一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法与流程

1.本发明食品安全技术领域，具体涉及一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法。


背景技术：

2.婴幼儿配方乳粉作为母乳的首要替代物，是婴幼儿重要的摄食来源，为婴幼儿健康成长和发展提供几乎全部的蛋白质、脂质、维生素、矿物质等营养物质。婴幼儿配方乳粉要求是一个无有害菌的产品，而其生产所用的原辅料容易污染细菌，其生产过程也并不是一个绝对无菌的环境。正是由于加工过程中这种非绝对无菌特点，导致婴幼儿配方乳粉可能被来源于原辅料以及生产过程中的病原菌污染，进而对婴幼儿健康产生不良影响。目前对婴幼儿配方乳粉中细菌的防控局限于对成品或原辅料、生产环境的单一检测单一防控，不能达到从根源上追溯成品中细菌来源，针对性防控的目的。
3.虽然乳制品的加工生产过程已经得到了严格的监管和控制，但仍有大量研究发现蜡样芽孢杆菌在多种乳制品中被检出，涵盖范围较广，包括原料乳、巴氏杀菌奶、乳粉、冰淇淋等。有研究发现，蜡样芽孢杆菌在美国，土耳其和巴西的乳制品中的检出率分别达到17.64％，20％和24.23％。zhou等人研究发现蜡样芽孢杆菌在巴氏杀菌牛奶中被检出，mpn平均值为11.7cfu/ml，且不同季节牛奶样品的污染率变化较大，为33.3％
‑
71.4％。cui等人对北京当地的10家奶牛牧场进行采样检测，结果显示原料乳中蜡样芽孢杆菌的检出率高达9.8％，且nhe、hbl和ces基因的检出率分别为100％、55.0％和5.0％。近年来，蜡样芽孢杆菌在婴幼儿食品中也被检出。zhang等人于2013
‑
2015年采集65个品牌共401份婴幼儿配方乳粉，蜡样芽孢杆菌的检出率为8.2％。这些研究与结果均说明蜡样芽孢杆菌是污染乳制品中的重要微生物之一，可能导致食源性疾病的爆发，特别是受该致病菌污染的婴幼儿配方乳粉会对婴幼儿的安全与健康造成严重的威胁。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了提供一种在乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法，解决有针对性防控芽胞杆菌在乳制品中的危害。
5.本发明提供了一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法，所述方法的具体步骤如下：
6.(1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中和生产接触到的物质表面的细菌进行分离；
7.(2)对分离菌株进行dna的提取；
8.(3)利用通用引物fa
‑
27f：5'
‑
agtctctgatcatgcctcag
‑
3'和ra
‑
1492r：5'
‑
aaggaggtgctccagcc
‑
3'，进行16s rrna序列的pcr扩增后鉴定蜡样芽胞杆菌；
9.(4)利用引物panc
‑
f引物为tyggttttgtyccaacratgg和panc
‑
r引物为cataatctacagtgcctttcg进行panc基因的pcr扩增后鉴定蜡样芽胞杆菌；
10.(5)进行生理生化实验分析：
11.(6)持家基因pcr扩增并对蜡样芽胞杆菌进行分型；
12.(7)利用spss软件的相关性分析完成对婴幼儿配方乳粉中蜡样芽胞杆菌的进行溯源分析。
13.进一步地限定，步骤(1)按照tianamp细菌基因组dna提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行dna的提取。
14.进一步地限定，步骤(3)中pcr扩增体系为：18μl 2
×
taq pcr mastermix，上下游引物各1μl，dna模板2μl，28μl ddh2o。
15.进一步地限定，步骤(3)中pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
16.进一步地限定，步骤(5)所述生理生化实验分析为酪蛋白分解试验、溶血试验和蛋白质毒素结晶试验。
17.进一步地限定，步骤(6)所述持家基因为glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca和tpi；所述扩增glpf基因的引物为seq id no:5和seq id no:6；所述扩增gmk基因的引物为seq id no:7和seq id no:8；所述扩增ilvd基因的引物为seq id no:9和seq id no:10；所述扩增pta基因的引物为seq id no:11和seq id no:12；所述扩增pur基因的引物为seq id no:13和seq id no:14；所述扩增pyca基因的引物为seq id no:15和seq id no:6；所述扩增tpi基因的引物为seq id no:17和seq id no:18。
18.进一步地限定，步骤(6)所述的基因分型的分析方法为：mlst数据库比对分析、蜡样芽孢杆菌的核酸多态性分析、系统发育分析和burst分析。
