一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的检测方法。


背景技术：

2.近年来，随着化石燃料的温室气体排放，人们对植物秸秆作为乙醇来源的重视度越来越高。以木质纤维素生物质为原料生产的乙醇被称为第二代乙醇。第二代乙醇生产的主要障碍之一是难以分解的木质纤维素材料。例如，小麦秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，要想分离它们，首先，必须对这种材料进行预处理以提取除去木质素，然后，纤维素被水解以释放葡萄糖，而葡萄糖随后被发酵并转化为乙醇，因此确定秸秆中木质素单体交联结构的组成和含量尤为重要。
3.木质素是一种复杂的酚类生物聚合物，很难被分解。木质素的生物合成主要基于由苯丙醇衍生的三种羟基苯丙烷类单体的自由基偶联(对羟基苯基木质素(h)，愈创木基木质素(g)和丁香基木质素(s))，通过一系列胞外酶(过氧化物酶和漆酶)介导的氧化反应。
4.木质素单体交联结构中8
‑
o
‑
4连接是最常见的，也比其他化学连接更容易断裂。木质素单体的相对比例决定了单元间连接的相对丰度。例如，富含g单元的木质素含有较多的难以分解8
‑
5、5
‑
5和5
‑
o
‑
4键，而富含s单元的木质素交联度较低，提取的难度较小。因此，木质素的组成通常用h、g和s单位的相对丰度和比率来描述。由于小麦茎秆制备乙醇的可提取性和可消化性不仅受木质素量的影响，而且还受其单体组成和单体在植物细胞壁中的排列方式的影响，因此当研究如何用小麦茎秆制备乙醇时，确定这些信息就显得尤为重要。
5.木质素含量通常通过常规重量法测量，最常见的是酸分解法(基于细胞壁材料的分离)以及分光光度法，如溴乙酰法和巯基乙酸法，它们降解细胞壁和木质素并测定可溶性降解产物。然而，测定同一样品中木质素的方法导致对木质素浓度的不同估计。这些方法还包含在细胞壁中的不溶性木质素的含量，还可能包括了木质素多聚体的结构，结果很不准确。


技术实现要素：

6.基于现有技术中的问题，本发明建立了一种简单的方法，使用不同比例的三种单体和过氧化物酶来模拟自然聚合过程，在体外聚合木质素。所得化合物可通过超高效液相色谱(uplc)与串联质谱(ms/ms)联用进行分析。然后，将植物组织中发现的可溶性木质素温和提取而不降解，利用超高效液相色谱(uplc)与串联质谱(ms/ms)联用测定其结构和含量。本发明对小麦茎秆可溶性木质素低聚体进行了分析，更精确的测定小麦茎秆木质素单体交联结构组成和含量，为小麦秸秆制备乙醇提供科学依据。
7.本发明的目的之一在于提供一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法，所述木质素单体交联结构为s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)
h，采用uplc
‑
ms/ms，色谱条件为：流动相a：超纯水，流动相b：乙腈，梯度洗脱(优选的：0
‑
0.5min，95％a，0.5
‑
3min，95％a
‑
75％a线性降低，3
‑
3.5min，75％a
‑
10％a线性降低，3
‑
4.0min，10％a，4.0
‑
4.1min，10％a
‑
95％a线性提高，4.1
‑
6.0min，95％a)。
8.优选的：所述色谱柱为c18，1.7μm，2.1
×
100mm，柱温为40℃。
9.优选的：所述质谱条件为：ms系统：acquity xevo tq
‑
d，电离模式：电喷雾离子源负离子模式(esi
‑
)；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800l/h，锥孔气流速：30l/h，碰撞气流速：0.20ml/min，毛细管电压：负离子为2.5kv；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测mrm；雾化气：氮气。
10.一种同时检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的方法，具体步骤如下：
11.(1)标准品的制备：将3种单体(对
‑
香豆醇(h)，松柏醇(g)，芥子醇(s))混合(每种单体3mg)溶于2ml含27mmol l
‑1的(cta)2so
4 ph 6.5的磷酸钠缓冲液(10mmol ml
‑1)中。然后加入67μl 3％h2o2和0.3mg ii型辣根过氧化物酶。30℃下水浴1h，然后用1ml 5％的na2s2o7水溶液中断反应。用0.6ml乙酸乙酯萃取木质素单体和低聚物，再用饱和nacl水溶液洗涤、涡旋振荡2min，5000g离心5min，吸取上层清液，在真空浓缩仪中蒸干。最后，将干燥的样品溶解在2ml含有35％乙腈的水溶液中，等待上机。
