一种cAMP荧光探针G-Flamp1的应用的制作方法

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技术实现要素：

13.为了解决上述

背景技术：
中所提出的技术问题，本发明的目的是提供一种camp荧光探针g-flamp1的应用。
14.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
15.本发明一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在单光子成像中的应用，所述g-flamp1的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述单光子的激发波长为430-470nm。
16.进一步地，所述单光子的激发波长为430-450nm；优选地，所述单光子的激发波长为450nm。
17.本发明另一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在双光子成像中的应用，所述g-flamp1的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述双光子的激发波长为880-920nm。
18.进一步地，所述双光子的激发波长为900-920nm；优选地，所述双光子的激发波长为900nm、920nm。
19.本发明另一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在camp信号检测中的应用，所述信号检测中所采用的单光子的激发波长为430-470nm；双光子的激发波长为880-920nm。
20.本发明再一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在活细胞内camp信号检测中的应用，所述信号检测中所采用的单光子的激发波长为430-470nm；双光子的激发波长为880-920nm。
21.本发明再一个方面提供了一种活细胞中camp荧光成像检测方法，包括以下步骤：
22.1)将camp荧光探针g-flamp1表达在哺乳动物细胞中；
23.2)利用荧光显微镜或者双光子显微镜进行成像分析，检测探针荧光的强度变化，所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm；
24.优选地，包括以下步骤：1)将camp荧光探针g-flamp1表达在哺乳动物细胞中；
25.2)刺激哺乳动物细胞升高或者降低其胞内camp浓度；
26.3)利用荧光显微镜或者双光子显微镜进行成像分析，检测上述刺激前后探针荧光
的强度变化，所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm。
27.本发明再一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在活体脑片内camp信号检测中的应用，所述信号检测中所采用的单光子的激发波长为430-470nm；双光子的激发波长为880-920nm。
28.本发明再一个方面提供了一种活体脑片中camp荧光成像检测方法，包括以下步骤：
29.1)在哺乳动物的脑区注射含g-flamp1探针基因的病毒载体；
30.2)待g-flamp1探针在脑区神经元中表达后，制备活体脑片；
31.3)利用荧光显微镜、双光子荧光显微镜或者显微内镜进行成像分析，所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm；
32.优选地，包括以下步骤：1)在哺乳动物的脑区注射含g-flamp1探针基因的病毒载体；
33.2)待g-flamp1探针在脑区神经元中表达后，制备活体脑片；
34.3)刺激哺乳动物脑区中的神经元升高或者降低其胞内camp浓度；
35.4)利用荧光显微镜、双光子荧光显微镜或者显微内镜进行成像分析；所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm。
36.本发明再一个方面提供了一种camp荧光探针g-flamp1在活动物体内camp信号检测中的应用，所述信号检测中所采用的单光子的激发波长为430-470nm；双光子的激发波长为880-920nm。
37.本发明再一个方面提供了一种活动物体中camp荧光成像检测方法，包括以下步骤：
38.1)在哺乳动物的目标组织器官注射含g-flamp1探针基因的病毒载体；
39.2)利用荧光显微镜、双光子荧光显微镜或者显微内镜进行成像分析，所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm；
40.优选地，包括以下步骤：1)在哺乳动物的目标组织器官注射含g-flamp1探针基因的病毒载体；
41.2)刺激哺乳动物目标组织器官中的细胞升高或者降低其胞内camp浓度；