19.有益效果：婴幼儿配方乳粉加工环境中共分离出84株蜡样芽孢杆菌疑似菌株，通过分子生物学鉴定和生理生化试验结果将84株分离菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌。84株蜡样芽孢杆菌被分成24个st型，其中st
‑
999、st
‑
1343、st
‑
1335与st
‑
1345是婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌的优势st型。7个持家基因中ilvd基因的核苷酸多样性最高，而tpi基因的核苷酸多样性最低。系统发育树表明24个st型主要分成两大分支，其中包含多个亚分支，分离菌株与b.cereus、b.anthracis和b.thuringiensis这三个种显示了更近的系统发育关系。通过相关性分析发现，包装内包环节与st
‑
32最相关；生产环节与st
‑
1343、st
‑
1344、st
‑
1336、st
‑
1347的相关性较强；原辅料、前处理、生产内包以及包装环节与st
‑
1337、st
‑
1333、st
‑
1334及st
‑
1335有较强的相关性。24个st型中，st
‑
62、st
‑
1284、st
‑
144和st
‑
1334的芽孢耐热性较好，从整体上看不同panc群组的芽孢耐热程度不同，group iii中菌株的芽孢耐热性高于group ii和group iv。
20.通过研究婴幼儿配方乳粉加工环境中不同分子特征的蜡样芽孢杆菌的芽孢耐热性，可为减少婴幼儿配方乳粉加工环境中的蜡样芽孢杆菌污染提供一定的理论基础。
附图说明
21.图1为部分试验菌株的dna提取电泳图，其中，m代表marker dl2000；1
‑
5代表部分试验菌株基因组dna；
22.图2为部分菌株的16s rrna基因pcr结果，其中，m代表marker dl2000；1
‑
6代表部分试验菌株pcr结果；
23.图3为部分菌株的panc基因pcr结果，其中，m代表marker dl2000；1
‑
6代表部分试验菌株pcr结果；
24.图4为分离菌株的生理生化试验结果，其中，a)菌株在myp培养基上的生长情况，b)菌株在na培养基上的生长情况，c)酪蛋白水解试验，d)溶血性试验，e)蛋白质毒素结晶试验；
25.图5为7个持家基因的pcr结果，其中，m代表marker dl2000；1
‑
7代表持家基因glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca、tpi；
26.图6为婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌的st型组成；
27.图7为84株蜡样芽孢杆菌系统发育树；
28.图8为蜡样芽孢杆菌不同st型的burst分析图；
29.图9婴幼儿配方乳粉加工环境与蜡样芽孢杆菌不同st型的相关性分析。
具体实施例
30.1.本试验所用样品包括84份原辅料样品，12份空气样品，12份表面涂抹样品，均由本实验室人员于2014
‑
2015年采集自某婴幼儿配方乳粉工厂。其中，原辅料样品包括14类物质；空气样品与表面涂抹样品选取如下5个加工环节进行采集，包括前处理环节、生产环节、生产内包环节、包装内包环节和包装环节，样品采集的具体信息如表1所示。
31.表1样品信息
[0032][0033][0034]
2.本发明所用的主要试剂如表2所示。表2本试验的主要试剂
[0035][0036]
3.本发明所用的主要仪器设备如表3所示。
[0037]
表3主要仪器设备
[0038][0039]
试剂配制：（1）50
×
tae缓冲液溶液配制后于室温放置保存，稀释50倍后使用。tris
‑
cl 24.2g，na2edta
·
2h2o 37.2g，醋酸57.1ml，去离子水100ml，。
[0040]
（2）营养琼脂（na）：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉4.0g，氯化钠15.0g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml，调ph至7.3
±
0.1，121℃灭菌15min后使用。
[0041]
（3）芽孢培养基：蛋白胨3.3g，牛肉浸粉1g，氯化钠1.7g，cacl2·
2h2o 0.2g，琼脂15g，mnso4·
h2o 0.03gmgso4·
7h2o 0.51g，feso4·
h2o 0.1g，kcl 0.97g蒸馏水1000ml，蒸馏水定容至1000ml，调ph至7.3
±
0.1，121℃灭菌15min后使用。不同的蜡样芽孢杆菌群微生物分成表型特征不同的7个群组记载在marieh
é
l
è
ne guinebreti
è
re，philippe velge，olivier couvert，et al.ability of bacillus cereus group strains to cause food poisoning varies according to phylogenetic affiliation(groups i to vii)rather than species affiliation[j].journal of clinical microbiology，2010，48(9)：3388
‑
91.
