基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测方法及系统与流程

1.本发明涉及细胞检测技术领域，特别涉及一种基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测方法及系统。


背景技术：

2.细胞是生物体的基本功能单位，通过化学和物理方式维持和感知生物体内的生理环境。可变形性是细胞的一个重要特性，对于胚胎发育、人体组织及器官的体内平衡发挥着十分重要的作用。一些疾病会导致细胞的变形能力发生改变。例如，疟疾、败血症、帕金森综合症会使得细胞变形能力降低，甲状腺癌、卵巢癌会使得细胞变形能力增强。因此，研究细胞的可变形性可以深入了解疾病进展的机制，提供一种新的用于检测和诊断疾病的思路，具有十分重要的意义。
3.目前有一些低通量检测细胞形变的方法，如光学拉伸器和微管吸吮技术，这些方法可以准确地对每个细胞的变形能力进行测量，但是测量较为耗时，对实验环境要求较高，不能广泛使用。还有一种高通量检测方法，对实验环境要求不高，但是只对细胞变形时的某一时刻进行分析，导致不能很好地对具有不同变形能力的细胞分类，分辨能力差，结果散点图中有交叠现象。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于改善现有技术中存在的上述缺陷，提供一种基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测方法及系统，通过获取细胞变形全过程的时序信息来分析细胞的变形能力，且可以进行清晰的分类，分类准确率较高。
5.一方面，本发明实施例提供了一种基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测系统，包括微流控芯片、恒压泵、显微镜、相机和具备图像分析能力的电子设备，微流控芯片承细胞样品并使细胞产生形变，恒压泵用于将细胞样品泵入微流控芯片中，显微镜用于选取细胞在微流控芯片中发生形变的观测区域，相机用于捕捉细胞形变过程的视频图像，电子设备用于将视频图像转换成具有时序信息的图像，并利用深度学习算法对具有时序信息的图像进行分析
6.上述系统结构简单，对实验环境也没有过多的要求，利用上述系统可以很好地进行细胞检测，且基于深度学习方法可以对基于细胞的形变能力进行清晰的分类。
7.所述微流控芯片包括细胞注入部、微流控沟道和细胞流出部，细胞注入部连接微流控沟道，微流控沟道连接细胞流出部，细胞注入部用于注入细胞样品，微流控沟道用于使细胞样品产生形变。
8.在更优化的方案中，所述微流控芯片还包括鞘液注入部和鞘液流道，鞘液流道的输入端连接鞘液注入部，鞘液流道的输出端连接细胞注入部，并连接微流控沟道，鞘液流道由两条结构相同的流道支路连接形成环状并呈轴对称结构。
9.上述方案中，通过设置鞘液注入部注入鞘液，鞘液可以使得细胞在微流控沟道中
更居中流过，尤其是当鞘液流道由两条结构相同的流道支路连接形成环状并呈轴对称结构时，可基于聚焦原理使得细胞更居中流过，使得细胞受力更均匀，继而提高检测结果的准确度。
10.在更优化的方案中，微流控芯片高度为4μm，微流控沟道宽度为10μm，微流控沟道长度为70μm。通过这样的尺寸设置，不仅可以使得细胞可以顺利流经微流控沟道，而且可使得细胞产生形变，便于检测。
11.在更优化的方案中，微流控芯片还包括设置于细胞流出部的多个支撑柱，用于支撑微流控芯片以防止坍塌。微流控芯片是放置在显微镜上的，通过设置支撑柱可以放置芯片坍塌。
12.在一个可实施方案中，所述微流控芯片通过以下步骤制作而得：
13.将硅片放入通风橱中，利用三氯硅烷化合物对硅片进行预处理；
14.将pdms的预聚物和固化剂以10：1的比例进行配置得到液态pdms，将预处理过的硅片置于称量皿内，并用胶带固定，将液态pdms浇注到称量皿上，使其均匀并完全覆盖住硅片，然后对浇注后的称量皿抽真空，最后将抽完气泡的称量皿置于烘箱内进行烘烤使pdms固化；
15.将固化后的pdms与硅片分离，再按照设计好的边线将pdms切成块，再使用打孔针打出pdms上芯片的入口和出口；
16.将pdms用镊子放置在无水乙醇中清洗，然后采用等离子氧化的方法进行封装。
