用于消除蔬菜酶联免疫检测基质效应的简便快速前处理方法与流程

1.本发明属于农药残留免疫检测技术领域，尤其涉及用于消除蔬菜酶联免疫检测基质效应的简便快速前处理方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.各类免疫分析已经逐步用于蔬菜中农药残留等危害物的快速检测，典型的如酶联免疫吸附测定(elisa)、胶体金免疫层析检测等。与气相色谱、液相色谱等基于大型仪器的检测技术相比，免疫检测技术的主要特点和优势在于较为简单、快速、经济，更适合于大量样本的现场快速筛选。然而在对各类蔬菜样品进行elisa实际检测过程中常常观察到较为明显的基质效应，即基质中共存组分对于免疫分析的强烈干扰作用，从而导致检测灵敏度和准确度的降低。尽管可以通过稀释样品提取液以及固相萃取柱提取净化等方式来消减这种基质效应，然而在此过程中分析方法的简单性和灵敏度同样会受到影响。
4.之前关于鱼类等动物性产品的研究中发现，某些蛋白质是导致免疫检测基质效应的主要因素之一，而采用磺基水杨酸可以通过有效去除蛋白质而达到消除基质干扰的目的。蔬菜产品中的化学组成与鱼类等存在明显差异，其蛋白含量大大低于动物性产品，推测并非主要的干扰物质，因此难以简单沿用之前的研究成果。目前关于蔬菜免疫检测基质效应的主要来源，之前仍未明确。因此，如何简便有效地消除干扰作用，缺乏针对性的技术方法。通过本课题组的前期研究，已经证实蔬菜样本中的叶绿素是导致基质效应的主要因素之一，但是尚未找到较好的去除方法，在去除叶绿素的同时，往往会对后续的酶联免疫检测产生负面影响，导致检测的准确度、灵敏度和精确度下降。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足，本发明提供一种用于消除蔬菜样品免疫检测基质效应的简便快速前处理方法。本发明以韭菜等绿色蔬菜为样品，以腐霉利为代表性检测对象，研究确定了叶绿素为样品提取液中对酶联免疫吸附试验(elisa)存在不利影响的主要物质之一，并尝试了多种叶绿素去除方法，例如：活性炭吸附等，但对叶绿素的去除效果不理想或会对后续酶联免疫吸附试验造成较大影响。因此，发明人经过系统分析和大量实验摸索，偶然发现：磺基水杨酸可以很好地去除叶绿素，且不会对后续酶联免疫吸附试验造成较大影响。因此，基于磺基水杨酸建立了能有效去除叶绿素、从而显著消除基质效应的前处理方法，能够实现具有较高灵敏度、较强特异性以及稳定性的腐霉利酶联免疫快速检测，并通过对蔬菜样品的前处理优化可用于多种不同蔬菜样品。该研究具有良好的实际应用价值，同时为发展和改进此类绿色蔬菜的免疫分析技术相应的预处理方法提供有益的思路。
6.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供了一种蔬菜酶联免疫检测中基质干扰的消除方法，包括：
8.对蔬菜中的待测物进行提取，得到提取液；
9.对提取液进行磺基水杨酸处理，酸处理完成后，调节ph值，得到用于酶联免疫检测的待测样品。
10.研究发现：食品中的叶绿素等色素对腐霉利免疫化学反应存在基质干扰，因此，本发明研究了针对于这一具体基质成分的新型消除方法，简化了样品前处理步骤。
11.本发明的第二个方面，提供了上述磺基水杨酸处理在消除蔬菜酶联免疫检测中基质干扰中的应用。
12.本发明的第三个方面，提供了上述的前处理方法在消除蔬菜酶联免疫检测中基质干扰中的应用。
13.本发明的有益效果在于：
14.(1)本发明的提取和净化方式较为温和、提取净化效率高。甲醇可以有效提取出蔬菜样品中的腐霉利等待测物，使用干燥剂可以有效去除提取液中的水分以减少水溶性基质成分的含量。针对提取液中的主要基质成分叶绿素在酸性条件下易发生分解的特性，采用5
‑
磺基水杨酸酸化处理法，有效去除提取液中叶绿素的同时，不会导致腐霉利的损失，同时对于抗体的活性影响较小。
15.(2)与传统免疫检测前处理方法(稀释和固相萃取净化等)相比，本发明简单、快速，且不会因为稀释降低免疫检测灵敏度，无需通过固相萃取造成腐霉利等待测物损失。
16.(3)使用本发明作为前处理方法对三种绿色蔬菜进行腐霉利加标回收率测定，得到的腐霉利的加标回收率为71.52％～120.37％，相对标准偏差为4.05％～17.61％，可以满足我国国家标准对食品中腐霉利的检测需求。因此本发明具有良好的实际应用之价值。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为本发明实施例1中绿色蔬菜粗提液elisa吸光值；
19.图2为本发明实施例1中绿色蔬菜粗提液蛋白质和叶绿素浓度；