[0042]
实施例1.一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法
[0043]
一、样品采集：样本采集方法记载在娄彬彬，郭鸰，周彦宏，等.婴儿配方乳粉原辅料中细菌的分离鉴定[j].中国乳品工业，2016，44(8)：9
‑
11.中，每类原辅料样品采集200g或200ml，样品采集后立即转移至低温采样箱中保存。空气样品利用放置tsa琼脂培养基的手持式空气微生物采样器对各个加工环节的空气进行采集，每个tsa培养基采集2.5min，流量为200l/min，约500l空气，结束采集后于37℃恒温培养箱中进行培养12
‑
48h。表面涂抹样品采用经无菌的磷酸盐缓冲液(pbs)润湿的无菌棉签对各个加工环节的待检区域进行涂抹采集，反复转动棉签涂抹数次。根据不同采样环节的区域和空间大小合理设定采集样品的数量，所有样品均进行平行采样。原辅料样品与表面涂抹样品采集后于4℃保存，送回实验室后尽快进行菌株的培养与分离试验。
[0044]
二、蜡样芽孢杆菌的分离：将原辅料样品与表面涂抹样品用pbs稀释数次后，取适当稀释度的样品匀液涂布于myp培养基，30℃倒置培养24
‑
48h。采集的空气样品经过tsa培养基分离纯化后得到单菌落，将菌落在lb培养基中培养8
‑
12h，生理盐水系列稀释后，将菌液涂布于myp培养基，培养条件同上。将myp培养基上能产生微粉色或白色沉淀环的淡粉红色可疑菌落划线接种于na培养基，30℃培养24h进行确证实验，菌落一般呈灰白色不透明、
表面粗糙的融蜡状。
[0045]
三、蜡样芽孢杆菌的鉴定：
[0046]
(1)16s rrna基因分析：挑取na培养基上的单菌落于lb液体培养基中37℃震荡培养8～12h，分别取2ml分离菌株的lb菌液利用细菌基因组dna提取试剂盒提取dna，具体提取操作方法参照试剂盒说明书进行。通过含溴化乙啶(eb)的1％琼脂糖凝胶对dna进行电泳检测，电压和电流分别为100v和100a，电泳时间为30～40min
[119]
。电泳结果通过凝胶成像仪观察并拍照。提取后的dna于
‑
20℃保存用于后续实验。
[0047]
采用试剂盒法提取84株分离菌株的dna，部分菌株的凝胶电泳检测结果如图1所示。dna电泳条带无杂带且清晰明亮，说明提取的dna可用于后续pcr反应。
[0048]
选取通用引物27f：5
’‑
agtctctgatcatgcctcag
‑3’
(seq id no:1)和1492r：5
’‑
aaggaggtgctccagcc
‑3’
(seq id no:2)进行16s rrna序列的扩增。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。pcr扩增体系如表4所示。反应后的pcr产物进行电泳检测，观察凝胶电泳条带的情况，电泳条件与dna电泳检测相同。pcr产物送至北京诺赛生物科技有限公司纯化后进行双向测序。
[0049]
表4pcr扩增体系
[0050][0051]
结果：利用16s rrna测序的通用引物27f和1492r对分离菌株的dna进行pcr扩增，图2为部分菌株pcr扩增结果的电泳检测图。pcr产物清晰明亮且无引物二聚体干扰，序列经剪切拼接后在ncbi上进行blast比对，经同源性分析后将84株分离菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌群微生物。
[0052]
(2)panc基因分析：根据蜡样芽孢杆菌在线分型工具
[0053]
(https://www.tools.symprevius.org/bcereus/english.php)提供的序列设计panc引物，其中panc
‑
f引物为5
’‑
tyggttttgtyccaacratgg
‑3’
(seq id no:3)，panc
‑
r引物为5
’‑
cataatctacagtgcctttcg
‑3’
(seq id no:4)，引物交由北京诺赛生物科技有限公司负责合成。pcr反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。pcr扩增体系为90μl，如表5所示。pcr产物经过电泳检测后送至北京诺赛生物科技有限公司纯化后进行双向测序。
