130.0,129.3,128.6,124.5.
[0219]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0220]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药28(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒28。
[0221]
实施例34
[0222]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0223]
2.硫代羰基一氧化碳前药29的合成方法
[0224][0225]
氮气保护下，将29
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药29。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.52(d,j＝15.0hz,2h),7.55
‑
7.43(m,1h),7.42
‑
7.33(m,3h),7.05(dd,j＝15.0,3.1hz,1h),6.92
‑
6.81(m,1h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,152.9,150.4,147.7,146.7,138.2,131.2,128.1,128.0,125.1,119.9,117.6.
[0226]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0227]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药29(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒29。
[0228]
实施例35
[0229]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0230]
2.硫代羰基一氧化碳前药30的合成方法
[0231][0232]
氮气保护下，将30
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药30。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.48(t,j＝7.5,1.5hz,1h),7.36(d,j＝7.5,1.4hz,1h),7.05(d,j＝7.5,1.4hz,1h),6.88(t,j＝7.5,1.4hz,1h),4.27
‑
4.04(m,2h),3.53
‑
3.34(m,
1h),2.83
‑
2.63(m,2h),1.90
‑
1.75(m,2h),1.65
‑
1.54(m,1h),1.24
‑
1.16(m,2h),1.14
‑
1.04(m,1h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.7,153.0,146.1,141.3,131.6,128.1,127.8,125.0,117.5,36.6,30.3,25.9,25.2.
[0233]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0234]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药30(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒30。
[0235]
实施例36
[0236]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0237]
2.硫代羰基一氧化碳前药31的合成方法
[0238][0239]
氮气保护下，将31
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药31。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.48(t,j＝14.9,3.0hz,1h),7.36(d,j＝15.0,3.1hz,1h),7.05(d,j＝15.0,3.1hz,1h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h),1.79(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ208.1,154.6,153.1,144.3,132.5,128.4,127.4,124.9,117.5,12.8.
[0240]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0241]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药31(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒31。
[0242]
实施例37
[0243]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0244]
2.硫代羰基一氧化碳前药32的合成方法
[0245][0246]
氮气保护下，将32
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药32。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.59(d,j＝15.0hz,2h),7.48(t,j＝14.9,3.0hz,1h),
7.42
‑
7.28(m,3h),7.05(d,j＝15.0,3.1hz,1h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h),1.49(s,9h).；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,154.5,152.9,147.7,146.7,142.2,132.2,131.2,130.2,128.1,128.0,125.1,119.2,117.6,80.9,28.3.
[0247]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0248]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药32(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒32。
[0249]
实施例38
[0250]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0251]
2.硫代羰基一氧化碳前药33的合成方法
[0252][0253]
氮气保护下，将33
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药33。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.48(t,j＝14.9,3.0hz,1h),7.36(d,j＝15.0,3.1hz,1h),7.12
‑
7.02(m,3h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h),6.29
‑
6.16(m,2h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,152.9,151.9,147.7,146.7,131.2,129.7,128.1,128.0,125.1,122.8,117.6,115.6.
[0254]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0255]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药33(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒33。
[0256]
实施例39
[0257]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0258]
2.硫代羰基一氧化碳前药34的合成方法
[0259][0260]
氮气保护下，将34
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳
前药34。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.71
‑
7.62(m,2h),7.48(t,j＝14.9,3.0hz,1h),7.41
‑
7.32(m,3h),7.05(d,j＝15.0,3.1hz,1h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h),3.90(s,3h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,167.3,152.9,147.7,146.7,133.4,132.4,131.5,131.2,128.1,128.0,127.9,125.1,117.6,52.1.
[0261]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0262]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药34(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒34。
[0263]
实施例40
[0264]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0265]
2.硫代羰基一氧化碳前药35的合成方法
[0266][0267]
氮气保护下，将35
‑
o(1.0当量)和氢氧化锂(3.0当量)一起加入到双颈反应瓶，加入四氢呋喃和水的混合溶剂后室温搅拌，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕使用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药35。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.83(d,j＝15.0hz,2h),7.54
–
7.42(m,3h),7.36(d,j＝15.0,3.1hz,1h),7.05(d,j＝15.0,3.1hz,1h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,168.8,152.9,147.7,146.7,138.0,131.7,131.2,128.9,128.1,128.0,127.8,125.1,117.6.
