一种缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法及应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法及应用。


背景技术：

2.褪黑素(n
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乙酰
‑5‑
甲氧基色胺)是由松果体分泌的神经激素，具有多种生物学功能，如调节昼夜节律、抑制肿瘤生长、免疫调节和抗氧化等。褪黑素作为一种重要的内源性抗氧化剂，不仅能清除自由基，还能增加体内多种细胞内抗氧化酶的表达。已有研究证实褪黑素可以保护关节软骨和软骨下骨免受炎性细胞因子、细胞凋亡和氧化应激的影响。
3.丝素蛋白是一种天然高分子纤维蛋白，主要可从蚕丝中获取。由于其自身的良好的生物相容性，数十年间被大量应用于医药卫生领域。同时，经纯化得到的丝素蛋白具有强大的机械性能，可以作为骨与软骨组织工程的潜在修复材料，具有长远的临床转化价值。
4.β折叠反应是丝素蛋白内部的分子由无序转为有序的关键步骤，通过完成β折叠，丝素蛋白溶液能实现由液态转为固态的过程。然而，丝素蛋白自发的β折叠进展缓慢，难以完成短期的快速成型。此外，自发形成的支架力学性能往往难以满足临床需求。因而，提高β折叠的效率同时保证良好的机械性能对提高丝素蛋白支架的应用至关重要。
5.随着临床实际的需求逐步精准化、高效化，单纯的丝素支架难以提供有效的修复效果。越来越多的研究提示，在优化丝素支架力学性能的同时，赋予支架自身良好的载药性能变得愈发重要。但是，现有的技术常引入大量有机材料帮助提高力学强度和药物的控缓释作用。过多引入的基团不仅增加了支架制备的工序，同时带来了潜在的体内降解风险。因此，亟需更为有效、简便的方式，对丝素蛋白支架进行改性，实现其高效的载药性能，增加临床应用的前景。
6.基于当前丝素蛋白支架的不足，本发明创新性提出一种载褪黑素型丝素蛋白复合支架的制备方法并应用在骨软骨修复领域，初步证实了该支架具有良好的生物相容性和力学强度，以及体外长期的缓释褪黑素作用，在修复骨软骨缺损方面具有应用价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法及应用。
8.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1）取蚕丝8g，加入去离子水3l，100℃煮沸2h；步骤2）搓丝，更换6次去离子水，去除胶质，置于干燥箱过夜；步骤3）将丝素蛋白溶于溴化锂溶液，60℃油浴反应4h；步骤4）使用透析袋充分透析；
步骤5）将透析结束后的溶液加入含褪黑素的乙醇溶液，
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80℃冷却过夜，随后置于
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4℃低温冰盐浴3天，得到前体支架；步骤6）将前体支架置于gelma溶液中，浸泡完全后使用405nm波长的紫外光固化15s，得到丝素蛋白复合支架。
9.进一步的，在所述步骤4）中，采用14000mw的透析袋充分透析5日，并每天更换透析液。
10.进一步的，所述步骤5）中，透析结束后的溶液与含褪黑素的乙醇溶液的比例为20:1。
11.进一步的，将所述步骤4）中透析结束后的丝素蛋白溶液加入到具有一定直径和高度的柱状模具中，之后再进行步骤5）和步骤6），以得到支架形态完整、结构稳定的丝素蛋白复合支架。
12.进一步的，所述的缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法制备得到的丝素蛋白复合支架在骨软骨修复中的应用。
13.本发明的有益效果是:（1）本发明制备得到的丝素蛋白复合支架具有良好的力学性能。
14.（2）本发明制备得到的丝素蛋白复合支架具有稳定的生物相容性。
15.（3）本发明制备得到的丝素蛋白复合支架具有体外药物（褪黑素）的长效释放能力。
16.（4）本发明制备得到的支架应用在体内骨软骨缺损修复方面具有良好的效果。
附图说明
17.图1为本发明复合支架的微观结构图；图2为本发明复合支架的力学性能示意图；图3为本发明复合支架的生物相容性示意图；图4为本发明复合支架体外药物释放检测图；图5为本发明复合支架应用到兔软骨缺损的修复对比图。
具体实施方式