[0054]
结果：部分pcr结果如图3所示。通过蜡样芽孢杆菌在线分组工具比对测序得到的panc基因序列，可将蜡样芽孢杆菌群微生物分成表型特征不同的七个群组(i
‑
vii)，每个群组的具体分类情况见表6。84株蜡样芽孢杆菌分离株利用该在线分组工具经过序列同源性比对，分成三个群组group ii、group iii、group iv，其中7株菌属于group ii，38株菌属于group iii，39株菌属于group iv。根据表1
‑
1可知，group ii包括b.thuringiensis ii and b.cereus ii，group iii包括b.thuringiensis iii、b.cereus iii或b.anthracis，group iv包括b.thuringiensis iv或b.cereus iv。因此，采用16s rrna序列分析和panc基因分析
可确定84株蜡样芽孢杆菌分离株可能是蜡样芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌或炭疽芽孢杆菌。
[0055]
表5 pcr扩增体系
[0056][0057][0058]
表6蜡样芽孢杆菌的panc基因分型
[0059][0060]
(3)生理生化试验
[0061]
酪蛋白分解试验和溶血试验：na培养基上的单菌落经纯化培养后，取适当稀释度的菌液涂布于酪蛋白琼脂培养基、血琼脂培养基，37℃培养24～72h，观察菌落周围水解圈产生情况。
[0062]
蛋白质毒素结晶试验：取适当稀释度的菌液涂布于硫酸锰营养琼脂培养基，30℃培养24h
±
2h，并于室温放置3～4天，挑取培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经干燥固定后，加甲醇作用30s后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满0.5％碱性复红，放火焰上加热1min，移去火焰，再次加温染色30s，倾去染液后彻底清洗、晾干后镜检。观察有无浅红色的游离芽孢和染成深红色的伴孢晶体(菱形蛋白结晶体)。
[0063]
蜡样芽孢杆菌能分解酪蛋白、有溶血性、不产生伴孢晶体，而炭疽芽孢杆菌不能分解酪蛋白、无溶血性或微弱溶血性，苏云金芽孢杆菌可产生伴孢晶体。观察分离菌株分解酪蛋白、溶血性以及伴孢晶体的产生情况，结合16s rrna基因分析和panc基因分析对分离菌株进行鉴定。
[0064]
结果：蜡样芽孢杆菌在myp培养基上能产生微粉色或白色沉淀环，结果如图4中的a)所示。挑取myp培养基上的疑似菌株接种在na培养基上进行确证实验，蜡样芽孢杆菌在na培养基上呈灰白色无光泽的扁平状菌落，边缘不整齐，表面略干燥，无根状生长现象，结果如图4中的b)所示。挑取na培养基上的单菌落进行生理生化试验，酪蛋白培养基上的菌落周围出现透明的水解圈，如图4中的c)所示，说明分离菌株具有分解酪蛋白的能力；血琼脂培养基上的菌落周围出现明显的溶血圈，如图4中的d)所示，说明分离菌株具有β
‑
溶血性；硫
酸锰营养琼脂上的菌落经过染色后，显微镜下可观察到无伴孢晶体的产生，如图4中e)所示。根据酪蛋白水解试验和溶血性试验结果排除炭疽芽孢杆菌，无伴孢晶体的产生排除苏云金芽孢杆菌。因此，16s rrna基因分析、panc基因分析结合生理生化试验结果可对蜡样芽孢杆菌群内表型特征与基因特征高度相似的这三个菌种进行区分鉴定，从而将本试验中的84株分离菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌。
[0065]
(4)生长温度实验
[0066]
将蜡样芽孢杆菌分离菌株在na培养基上划线培养24～72h，分别选取如下不同温度条件：6℃、8℃、10℃、13℃、15℃、40℃、43℃、45℃、48℃、50℃，观察并记录不同菌株在不同温度下的生长情况，确定其生长温度范围，并分析生长温度特征与蜡样芽孢杆菌的
[0067]
结果：84株蜡样芽孢杆菌分别在不同温度条件下进行培养，生长温度范围情况如表7所示。不同panc基因分型群组的菌株具有不同的生长范围，其中group ii的生长温度范围为8～43℃；group iii的生长温度范围为13～48℃，group iv的生长温度范围为10～45℃。