42.3)利用荧光显微镜、双光子荧光显微镜或者显微内镜进行成像分析；所述成像分析中所采用的单光子的激发波长为430-470nm，双光子的激发波长为880-920nm。
43.本领域公知荧光激发波长通常根据这种荧光素的激发谱线来确定，一般都取峰值，本发明所采用的g-flamp1探针的激发光谱的峰值大约在495nm，因此现有申请cn201911251920.x中采用了激发波长～480nm的单光子，37℃生理温度培养细胞中camp动态范围(δf/f0)为2.2，本技术通过采用激发波长为430-470nm的单光子或者激发波长为880nm-920nm的双光子，37℃生理温度培养细胞中camp动态范围(δf/f0)为～10-15，取得了预料不到的技术效果，具备创造性。
44.本发明的有益效果是：相较于目前已有荧光探针的动态范围，本发明在37℃生理温度培养细胞中，采用430-470nm单光子或880-920nm双光子激发g-flamp1探针，获得了目前最大动态范围(δf/f0～10-15，比δf/f0～2.2明显高)，在检测灵敏度方面有了很大提
高；在活体脑片神经元中，在60μm forskolin刺激下，δf/f0平均值也达到了7，可以在神经元中很好的表达和响应；实际使用时，将g-flamp1表达在离体培养的哺乳动物细胞或活体细胞中，利用普通的荧光显微镜或者双光子显微镜，即可检测细胞受特定刺激后camp浓度是否发生改变。
附图说明
45.图1为本发明实施例1中#252的氨基酸序列及g-flamp1序列。
46.图2为本发明实施例2中纯化g-flamp1探针的激发和发射光谱，从细菌中纯化的g-flamp1探针稀释在ph 7.3的hepes溶液中，终浓度为2μm，图示探针在hepes溶液及饱和浓度camp中的荧光激发光谱，虚线为激发光谱，实线为发射光谱，500μm camp(粗线)：探针溶液中含camp，hepes缓冲液(细线)：探针在不含camp的hepes缓冲液中。
47.图3(a)为本发明实施例3中纯化g-flamp1探针在不同激发波长的单光子激发下的动态范围测定，图3(b)为本发明实施例3中纯化g-flamp1探针在不同激发波长的双光子激发下的动态范围测定，从细菌中纯化的g-flamp1探针稀释在ph 7.3的hepes溶液中，终浓度为2μm，图示探针在饱和浓度camp情况下及不含camp情况下的荧光激发光谱比值，f，f0分别为探针在饱和浓度camp(500μm)存在时及无camp时的荧光强度。
48.图4为本发明实施例4中纯化g-flamp1探针在不同camp浓度下的归一化的信号变化幅度测定，左图为480nm波长激发下的测试图，右图为450nm波长激发下的测试图。
49.图5为本发明实施例5中不同探针在hek293t细胞中荧光亮度比较图。
50.图6为本发明实施例6中单光子激发下，不同探针在hek293t细胞中的响应；(a)利用lipofectamine分别转染hek293t细胞含campr、flamindo2、r-flinca、pink-flamindo探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的dmem细胞培养液饥饿6小时后，用60μm forskolin(fsk)刺激后荧光亮度变化；(b)g-flamp1探针的响应；g-flamp1激发波长为440
±
10nm，荧光接收波长为530
±
15nm，campr及flamindo2激发波长为480
±
15nm，荧光接收波长为530
±
15nm，r-flinca及pink-flamindo激发波长为568
±
10nm，荧光接收波长为630
±
25nm；曲线数据表示：平均值
±
标准差；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
51.图7为本发明实施例7中920nm双光子激发下，g-flamp1探针在hek293t细胞中的响应；利用lipofectamine转染hek293t细胞含g-flamp1探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的dmem细胞培养液饥饿6小时后，用60μm forskolin(fsk)刺激后荧光亮度变化；双光子激发波长为920nm；不同曲线代表不同细胞的荧光响应；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
52.图8为本发明实施例8中900nm双光子激发下，g-flamp1探针在hek293t细胞中的响应；利用lipofectamine转染hek293t细胞含g-flamp1探针的质粒，过夜培养后，用不含酚红及血清的dmem细胞培养液饥饿6小时后，用60μm forskolin(fsk)刺激后荧光亮度变化；双光子激发波长为900nm；不同曲线代表不同细胞的荧光响应；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