12.(2)样品处理：将液氮条件下磨碎的小麦茎秆冷冻干燥，加入萃取剂后混匀，所述萃取剂为乙醇：纯水＝80:20(体积比)；优选的：所述萃取剂与小麦茎秆的比例为4:1，ml：g。
13.(3)超声水浴萃取(优选：1h)，离心(优选：5000g，离心5min)收集上清液并真空浓缩干燥；
14.(4)将步骤(3)中的干燥样品溶解于超纯水中；
15.(5)将步骤(4)处理后的混合物用乙酸乙酯萃取，离心(优选：5000g，离心5min)收集上清液；
16.(6)将步骤(5)得到的上清液真空浓缩干燥后加入乙腈水(优选：乙腈：水＝35：65)溶解，过滤后采用超高效液相色谱串联质谱对s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h测定；
17.所述步骤(6)的测定方法为lc
‑
ms，色谱条件为：流动相a：超纯水，流动相b：乙腈，所述质谱条件为：ms系统：acquity xevo tq
‑
d，电离模式：电喷雾离子源负离子模式(esi
‑
)；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：1000l/h，锥孔气流速：150l/h，碰撞气流速：0.15ml/min，毛细管电压：2.5kv；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测mrm；雾化气：氮气。
18.本发明的目的之二是提供一种同时检测小麦茎秆九种木质素单体交联结构的方法，包括上述任一所述的方法，所述九种木质素单体交联结构为：s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h。
19.本发明的目的之三是提供上述任一所述的方法在检测小麦茎秆中九种木质素单体交联结构的应用，所述九种木质素单体交联结构为：s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明通过对小麦样品前处理和超高效液相色谱串联质谱方法的优化，建立了一种同时检测小麦茎秆等样品中多种含量极低、差异非常小的木质素单体交联结构，特别是同时检测s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h九种木质素单体交联结构，该方法既可以进行精确的定性又可以精准的定量，是一种简单、高通量、结果可靠的检测方法。
22.本发明所使用的小麦叶片的前期处理方法，可以有效的去除叶片中的色素、脂肪酸等基质干扰物质，降低检测时样品基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争等的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏的检测出多种木质素单体交联结构的含量。
23.木质素单体交联结构是小麦茎秆中重要的木质素结构，木质素单体交联结构对小麦茎秆质量起关键性作用，本发明的方法可以同时检测这九种木质素单体交联结构，一是降低了成本，二是节省了时间，三是减少了所取样品的用量。
24.本发明的方法，特异性强，灵敏度高，通量高，结果客观易于分析，对小麦茎秆生长发育中木质素单体交联结构含量进行确定，还可以为小麦茎秆提高抗倒伏性能提供指导。
附图说明
25.图1
‑
9依次为流动相a为s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h色谱图；
26.图10
‑
18依次为拔节后14天小麦茎秆s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h色谱图。
具体实施方式
27.为了更好的了解本发明的技术方案，下面结合说具体实施例对本发明作进一步说明。
28.试验仪器：
29.研钵；真空离心浓缩仪(eppendolf)；冷冻干燥机(christ)；1ml移液器(eppendolf)；控温摇床；10ml离心管；万分之一电子天平；多功能涡旋振荡混匀器；超声波清洗器；超纯水仪(milli
‑
q a10)；0.22μm有机系滤膜(millipore,ireland,gnwp04700)；0.22μm水系滤膜(millipore,ireland,jcwp04700)；进样小瓶(waters,12
×
32mm)；超高效液相
‑
三重四级杆质谱联用仪(acquity uplc i
‑
class/xevo tq
‑
d,waters)；c18色谱柱(acquity uplc beh c18 1.7μm,2.1
×
100mm,waters)。
30.试剂及标准品：
31.乙醇；双氧水(3％)；氯化钠；超纯水；乙酸乙酯(色谱级，cnw)；乙腈(色谱级，cnw)；