[0068]
表7 84株蜡样芽孢杆菌的生长温度情况
[0069][0070]
四、多位点序列分型
[0071]
1.引物的设计与合成根据蜡样芽孢杆菌mlst数据库(http://pubmlst.org/bcereus/)所提供的7对持家基因的序列设计引物，持家基因glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca和tpi的引物序列如表8所示，引物由北京诺赛生物科技有限公司合成。
[0072]
表8 mlst引物序列
[0073][0074]
2.持家基因pcr扩增及测序
[0075]
7个持家基因的pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，56
‑
59℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min，终产物4℃保存。pcr反应体系为50μl，
如表9所示。取5μl pcr产物在1％琼脂糖凝胶(含eb)上进行电泳检测，通过凝胶成像仪观察电泳结果，若出现清晰明亮的特异性条带，将产物送至北京诺赛生物科技有限公司纯化后进行双向测序。
[0076]
结果：利用特异性引物对7个持家基因(glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca、tpi)进行扩增，部分电泳结果如图5所示。电泳结果显示7个持家基因的扩增均无引物二聚体，且条带单一清晰明亮，说明分离菌株7个持家基因pcr扩增成功，且扩增条带是特异性的。
[0077]
表9 pcr扩增体系
[0078][0079]
3.mlst数据分析
[0080]
将测序后的序列利用contigexpress软件进行拼接，登录蜡样芽孢杆菌mlst数据库对每株菌的7个等位基因序列进行查询与比对，得到相应的等位基因编码，并按照glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca、tpi的排列顺序确定菌株的序列型。若所得的等位基因序列或等位基因图谱在mlst数据库中经过比对后未发现完全匹配的等位基因编码或序列型，则向网站管理者提交序列并获得新的等位基因编码或序列型。
[0081]
结果：将测序所得的84株蜡样芽孢杆菌的7个持家基因的序列拼接校正后在mlst数据库中进行比对，可以得到这些菌株的等位基因编码，其中发现了3个新的等位基因pur
‑
242、pyc
‑
198和ilv
‑
276。根据7个持家基因的等位基因编码进而确定菌株的序列型，84株蜡样芽孢杆菌分离菌株被分成如下24个st型：st
‑
24、st
‑
26、st
‑
32、st
‑
62、st
‑
144、st
‑
374、st
‑
999、st
‑
1119、st
‑
1243、st
‑
1284、st
‑
1333、st
‑
1334、st
‑
1335、st
‑
1336、st
‑
1337、st
‑
1338、st
‑
1339、st
‑
1340、st
‑
1341、st
‑
1342、st
‑
1343、st
‑
1344、st
‑
1345和st
‑
1347，其中14个st型是首次发现，经网站管理者确认为新的st型，分别是st
‑
1333至st
‑
1345以及st
‑
1347，数据库中相对应的id为2093
‑
2015和2110，具体结果如表10所示。
[0082]
表10 84株蜡样芽孢杆菌mlst信息表
[0083]
[0084][0085]
通过表10和图6可以得出：在24个st型中，st
‑
999的菌株为19株，占总数的22.62％；st
‑
1343的菌株为13株，占总数的15.48％；st
‑
1335与st
‑
1345的菌株均为6株，各占总数的7.14％，之后为st
‑
1344(5株，5.95％)、st
‑
32(5株，5.95％)、st
‑
1333(5株，5.95％)、st
‑
1119(3株，3.57％)；6个st型均有两株菌，包括st
‑
24、st
‑
26、st
‑
144、st
‑
1337、st
‑
1339、st
‑