20.图3为本发明实施例1中叶绿素标准溶液对elisa的影响；
21.图4为本发明实施例1中不同净化方式溶液中叶绿素浓度；
22.图5为本发明实施例1中蔬菜酸化处理前后提取液中叶绿素浓度变化；
23.图6为本发明实施例1中酸化处理后各样品液及空白对照elisa吸光值；
24.图7为本发明实施例1中elisa
‑
hplc检测腐霉利实验结果线性回归曲线。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
26.一种用于消除蔬菜样品酶联免疫检测基质效应的简便快速前处理方法，包括如下
步骤：
27.1)提取液制备：
28.将蔬菜样品可食部分切块后混匀，充分匀浆；然后放置于离心管中，按每10g蔬菜样品计，加入10ml样品提取液，涡旋震荡3min，加入22g干燥剂，涡旋震荡3min，之后室温条件下4000rpm离心10min，收集上清液，转移至另一离心管中。
29.2)提取液净化：
30.取5ml上清液加入等体积磷酸盐缓冲液和0.1ml净化剂，涡旋震荡30s，经滤膜过滤，随后使用中和剂调节ph值在6～7范围内，随后进行elisa检测。
31.其中，步骤1)中，主要目的是从蔬菜样品中提取待测物，蔬菜样品具有复杂基质，含有蛋白、色素和其他干扰成分，这些因素将严重影响目标物的测定结果。甲醇是常用的农药残留提取剂，可以在提取出蔬菜样品中待测物的同时，沉淀提取液中的蛋白质，达到一定的净化效果。
32.步骤2)为净化方法，本发明针对样品提取液中对酶联免疫吸附试验(elisa)存在不利影响的主要物质叶绿素，利用磺基水杨酸为净化剂消除提取液中的叶绿素，建立了一种蔬菜样品提取液的净化方法。
33.在一些实施例中，所述样品提取液为甲醇。
34.在一些实施例中，所述干燥剂为20g无水硫酸钠和2g氯化钠。
35.在一些实施例中，所述磷酸盐缓冲液为0.01mol l
‑1ph＝7.4的磷酸盐缓冲液。
36.研究表明：其它酸处理会对后续免疫反应产生影响，采用磺基水杨酸既能有效地去除叶绿素的干扰，又不会对后续免疫反应产生影响，因此，磺基水杨酸是最合适的。
37.在一些实施例中，所述净化剂为体积分数为1％的5
‑
磺基水杨酸溶液。实际处理过程中，针对不同的蔬菜样本，可以对磺基水杨酸浓度进行调整。
38.本技术中对于中和剂的类型并不作特殊的限定，一般的强碱都可以，在一些实施例中，所述中和剂为浓度2mol/l的koh，以便于精准调控ph值。
39.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
40.实施例1：
41.1材料与方法
42.1.1试剂与仪器
43.表1药品及试剂
44.[0045][0046]
表2实验仪器
[0047][0048]
1.2蔬菜粗提溶液的制备
[0049]
韭菜、西兰花、黄瓜均购置于青岛市场，经高效液相色谱法鉴定为腐霉利阴性样品。将购得的韭菜、黄瓜、西兰花保存在
‑
20℃冰箱中备用。实验时将绿色蔬菜洗净切碎后放入均质机中均质，称取10g均质后的样品(约10ml)于50ml离心管，加入10ml甲醇，震荡3min。随后加无水na2so
4 20g，nacl 2g，震荡3min。4000rpm离心10min，收集5ml上清液。过0.22μm滤膜，收集滤液，滤液包裹锡箔纸尽量避免阳光直射，4℃冰箱中储存备用。
[0050]
1.3蔬菜粗提溶液蛋白质和叶绿素浓度测定
[0051]
分别取0.5ml绿色蔬菜粗提取液，40℃条件下氮气吹干，加入0.5ml 0.01mol/l pbs复溶，使用bradford试剂盒测定绿色蔬菜粗提取液中蛋白质浓度。
[0052]
本实验采用alan公式计算叶绿素浓度。
[0053]
简言之，试液中叶绿素浓度(w)：
[0054]
w(mg/l)＝4.44
×
a
666
19.71
×
a
653
[0055]
其中：
[0056]
a
666
——试液在666nm处的吸光度值
[0057]
a
653
——试液在653nm处的吸光度值
[0058]
分别取一定量绿色蔬菜粗提液样品液加入比色皿中，测定666、653nm处吸光值，使用上述公式测定绿色蔬菜粗提溶液中叶绿素浓度。
[0059]
1.4基质效应分析
[0060]
通过比较未加标提取物的elisa吸光度与空白对照缓冲液的吸光度。基质干扰指数i
m
(％)用来表示基质的干扰程度。
[0061]
本研究采用间接elisa法分别测定不同提取液体系及叶绿素标准溶液对酶联免疫吸附测定吸光值的影响，计算基质干扰指数i
m
(％)以评价不同提取液的基质效应，具体elisa实验操作如下：