32.磷酸钠(trisodium phosphate anbydrous,macklin,cas:7601
‑
54
‑
9)；
33.(cta)2so4(hexadecyltrime thylammonium bisulfate,macklin,cas:68214
‑
07
‑
3)；
34.辣根过氧化物酶ii(peroxidase from horseradish type ii,sigma
‑
aldrich,cas:9003
‑
99
‑
0)；
35.na2s2o7(sodium pyrosulfate,macklin,cas:13870
‑
29
‑
6)；
36.对
‑
香豆醇(p
‑
coumaryl alcohol,yuanyeshengwu,cas:3690
‑
05
‑
9)；
37.松柏醇(coniferyl alcohol,sigma
‑
aldrich,cas:458
‑
35
‑
5)；
38.芥子醇(sinapyl alcohol,sigma
‑
aldrich,cas:537
‑
33
‑
7)；
39.芥子醛(sinapyl aldehyde,sigma
‑
aldrich,cas:134
‑
96
‑
3)。
40.实施例1
41.1.木质素单体交联结构受热不稳定，因此需要将研磨样品的研钵和称量样品的药匙放入液氮中预冷，萃取剂提前配好放在4℃冰箱中预冷，10ml离心管的试管架放在盛有碎冰中的保温泡沫盒中。
42.2.取放于
‑
80℃冰箱中的小麦茎秆或鲜茎秆样品，将样品放置在装有液氮的保温桶里，用剪刀将茎秆最上部和最下部的茎节剪掉，留茎秆中部，将中部茎秆剪碎，混匀。混匀的样品放在预冷的研钵中，加入液氮，磨碎样品成粉末，准确称取样品粉末0.5g，加入10ml离心管中，将离心管放在试管架上。
43.3.用移液枪准确加入2ml萃取剂(萃取剂为乙醇：超纯水＝80:20，体积比)。
44.4.用多功能涡旋振荡混匀器将离心管中的萃取剂和样品振荡混匀2min。
45.5.将放有10ml的离心管的离心管架放在超声波清洗器中，常温条件下超声30min。
46.6.5000g离心5min，温度设置为4℃，用移液枪小心取上清，转移到新的10ml离心管中。
47.7.样品残渣中再次加入2ml乙醇，涡旋振荡混匀1min，离心(5000g，5min)，用移液枪小心取上清，转移到相应的新的10ml离心管中。
48.8.剩余样品残渣中加入1ml乙醇，涡旋振荡混匀1min，离心(5000g，5min)，用移液枪小心取上清，转移到相应的离心管中。
49.9.将上述三次上清液合并。
50.10.将步骤9所得的上清液放在真空离心浓缩仪中，待蒸干后加入2ml乙酸乙酯溶解萃取木质素，涡旋振荡混匀2min。
51.11..5000g离心5min，用移液枪小心取上清，转移到新的10ml离心管中。
52.12.样品残渣中再次加入2ml乙酸乙酯，涡旋振荡混匀1min，离心(5000g，5min)，用移液枪小心取上清，转移到相应的新的10ml离心管中。
53.13.将上述两次上清液合并。
54.14.将步骤13所得的上清液放在真空离心浓缩仪中，待蒸干后加入2ml乙腈水溶液(乙腈：超纯水＝35：65)溶解。
55.15.样品过0.22μm的有机系滤器后，使用超高效液相
‑
质谱方法用于的测定，具体的参数如表1、2。
56.表1各木质素单体交联结构的质谱参数表
[0057][0058]
*表示定量离子
[0059]
表2液相方法表
[0060][0061]
流动相a:超纯水，流动相b:纯乙腈，进样5μl，柱温设为40℃，样品温度设定为4℃，由于无商品标准品，本发明制备的标准品为混合物，故以50ppb芥子醛为基准，对木质素单体交联结构进行定量。图1
‑
图9为本发明制备标准品的色谱图。
[0062]
图10
‑
图18为实际样品的检测的色谱图，保留时间与标准品相比是相同的，且定量离子和定性离子的保留时间与标准品的保留时间也是相同的，可以确定样品中检测的木质素单体交联结构分别为s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、s(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
o
‑
4)s、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
5)g、g(8
‑
o
‑
4)s(8
‑
8)s、g(8
‑
o
‑
4)g(8
‑
5)g、s(8
‑
o
‑
4)g、g(8
‑
8)g、g(8
‑
5)h。
[0063]
表3拔节后14天小麦茎秆中9种木质素单体交联结构的含量
[0064][0065]
以上描述仅为本技术的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。