1347；其余10个st型均只有1株菌，分别为st
‑
62、st
‑
374、st
‑
1284、st
‑
1334、st
‑
1336、st
‑
1243、st
‑
1338、st
‑
1340、st
‑
1341、st
‑
1342。可见该婴幼儿配方乳粉加工环境中的优势st型为st
‑
999，st
‑
1343，st
‑
1335与st
‑
1345。
[0086]
(1)蜡样芽孢杆菌的核酸多态性分析：利用mega 7.0与dnasp 5.0软件对蜡样芽孢杆菌分离菌株的7个持家基因进行核酸多态性分析，包括多态性位点数量、核苷酸多样性指数(π)、tajima’s d值、非同义替换与同义替换比值(ks/ka)和gc％含量等。
[0087]
结果：分析84株蜡样芽孢杆菌分离菌株的基因序列，可发现7个持家基因的等位基因数量为8～16，其中持家基因glpf的等位基因数量最多，为16个；其次是pur，为15个；gmk的等位基因数量最少，为8个。利用dnasp 5.0与mega 7.0软件，对测序所得的7个持家基因的序列进行生物信息学分析，包括多态性位点数量、ks/ka、核苷酸多样性指数(π)、tajima’s d值和gc％含量，具体结果如表11所示。
[0088]
表11 84株蜡样芽孢杆菌7个持家基因的多态性分析
[0089][0090]
由表11分析可得，7个持家基因的gc％含量的范围为38.2％～44.7％，平均gc％含量为41％，高于genbank数据库中蜡样芽孢杆菌全基因组序列的平均gc％含量(35％)。持家基因(glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca、tpi)的多态位点数量分别为33、35、39、27、53、44和21，其中多态位点数量较高的基因为pur和pyca，多态位点数量较低的基因为pta和tpi。核苷酸多样性指数π为0.01439(tpi)至0.07258(ilvd)，表明ilvd基因的核苷酸多样性最高，而tpi基因的核苷酸多样性最低。7个持家基因的ka/ks的范围从0.0086(pur)到0.1193(tpi)，均小于1，表明蜡样芽孢杆菌的持家基因序列很少发生非同义替换，较为保守和稳定。同时，7个持家基因tajima’s d值为
‑
1.4997(glpf)到
‑
0.7908(tpi)。
[0091]
(2)系统发育分析：将蜡样芽孢杆菌的七个持家基因序列进行拼接得到长度为2829bp的基因序列，利用mega 7.0软件分析蜡样芽孢杆菌分离菌株之间的系统发育关系，采用最大似然算法，程序重复1000次，构建系统发育树，并选择b.cereus atcc 14579，b.thuringiensis atcc 10792，b.anthracis atcc 14578，b.weihenstephanensis dsm 11821，b.mycoides atcc 6462，b.pseudomycoides dsm 12442，b.cytotoxicus nvh 391
‑
98，b.gaemokensis bl3
‑
6，b.manliponensis bl4
‑
6，b.bingmayongensis fjat
‑
13831，b.toyonensis bct
‑
7112作为参考菌株。
[0092]
结果：84株蜡样芽孢杆菌基于7个持家基因拼接的全长为2829bp的最大似然系统发育树如图7所示。该系统发育树显示了蜡样芽孢杆菌分离菌株清晰的系统发育关系，24个st型和蜡样芽孢杆菌群中的11个种都相互保持了一定的距离，而在这11个种中，24个st型和b.cereus、b.anthracis和b.thuringiensis这三个种显示了更近的系统发育关系，同蜡样芽孢杆菌群中的另外8个种的亲缘关系较远。st
‑
24、st
‑
999和b.cereus atcc 14579(st921)的系统发育关系更近，而根据蜡样芽孢杆菌mlst数据库的比对，这些系统发育关系较近的st型的基因序列仅存在几个碱基的差异。由于mlst分型结果可以反应蜡样芽孢杆菌在基因水平的分子特征，因此菌株st
‑
24、st
‑
999和st921在基因组层面可能具有相近的系统发育关系与进化关系。新发现的st
‑
1340、st