[0268]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0269]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药35(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒35。
[0270]
实施例41
[0271]
1.其中草酸酯聚合物的合成方法与实施例1相同。
[0272]
2.硫代羰基一氧化碳前药36的合成方法
[0273][0274]
氮气保护下，将36
‑
o(1.0当量)和劳森试剂(0.6当量)一起加入到双颈反应瓶，加入甲苯后加热至120℃回流4h，颜色逐渐加深，通过薄层色谱板监测反应进程，反应完毕旋
干甲苯，使用柱层析色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)进行分离纯化，得到相应的一氧化碳前药36。1h nmr(500mhz,cdcl3)δ7.54
–
7.44(m,3h),7.36(d,j＝15.0,3.1hz,1h),7.05(d,j＝15.0,3.1hz,1h),6.88(t,j＝14.8,3.1hz,1h),6.68
–
6.62(m,2h)；
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ205.0,160.4,152.9,147.7,146.7,131.2,131.0,128.1,128.0,125.1,122.0,117.6,115.8.
[0275]
3.一氧化碳靶向递送系统即化学能纳米粒的制备方法
[0276]
将草酸酯聚合物a(7mg)和一氧化碳前药36(0.5mg)，一起溶于500μl的二氯甲烷，加入3ml聚乙烯醇(pva)溶液(聚乙烯醇固体溶于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中制备成质量浓度为5％的聚乙烯醇(pva)溶液)，使用超声波细胞破碎仪超声乳化10min，在37℃下减压浓缩除去二氯甲烷，得到均一澄清的液体，纳米粒36。
[0277]
对比例1
‑5[0278]
对比例1
‑
5中纳米粒制备同实施例1，区别点在于对比例1
‑
5的一氧化碳前药分别为4
‑
s、5
‑
s、6、7、8，结构见图8。其中一氧化碳前药摩尔数均为n＝1.97μmol，前药浓度：40μμ，草酸酯聚合物浓度：434μμ。制备得到的纳米粒分别为g
‑
4、g
‑
5、g
‑
6、g
‑
7、g
‑
8。
[0279]
测试例
[0280]
测试例1一氧化碳前药1
‑
s的纳米粒a的紫外吸收实验
[0281]
将实施例1中制备得到纳米粒a溶解于ph＝7.4的磷酸盐缓冲液，之后加入浓度为1mm的h2o2，并检测不同时间点的紫外吸收。结果见图2。
[0282]
由图2可知，纳米粒a的紫外吸收实验表明，当加入1mm的h2o2时，380nm和500nm左右的吸收峰吸光度随时间的增加明显下降，表明1
‑
s的降解和co的释放在1h基本反应完成，吸光度趋于平稳。此外，本发明还分离得到1
‑
s降解后的产物，核磁数据如图3和图5所示，表明1
‑
s是经过激发态的形式释放co。
[0283]
测试例2一氧化碳前药2
‑
s的纳米粒b的紫外吸收实验
[0284]
将实施例2中纳米粒b溶解在ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中，并加入h2o2浓度为1mm时检测不同时间点的紫外吸收。结果见图4。
[0285]
由图4可知，纳米粒b的紫外吸收实验表明，当加入1mm的h2o2时，380nm和500nm左右的吸收峰吸光度随时间的增加明显下降，表明2
‑
s的降解和co的释放在1h基本反应完成，吸光度趋于平稳。
[0286]
测试例3肌红蛋白检测一氧化碳(co)生成
[0287]
将实施例1中制备得到的纳米粒a，溶液体积：120ml，h2o2：10mm，肌红蛋白浓度0.5mg/ml，连二亚硫酸钠22mg/ml。具体实验操作为：
[0288]
(1)将肌红蛋白溶于pbs(ph＝7.4的磷酸盐缓冲液)，超声条件下使用氮气吹气进行脱氧气操作制备脱氧的肌红蛋白，并加入22mg/ml的连二亚硫酸钠1ml备用。
[0289]
(2)将制备的纳米粒a用pbs溶液稀释到120ml。
[0290]
(3)将10mm的h2o2加入到(2)中，并使用双头针将气体导入(1)的溶液中，并将(2)在4℃下搅拌反应4h，然后将其放入4℃冰箱放置过夜。对照组：以同等体积的pbs(ph＝7.4的磷酸盐缓冲液)替代过氧化氢，其他条件相同。结果见图6。由图中可知，与对照组相比，实验组观测到550nm的吸收峰明显变为双峰，进一步确证了co的释放。