[0062]
(1)包被。使用cbs将腐霉利
‑
bsa完全抗原分别稀释至浓度为5μgml
‑1，每孔100μl，37℃孵育2h或4℃孵育12h；
[0063]
(2)洗涤。甩掉孔内溶液，每孔加满洗涤液，将96孔酶标板置于摇床上震荡摇晃5min，甩干洗涤液，用力在滤纸上拍干，重复洗涤三次；
[0064]
(3)封闭。每孔300μl封闭液，37℃孵育2h或4℃孵育12h；
[0065]
(4)一抗。洗板3次，向粗提取液中加入等体积pbs制成样品溶液，随后用甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液将抗体稀释至合适倍数，与样品溶液1:1混合均匀，每孔100μl，置于37℃条件下孵育1.5h；或者使用叶绿素标准溶液在同样条件下进行试验。
[0066]
(5)二抗。洗板3次，用pbs将酶标二抗分别稀释至5000倍，每孔100μl，置于37℃条件下孵育1h；
[0067]
(6)显色。洗板3次，每孔100μl显色液，37℃避光孵育3～5min；
[0068]
(7)终止。每孔50μl终止液；
[0069]
(8)读数。读取450nm吸光值；
[0070]
使用以下公式计算基质干扰指数i
m
(％)：
[0071]
i
m
(％)＝[(od
450空白
‑
od
450样品
)/od
450空白
]
×
100％
[0072]
其中，
[0073]
od
450空白
——使用空白对照进行间接elisa实验得出的450nm吸光值
[0074]
od
450样品
——使用不同样品溶液进行间接elisa实验得出的450nm吸光值
[0075]
1.55
‑
磺基水杨酸消除基质效应
[0076]
为考察5
‑
磺基水杨酸对叶绿素的去除效果，用甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液将叶绿素标准溶液稀释至3mg l
‑1浓度，取5ml加入50μl(1％，v/v)或100μl(2％，v/v)5
‑
磺基水杨酸溶液(浓度为1g ml
‑1)，振荡30s，用0.22μm滤膜过滤，随后加入2mol l
‑1的koh，调节ph值在6～7之间，按上述1.3中的方法测定滤液中叶绿素浓度。同时，用甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液将腐霉利标准溶液稀释至1.5mg l
‑1，用1％5
‑
磺基水杨酸处理，随后通过hplc法测定处理后的腐霉利浓度。为了考察5
‑
磺基水杨酸处理对elisa结果的影响，根据上述操作，用1％5
‑
磺基水杨酸溶液处理甲醇/pbs混合物(50:50，v:v)，并根据1.4中描述的elisa方法测定450nm处的光密度(od)值。以甲醇/pbs混合物(50:50，v:v)为对照，计算基质干扰指数(i
m
)。
[0077]
1.6蔬菜样本腐霉利加标回收率检验
[0078]
将5ml pbs和0.1ml 5
‑
磺基水杨酸溶液(1g ml
‑1)添加到5ml蔬菜粗提取物(如1.2所述制备)中并振动30s。混合物用0.22μm滤膜过滤，加入2mol l
‑1的koh调节ph值在6～7范围内，按1.3中描述的elisa方法测定450nm处的光密度(od)值，以经1％5
‑
磺基水杨酸处理后的甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液作为对照，计算基质干扰指数(i
m
)。
[0079]
为评价所建立的蔬菜中腐霉利分析技术的效果，将10g均质后的阴性蔬菜样品分别加入50ml离心管中，每种蔬菜样品均加入腐霉利溶液以达到一定的浓度，在4℃条件下孵育过夜。用上述1.5中的5
‑
磺基水杨酸法(1％，v/v)处理蔬菜样品，用间接竞争elisa(ci
‑
elisa)和高效液相色谱(hplc)分别测定其含量，计算不同蔬菜样品中腐霉利的回收率。并对测定结果进行比较，验证elisa方法的适用性。
[0080]
高效液相色谱法采用zorbax eclipse plus
‑
c18色谱柱(250mm
×
4.6mm,5.0μm)，以乙腈：纯水(60:40，v:v)为流动相，流速为1ml min
‑1，上样体积20μl，紫外检测波长为207nm处进行测定。
[0081]
在ci
‑
elisa中，用5
‑