53.图9为本发明实施例9中活体脑片神经元的双光子荧光成像结果图，(a)为脑片神经元受fsk刺激前后细胞的荧光亮度图，标尺：50微米；(b)为(a)中代表性神经元胞体的荧光强度变化(δf/f0)曲线，δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值，不同灰色曲线来
自不同细胞，黑色曲线为灰色曲线的平均值。
具体实施方式
54.为了更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
55.实施例1#252的氨基酸序列及g-flamp1序列
56.#252(氨基酸序列如seq id no：2所示)的若干氨基酸进行突变，即得到g-flamp1探针(氨基酸序列如seq id no：1所示)，#252及g-flamp1的氨基酸序列如图1所示。
57.下划线氨基酸分别为前后连接肽的组分。wg与rv之间是环化重排的绿色荧光蛋白序列(加粗部分)。wg之前为micnbd的n端序列，rv之后为micnbd的c端序列。加粗并倾斜的氨基酸为突变的氨基酸。
58.实施例2纯化g-flamp1探针的激发和发射光谱
59.将g-flamp1探针表达在细菌中，室温培养2天收集菌体，在ph＝7.3的hepes缓冲液(含150mm kcl及50mm hepes)中超声破碎，利用hispur cobalt resin(购自皮尔斯公司)纯化探针，并通过econo-pac 10dg脱盐柱(购自美国bio-rad公司)将探针溶解在ph＝7.3的hepes缓冲液中，用bca试剂盒(购自美国thermo scientific公司)测定探针浓度。在含120μl 2μm探针溶液的96孔板的2个孔中，分别加入2μl hepes缓冲液和2μl 30mm camp溶液(终浓度为500μm)，然后利用多功能酶标仪infinite m1000 pro检测探针激发和发射光谱，如图2所示。在饱和浓度camp(500μm)存在情况下，纯化g-flamp1探针的激发和发射光谱最大峰对应的波长分别是495nm和515nm；在不含camp的hepes缓冲液中，纯化g-flamp1探针的激发和发射光谱最大峰对应的波长分别是502nm和517nm。通过比较荧光发射谱峰值大小(探针在hepes溶液中峰值为0.106，在饱和camp浓度下为1)，可见在饱和浓度camp(500μm)存在情况下，比在hepes缓冲液中，探针荧光亮度增加了8.4倍。
60.实施例3纯化g-flamp1探针在不同激发波长的单光子和双光子激发下的动态范围测定
61.将g-flamp1探针表达在细菌中，室温培养2天收集菌体，在ph＝7.3的hepes缓冲液(含150mm kcl及50mm hepes)中超声破碎，利用hispur cobalt resin(购自皮尔斯公司)纯化探针，并通过econo-pac 10dg脱盐柱(购自美国bio-rad公司)将探针溶解在ph＝7.3的hepes缓冲液中，用bca试剂盒(购自美国thermo scientific公司)测定探针浓度。在含120μl 2μm探针溶液的96孔板的2个孔中，分别加入2μl hepes缓冲液和2μl 30mm camp溶液(终浓度为500μm)，在单光子及双光子激发下，含饱和camp浓度的探针与不含camp的探针的荧光亮度比值如图3所示，可见最大动态范围分别在450nm及900nm附近。
62.实施例4探针对camp的亲和力
63.取实施例3中纯化探针(2μm浓度)分别与不同浓度camp混合，得到剂量-反应曲线。如图4所示，在480nm及450nm激发下，其对camp亲和力均约为2.3μm，满足大部分的应用需求。
64.实施例5不同探针在hek293t细胞中荧光亮度比较
65.钙离子探针gcamp6s为经典的基因编码探针，广泛用于活细胞和活体成像，其荧光亮度可以作为该类基因编码探针的参考。将几种基因编码的探针，如钙离子探针gcamp6s，
camp探针campr/flamindo2/g-flamp1等分别构建到真核表达载体上(cag启动子)，通过lipofectamine 2000试剂盒转染培养在玻璃底的培养皿中的hek293t细胞(购买自ge healthcare dharmacon公司)。37℃培养48小时后，收集细胞悬液至成像缓冲液中，利用酶标仪检测钙离子探针gcamp6s，camp探针campr/flamindo2/g-flamp1在480nm激发下荧光强度以及g-flamp1探针在450nm激发下荧光强度，检测结果如图5所示，钙离子探针gcamp6s，camp探针campr/flamindo2/g-flamp1在480nm激发下相对荧光强度分别是1、0.33、0.28、0.47，g-flamp1高于campr/flamindo2探针，为广泛使用的gcamp6s的44％。g-flamp1探针在450nm激发下相对荧光强度为0.22，其荧光亮度与其他绿色camp探针相当。
66.实施例6单光子激发下，不同探针在hek293t细胞中的响应