[0291]
测试例4不同一氧化碳前药中co释放动力学的研究
[0292]
将实施例5
‑
7中制备得到的纳米粒e
‑
1，e
‑
2，e
‑
3和对比例1
‑
5中制备得到的纳米粒g
‑
4、g
‑
5、g
‑
6、g
‑
7、g
‑
8。h2o2浓度：1.0mm(5μl)，溶液体积：50ml。将纳米粒e
‑
1，e
‑
2，e
‑
3，g
‑
4，g
‑
6，g
‑
7，g
‑
8分别用pbs溶液稀释至50ml反应瓶中，在37℃下，加入浓度为1mm的h2o2后检测器开始检测，每组实验重复三次，取平均值。实验结果见图7。
[0293]
由图7可知，本发明使用相同摩尔数的不同一氧化碳前药分别通过检测器进行co释放检测，本发明发现只有纳米粒e
‑
1，e
‑
2，e
‑
3，能够在该条件下释放co，纳米粒e
‑
2的释放效率是最好的，并且释放速率也是最快的。相应的氧取代衍生物均未见明显co的释放。本发明发现使用氧取代的衍生物制备的供能纳米粒前药容易在体系中析出，这可能导致产生的化学能难以转移到前药。为了克服氧取代的衍生物前药析出这一缺点，本发明加入了plga(乳酸
‑
羟基乳酸共聚物)作为纳米粒的辅助支撑，plga与前药质量比为10:1。实验证明，氧取代衍生物加入plga后制备的纳米粒没有药物析出，并在1mm h2o2条件下，经过1h成功释放出30ppm的co。增加草酸酯聚合物a的用量提供更多的化学能，以期望提高1
‑
s的释放效率，虽然前药1
‑
s的释放效率略有提高，但是增加并不明显。
[0294]
测试例5草酸酯聚合物a用量对co释放的影响
[0295]
将实施例8
‑
12中制备得到纳米粒f
‑
1、f
‑
2、f
‑
3、f
‑
4、f
‑
5，h2o2浓度：1.0mm(5μl)，溶液体积：50ml。将f
‑
1、f
‑
2、f
‑
3、f
‑
4、f
‑
5分别用pbs溶液稀释至50ml反应瓶中，在37℃下，加入浓度为1mm的h2o2后检测器开始检测，每组实验重复三次，取平均值。实验结果见图9。
[0296]
实验结果表明0.5mg/7.0mg的配比具有最好的释放效果，但co的释放与前药质量的增加并不是线性关系，这表明定量的化学能可能随着前药质量的增加能量供应有所不足。当我们继续增加前药的用量时，co的释放量反而有略微下降。
[0297]
测试例6co释放的特异性
[0298]
为了确定化学能纳米粒能够对过氧化氢的响应特异性，筛选了一些活性氧和一些内源性的小分子如t
‑
buo、ho、h2o2、ocl
‑
、gsh、cys，将实施例10中制备得到纳米粒f3对过氧化氢的响应特异性实验，具体步骤为：将纳米粒b用pbs溶液稀释至50ml反应瓶中，在37℃下分别加入浓度为1mm的t
‑
buo、ho、h2o2、naocl、gsh、cys后检测器开始检测，每组实验重复三次，取平均值。实验结果见图10，由图中可知本发明所得纳米粒对过氧化氢的响应性是其他各种活性氧的30倍左右，具有很好的特异性响应，这为向过氧化氢高表达的肿瘤细胞和炎症细胞的靶向递送co创造了良好条件。
[0299]
测试例7ph对co释放速率的影响
[0300]
将实施例10中制备得到纳米粒b用pbs溶液稀释至50ml反应瓶中,分别在ph＝7.4和ph＝6.5，温度为37℃下，加入浓度为1mm的h2o2后检测器开始检测，每组实验重复三次，取平均值。并发现ph＝6.5时，前药的释放速率变缓，释放率略有降低。实验结果见图11。
[0301]
测试例8h2o2含量对co释放的影响
[0302]
为了考察h2o2的含量对co释放的影响，设置了将实施例10中制备得到纳米粒f
‑
3在浓度为1.0mm、500μm、300μm和100μm这几组不同浓度的h2o2进行测试，并通过一氧化碳检测器来观测其释放的变化。实验结果见图12，由图可知，发现当h2o2浓度降低到500μm甚至300μm时，释放量并没有明显下降，可能是因为此时的h2o2浓度与草酸酯聚合物a的浓度接近一个当量，仍然能够充分反应，提供足够的化学能。但是释放时间上会有所不同这可能是因为h2o2的浓度越高，反应速率越快导致的。而当h2o2浓度下降为100μm时，此时的h2o2含量相当
于1/4的草酸酯聚合物a含量，因此它们不能充分反应提供足够的化学能，导致释放降低至前几组的40％左右。
[0303]
测试例9细胞毒性实验
[0304]
取对数生长期的4t1/b16f10/hek293细胞(5
×
104个/ml)接种于96孔板，贴壁后，分为2
‑
s/p@pva组、2
‑