磺基水杨酸处理后的甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液将腐霉利标准储备溶液连续稀释到不同的浓度，然后取50μl溶液与等量用甲醇/pbs(50:50，v:v)混合液稀释的抗体溶液混合。37℃孵育15分钟后,将混合物转移到孔中，其他步骤与上述elsia程序相同。由origin8.5利用常用的四参数logistic方程生成标准曲线计算腐霉利含量。
[0082]
2结果与讨论
[0083]
2.1绿色蔬菜粗提溶液基质成分分析
[0084]
与空白对照相比，几种绿色蔬菜粗提取液的elisa吸光值从1.276显著降低至0.527，计算可得基质干扰指数从28.11％至58.65％不等(图1)。这些假阳性结果清楚地表明了粗提取液中含有对免疫测定存在严重干扰的基质成分。绿色蔬菜的特点之一是各种色素含量丰富，例如绿色蔬菜中含有丰富的叶绿素。由图2可得，所有蔬菜提取物都含有较为丰富的叶绿素，而且从图3可以发现，不同浓度的叶绿素溶液也可以对elisa检测产生显著的干扰作用，而且在一定范围内随浓度提升而不断增强。基于上述实验结果，可以确定蔬菜样本中的叶绿素，是导致elisa检测基质干扰的重要因素。
[0085]
2.2磺基水杨酸对叶绿素的净化消除效果分析
[0086]
针对叶绿素在ph值小于7的环境中易分解的特点，提出了酸化前处理的新思路。在常用的各种酸中，5
‑
磺基水杨酸被认为具有很好的基质蛋白消除能力，同时其对elisa和其他免疫测定方法的影响较小。原则上它也不会与腐霉利发生反应或导致其不稳定进而分解消散。这些研究内容通过以下实验得到了很好的证实。如图4所示，在1％和2％的5
‑
磺基水杨酸存在下，标准溶液中的叶绿素浓度分别降低了91.7％和94.3％。用1％5
‑
磺酰水杨酸处理后，腐霉利的浓度无显著差异(相对标准偏差为2.98％)。同时，用1％5
‑
磺基水杨酸酸化处理，elisa吸光值与未进行酸处理的空白对照相差不大，基质干扰指数＜10％(图6)，这说明5
‑
磺基水杨酸酸化处理对腐霉利的免疫测定影响较小。
[0087]
2.35
‑
磺基水杨酸对蔬菜样品基质效应的消除效果
[0088]
用绿色蔬菜样品进一步验证了所提出的5
‑
磺基水杨酸酸化预处理方法的可行性。经1％的5
‑
磺基水杨酸酸化处理后，提取液中的叶绿素被有效去除，如图5所示。不同绿色蔬
菜样品的提取液中叶绿素的消除率计算为87.3％～90.1％。绿色蔬菜样品提取液的elisa实验吸光值都有所提高(图6。计算可得，与酸化处理前的粗提取液相比，酸化后的提取液中的基质成分对elisa实验的基质干扰指数从28.09％
‑
58.64％下降至3.4％
‑
22.86％。该结果表明，叶绿素的去除显著降低了免疫测定中的基质干扰效应。然而对于不同的蔬菜，酸化处理后溶液的吸光值上升情况不尽相同，这可能跟蔬菜本身的基质复杂程度有关。总的来说，经过酸化处理，三种绿色蔬菜的基质干扰指数均明显降低。虽然某些蔬菜提取液中仍存在一定的基质干扰，但已经可以实现准确、简便的ci
‑
elisa检测。
[0089]
2.4基于前处理新方法的腐霉利elisa检测效果
[0090]
使用以腐霉利为加标物的间接竞争elisa实验测定几种蔬菜样品的加标回收率，实验结果总结在表3。与空白对照相比，部分蔬菜样品的ci
‑
elisa仍存在一定的偏差。这可能是由于预处理提取物中仍残留的一些基质效应，然而目前暂未查明该基质效应来源。尽管如此，所建立的预处理方法对绿色蔬菜样品ci
‑
elisa检测过程中基质效应的消除是有效的。在所考察的加标浓度范围内，腐霉利的加标回收率为71.52％～120.37％，相对标准偏差为4.05％～17.61％；hplc回收率评价为77.17％～90.53％，相对标准偏差为3.59％～9.53％(表3)。对两种方法的测定结果进行比较，结果如图7所示，elisa(x)与hplc(y)有较好的相关性，线性回归方程为y＝1.0428x
‑
79.699(r2＝0.9785,n＝9)。
[0091]
总的来说，这些结果显示出了令人满意的准确度、灵敏度和精密度，可以很好地满足通常开发的腐霉利快速检测技术的要求。与传统消除基质效应的方法(如稀释、固相萃取净化等)相比，这种叶绿素靶向的酸化前处理技术似乎更加简单、快速，并且不会显著降低分析的灵敏度。然而针对成分较为复杂的蔬菜样品，该方法的基质去除效果仍有待提升。
[0092]
表3三种蔬菜样品腐霉利的elisa和hplc加标回收结果
[0093][0094][0095]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发
明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。