18.下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
19.参照图1所示，一种缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1）取蚕丝8g，加入去离子水3l，100℃煮沸2h；步骤2）搓丝，更换6次去离子水，去除胶质，置于干燥箱过夜；步骤3）将丝素蛋白溶于溴化锂溶液，60℃油浴反应4h；步骤4）使用透析袋充分透析；步骤5）将透析结束后的溶液加入含褪黑素的乙醇溶液，
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80℃冷却过夜，随后置于
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4℃低温冰盐浴3天，得到前体支架；步骤6）将前体支架置于gelma溶液中，浸泡完全后使用405nm波长的紫外光固化15s，得到丝素蛋白复合支架。
20.在所述步骤4）中，采用14000mw的透析袋充分透析5日，并每天更换透析液。
21.所述步骤5）中，透析结束后的溶液与含褪黑素的乙醇溶液的比例为20:1。
22.将所述步骤4）中透析结束后的丝素蛋白溶液加入到具有一定直径和高度的柱状模具中，之后再进行步骤5）和步骤6），以得到支架形态完整、结构稳定的丝素蛋白复合支架。
23.材料学学表征：在本实施例中，以大体形态学观察复合支架的大小及形态；具体方法是在直径4mm
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高度3mm的柱状模具中加入丝素蛋白溶液，后经乙醇反应、两步冷却后、gelma修饰后得到特定结构的复合支架，如图1所示；结果显示，制备得到的支架形态完整，结构稳定；使用sem检测复合支架的微观形态；具体方法是将制备好的支架进行脱水，临界点干燥，而后冷冻脆断，取其截面置于载物台上，使用等离子溅射仪喷金45s，置于sem下进行检测；使用力学检测设备测定支架的力学性能；具体方法是使用最大加载单元为200n的圆柱形压头，随时间监测压缩力，记录支架厚度的变化，压缩力与横截面积之比除以形变量，计算出杨氏模量，如图2所示。
24.体外生物相容性和释放曲线测定：在本实施例中，使用兔软骨细胞，采用cck
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8细胞增殖技术检测不同时间点复合支架对软骨细胞增殖能力的影响；具体方法是将细胞接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、1%双抗的dmem/f12培养基培养；待扩增至p1代时，使用0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min并计数细胞量，按1000/cm2接种于96孔板，对照组为普通培养基，实验组为支架 培养基，每组6孔；采用完全培养基于37℃，5%co2中培养1周；每3天更换一次培养基，于第1、3、5、7天分别加入含10�k
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8试剂的无血清dmem/f12溶液，置于37℃，5%co2培养箱中避光孵育1h；结束孵育后，使用分光光度计在450nm处检测各组的吸光度值（od），如图3所示；结果显示，对照组和实验组细胞增殖速率无明显差异，说明复合支架不改变细胞的增殖能力；检测不同时间点支架内药物的释放效率；具体方法是将复合支架置于6孔板中，加入1mlpbs溶液，每日吸取并更换pbs，使用nanodrop2000在280nm处检测药物（褪黑素）的浓度，根据累计释放量绘制药物释放曲线，如图4所示；结果显示，复合支架在4周内均具备缓释释放作用。
25.所述的缓释褪黑素的丝素蛋白复合支架材料制备方法制备得到的丝素蛋白复合支架在骨软骨修复中的应用。
26.如图5所示，将丝素蛋白复合支架植入兔软骨缺损部位，6周后取材观察，实验结果表明，丝素蛋白复合支架组修复效果远好于对照组，提示了该载褪黑素型复合丝素蛋白支架可以作为一种高效的药物递送系统，为骨软骨缺损的临床治疗提供了新的参考。
27.本发明初步证实了该丝素蛋白复合支架具有良好的生物相容性和力学强度，以及体外长期的缓释褪黑素作用，具备临床转化前景，为骨软骨缺损的临床治疗提供了新选择。
28.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。