s/plga@pva组、p@pva组和free 2
‑
s组，将各组药液用培养基稀释为1.875、3.75、7.5、15、30、60μg/ml(以2
‑
s计，polymer的浓度为其14倍)的溶液，每个浓度设4个复孔。给药后于37℃孵育12h，弃去药液，各孔内加入150μlmtt溶液(0.5mg/ml)，37℃孵育4h后，弃去上清液，各孔加入100μl的dmso，振摇10min使蓝紫色的甲瓒结晶溶解，酶标仪测定490nm波长处的od值，计算细胞活力(细胞活力％＝od
给药组
/od
对照组
×
100％)。测试结构如图13所示，2
‑
s/p@pva纳米粒组具有明显的细胞毒性，两个对照组相对于实验组细胞毒性较小，从三个细胞系比较来看，hek293属于正常细胞，过氧化氢含量较低，对细胞的毒性也会相应减小，而对肿瘤细胞4t1和b16f10细胞，由于具有较高的过氧化氢，实验组，细胞毒性较大，因此该一氧化碳纳米粒具有很好的靶向性，对正常细胞毒性较小。
[0305]
测试例10细胞内co成像实验
[0306]
取对数生长期的4t1细胞(1
×
105个/ml)接种于24孔板，分为control组、2
‑
s/p@pva组、2
‑
s/plga@pva组、p@pva组和free 2
‑
s组，每组设3个复孔。细胞贴壁后，先给予co探针nr
‑
pda(2μm)孵育30min，pbs洗2遍，control组给予培养基，其余各组分别给予浓度为30μg/ml(以2
‑
s计，polymer的浓度为其14倍)的药液，37℃孵育1h，弃去药液，pbs洗2遍后加入hoechst染料染细胞核5min，再用pbs洗2遍，加入新鲜的pbs溶液，于激光共聚焦显微镜下观察co的生成。测试结果如图14和15所示。通过使用co探针进行细胞内的co成像检测，2
‑
s/p@pva组出现探针的红色荧光，表明co确实可以在细胞内进行释放，而对照组相对于实验组的荧光强度可以忽略不计，因此它们都不能释放co。
[0307]
测试例11细胞对纳米粒的摄取实验
[0308]
取对数生长期的4t1细胞(1
×
105个/ml)接种于6孔板，分为2
‑
s/p@pva组、2
‑
s/plga@pva组和free 2
‑
s组，每组设3个复孔。细胞贴壁后，各组分别给予浓度为30μg/ml(以2
‑
s计)的药液，37℃孵育3、6、12h，弃上清，pbs洗2遍，用0.25％的胰酶消化收集细胞，离心后加1ml pbs重悬，用细胞计数板对各孔细胞进行计数。随后，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，12000rpm离心5min后取上清，在细胞裂解液中加入dmso萃取2
‑
s，用酶标仪通过标准曲线法对摄取的2
‑
s进行定量。
[0309]
以cypate作为荧光标记物，观察细胞对纳米粒的摄取情况。首先用edc、nhs活化cypate分子的羧基，再将其通过酯化反应连接到pva上，制备cypate
‑
pva包裹的2
‑
s/p@cy
‑
pva纳米粒。取对数生长期的4t1细胞(1
×
105个/ml)接种于24孔板，细胞贴壁后，给予15μg/ml(以2
‑
s计)的2
‑
s/p@cy
‑
pva纳米粒，在给药后的3、6、12h，弃去药液，pbs洗2遍后加入hoechst染料染细胞核5min，再用pbs洗2遍，加入新鲜的pbs溶液，于荧光显微镜下观察纳米粒与细胞的共定位情况。
[0310]
以cypate作为荧光标记物，观察细胞对纳米粒的摄取情况。首先用edc、nhs活化cypate分子的羧基，再将其通过酯化反应连接到pva上，制备cypate
‑
pva包裹的2
‑
s/plga@cy
‑
pva纳米粒。取对数生长期的4t1细胞(1
×
105个/ml)接种于24孔板，细胞贴壁后，给予15μg/ml(以2
‑
s计)的和2
‑
s/plga@cy
‑
pva纳米粒，在给药后的3、6、12h，弃去药液，pbs洗2遍后
加入hoechst染料染细胞核5min，再用pbs洗2遍，加入新鲜的pbs溶液，于荧光显微镜下观察纳米粒与细胞的共定位情况。
[0311]
通过细胞摄取实验(如图16所示)，可以发现分别在3小时，6小时，12小时，2
‑
s/plga@cy
‑
pva纳米粒组和free 2
‑
s组细胞内的含量持续增加，而实验组增加不明显，这是因为实验组纳米粒2
‑
s/p@pva进入细胞后遇到过氧化氢会发生化学反应，所以尽管纳米粒被细胞不断摄取，但摄取的纳米粒在进入细胞后也在不断裂解释放co。
[0312]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。