‑
1334、st
‑
1347、st
‑
1343和st
‑
1344系统发育关系较近，且这些st型的菌株主要分离自生产环节与生产内包环节，表明这两个加工环节的st型在进化上的亲缘关系较近，在实际的加工环境中可能存在不同环节交叉污染的风险。
[0093]
菌株的st型相对应的panc基因分组编号如表3
‑
2右侧所示，同一st型的蜡样芽孢杆菌具有相同的panc基因分组。由图7可知，st
‑
1342与st
‑
1345具有相同的分组(group ii)，st
‑
1119、st
‑
62、st
‑
1284、st
‑
374、st
‑
26、st
‑
32、st
‑
144、st
‑
1338、st
‑
1340、st
‑
1334、st
‑
1347、st
‑
1343、st
‑
1344具有相同的分组(group iii)；st
‑
1341、st
‑
1336、st
‑
1337、st
‑
1339、st
‑
1243、st
‑
1333、st
‑
1335、st
‑
24、st
‑
999具有相同的分组(group iv)，由系统发育树分析可知属于相同panc基因分组的st型的亲缘关系更近，说明蜡样芽孢杆菌panc基因分
析与mlst分型之间存在一定的联系。
[0094]
(3)burst分析：利用burst在线工具(n＝4)将不同的st型分成不同的集群(group)与独体(singleton)，集群中若包含核心st型则可构成克隆复合体(clonal complex，cc)，以此分析婴幼儿配方乳粉加工环境中蜡样芽孢杆菌分离株的种群结构与进化关系。
[0095]
结果：利用burst在线工具计算不同st型的单变异位点数(slv)和双变异位点数(dlv)从而对菌株的亲缘关系进行分析，将不同st型的蜡样芽孢杆菌划分成不同的集群与独体。本研究通过burst(n＝4)工具将24个st型划分成4个集群和5个独体，4个集群中有一个是克隆复合体(clone complex，cc)。该克隆复合体包含9个st型，其中slv数量最多的st
‑
1343为该克隆复合体的核心st型，表明该克隆复合体中的其他st型是基于核心st
‑
1343发生进化变异，结果见表12与图8。
[0096]
表12蜡样芽孢杆菌不同st型的burst分析
[0097][0098]
注：*表示该克隆复合体的核心st型
[0099]
五、蜡样芽孢杆菌的溯源分析：利用spss软件，以分离自婴幼儿配方乳粉加工环境的蜡样芽孢杆菌的序列型和加工过程中的不同环节(前处理环节、生产环节、生产内包环节、包装内包环节和包装环节以及原辅料)为变量进行相关性分析，确定各个加工环节相关性最大的st型，进而分析婴幼儿配方乳粉各加工环节与不同st型的蜡样芽孢杆菌的联系。
[0100]
芽孢悬液的制备：取100μl不同st型菌株的lb菌液分别均匀地涂布于含有少量硫酸锰的芽孢培养基，37℃培养3～7天，正常营养细胞在这种营养相对匮乏且含有mn
2
的条件下可以转变为芽孢。取培养基上的少量菌体进行结晶紫染色，显微镜下观察若产生芽孢的菌体较少，则在37℃条件下继续培养；若超过90％的菌体产生芽孢，则用10ml生理盐水和无菌的涂布棒刮洗培养基表面，将芽孢和生理盐水转移至15ml离心管中。芽孢悬液在4℃低温条件下8000
×
g离心10min，去除上清液后加入10ml的生理盐水，震荡均匀后离心，再去除上清液，此离心洗涤过程重复三次，最终将芽孢重悬于10ml生理盐水中。离心洗涤后的芽孢悬液4℃保存20～40天，使获取的芽孢完全成熟。
[0101]
结果：利用spss软件的相关性分析，得到加工环境中不同环节与蜡样芽孢杆菌不同st型的联系，结果如图9所示。包装内包环节与st
‑
32最相关；生产环节与st
‑
1343、st
‑
1344、st
‑
1336、st
‑
1347的相关性较强；原辅料、前处理、生产内包以及包装环节与st
‑
1337、st
‑
1333、st
‑
1334、st
‑
1335有较强的相关性，其中st
‑
1334出现在原辅料中，st
‑
1337出现在原辅料和生产内包环节，st
‑
1333与st
‑
1335出现在前处理、生产内包与包装环节，表明这4个st型在原辅料、前处理、生产内包和包装环节中可能存在交叉污染的风险。