67.将campr、flamindo2、g-flamp1、pink-flamindo及r-flinca等探针分别构建到真核表达载体上(cag启动子)，通过lipofectamine 2000试剂盒转染培养在玻璃底的培养皿中的hek293t细胞(购买自ge healthcare dharmacon公司)，过夜培养后，用不含血清的、不含酚红的培养基(购自gibco公司)饥饿细胞6小时。利用本实验室自行搭建的ix83荧光显微镜检测探针的亮度，g-flamp1激发波长为440
±
10nm，荧光接收波长为530
±
15nm，campr及flamindo2激发波长为480
±
15nm，荧光接收波长为530
±
15nm，r-flinca及pink-flamindo激发波长为568
±
10nm，荧光接收波长为630
±
25nm，可见细胞受60μm forskolin(购自碧云天生物技术公司)刺激后，各探针的信号变化幅度(δf/f0)，如图6所示。至此完成了哺乳动物细胞内camp浓度变化的荧光成像步骤。图6中的曲线数据表示：平均值
±
标准差；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。从图6(a)中可以看出campr的信号变化幅度为～0.45、flamindo2的信号变化幅度为～-0.26、pink-flamindo的信号变化幅度为～0.89、r-flinca的信号变化幅度为～1.28，从图6(b)中可以看出g-flamp1的信号变化幅度为～10。经对比可知，可见细胞受60μm forskolin(购自碧云天生物技术公司)刺激后，g-flamp1具最大的信号变化幅度(δf/f0)，在动态范围和灵敏度方面有了很大的提高。
68.实施例7 920nm双光子激发下，g-flamp1探针在hek293t细胞中的响应
69.将g-flamp1探针构建到真核表达载体上(cag启动子)，通过lipofectamine 2000试剂盒转染培养在玻璃底的培养皿中的hek293t细胞(购买自ge healthcare dharmacon公司)，过夜培养后，用不含血清的、不含酚红的培养基(购自gibco公司)饥饿细胞6小时。采用商业化双光子显微镜进行成像分析，双光子激发波长为920nm，可见细胞受60μm forskolin(购自碧云天生物技术公司)刺激后，不同细胞中g-flamp1荧光强度的变化，如图7所示。可见细胞受60μm forskolin(购自碧云天生物技术公司)刺激后，不同细胞中g-flamp1荧光强度展示了不同的变化，其δf/f0平均值为10(目前最高为2.2)。其中，不同曲线代表不同细胞的荧光响应；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
70.实施例8 900nm双光子激发下，g-flamp1探针在hek293t细胞中的响应
71.操作方法同实施例7，仅改变激发波长为900nm，实验结果如图8所示，由图可知，不同细胞中g-flamp1荧光强度展示了不同的变化，其δf/f0平均值为14(目前最高为2.2)。其中，不同曲线代表不同细胞的荧光响应；δf/f0为荧光强度变化量与初始荧光强度比值。
72.实施例9脑片神经元的双光子荧光成像
73.将含g-flamp1基因的aav病毒注射到小鼠纹状体神经元区域。4周后，将小鼠麻醉，制备活体脑片(300微米厚度)。脑片在33摄氏度的人工脑脊液中孵育20-30分钟，然后在室
温孵育20-30分钟。最后利用双光子荧光显微镜系统，在25倍水镜及920nm激发线下，监测纹状体神经元在60μm forskolin刺激前后的荧光信号改变。结果如图9所示，图(a)中展示了fsk刺激前后细胞的荧光亮度，标尺：50微米，从图中可以看出fsk刺激后细胞的荧光亮度显著增强。(b)为(a)中代表性神经元胞体的荧光强度变化(δf/f0)曲线，不同灰色曲线来自不同细胞，黑色曲线为灰色曲线的平均值，从图中可以看出，δf/f0平均值达到了7，可以在神经元中很好的表达和响应。
74.实施例10活体检测
75.在小鼠感兴趣脑区注射含探针基因的病毒载体；3-4周后，刺激小鼠脑区皮质神经元升高或者降低其胞内camp浓度，并利用双光子荧光显微镜或者显微内镜进行成像分析。对于组织浅层细胞，也可通过单光子荧光显微镜检测探针的信号变化。
76.综上，在37℃生理温度培养细胞中，采用430-470nm单光子或880-920nm双光子激发g-flamp1探针，具最大的动态范围(δf/f0～10-15)，动态范围的增大可以提高检测灵敏度；在活体脑片神经元中，在60μm forskolin刺激下，δf/f0平均值也达到了7，可以在神经元中很好的表达和响应；实际使用时，将g-flamp1表达在离体培养的哺乳动物细胞或活体细胞中，利用普通的荧光显微镜或者双光子显微镜，即可检测细胞受特定刺激后camp浓度是否发生改变。
77.以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。