17.另一方面，本发明实施例还提供了一种应用所述的基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测系统进行检测的方法，包括以下步骤：
18.步骤1，采集待检测的细胞样品；
19.步骤2，通过恒压泵将细胞样品泵进微流控芯片中，并通过相机采集微流控沟道处细胞形变的全过程视频图像；
20.步骤3，从视频图像中截取其中多张图像，并组合成一张具有时序信息的图像，然后输入预先训练好的卷积神经网络模型中，输出得到对待检测细胞的分类结果。
21.在更优化的方案中，所述预先训练好的卷积神经网络模型为改进后的resnet网络模型，该改进后的resnet网络模型的激活函数为swish，并在训练过程中采用rmsprop优化器对权重参数进行优化。
22.所述的检测方法中，当微流控芯片包括鞘液注入部和鞘液流道时，通过恒压泵同时将鞘液和细胞样品分别泵进微流控芯片中的鞘液注入部和细胞注入部。
23.在一种可实施方案中，所述采集待检测的细胞样品的步骤，包括：取设定量的红细胞离心处理后，去除上清液并用pbs重悬，重复三次离心操作后加入2ml的pbs重悬，并加入100ul浓度为1％的牛血清白蛋白溶液。
24.与现有技术相比，本发明方法及系统，具有以下技术优势：
25.本发明检测系统结构简单，对检测环境也没有过多要求，适于推广应用；
26.本发明检测系统可以实现细胞形变的全过程视频图像采集，且基于深度学习方法对具有时序信息的细胞图像进行分析，可以清晰、准确地对细胞进行分类。
27.本发明所具有的其他优势将会在具体实施例中进行相应说明。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
29.图1为实施例中微流控芯片的结构示意图。
30.图2为微流控芯片中鞘液和细胞的流动方向示意图。
31.图3为图1中虚线框所圈示的微流控沟道的局部放大图。
32.图4为聚焦原理的原理图。
33.图5为微流控芯片的制作流程图。
34.图6为基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测系统的组成框图。
35.图7a
‑
7i分别为9张细胞经过微流控沟道时发生形变的图片。
36.图8为由9张图片合成为具有时序信息的一张图片。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.请参阅图1和3，图1为微流控芯片的结构示意图，图2为图1中虚线框所圈示的微流控沟道的局部放大图。细胞在经过微流控沟道时，因受到剪切力的影响，会发生形变。不同软硬度的细胞在受到剪切力时，会发生不同形变，聚焦原理会使得细胞居中流过微流控沟道，减少误差。基于这个原理，设计了图1所示的微流控芯片。
39.在图1所示结构中，微流控芯片包括鞘液注入部、鞘液流道、细胞注入部、微流控沟道和细胞流出部，鞘液流道的输入端连接鞘液注入部，鞘液流道的输出端连接细胞注入部，并连接微流控沟道，微流控沟道连接细胞流出部。为了防止杂质进入芯片中，可以在鞘液注入部和细胞注入部分别设置有过滤器20，过滤器的缝隙为10μm。由于红细胞的大小一般为5～8μm，因此设计微流控芯片高度为4μm，微流控沟道宽度为10μm，微流控沟道长度为70μm。
40.鞘液流道为由两条流道支路构成的环状结构，需要注意的是，环状结构并不是限定为圆环、椭圆环、矩形环等，只要是由两条结构相同的流道支路连接形成环状并呈轴对称结构即可。鞘液注入部设置有鞘液注入口10，鞘液通过鞘液注入口10注入微流控芯片后，进入鞘液流道40。如图2所示，细线箭头表示鞘液的流动方向，粗线箭头表示细胞的流动方向。鞘液在鞘液流道的输入端分成两路，然后在鞘液流道的输入端汇。细胞注入部设置有细胞注入口30，细胞通过细胞注入口30注入微流控芯片后，在鞘液流道的输出端与鞘液汇合，一起流经微流控沟道。细胞在经过微流控沟道50时，因受到剪切力的影响，会发生形变，不同软硬度的细胞在受到剪切力时会发生不同形变。最后，细胞和鞘液经过细胞流出部的出口60出去。聚焦原理会使得细胞居中流过微流控沟道，减少误差。聚焦原理的原理图如图4所
示，a4为a1、a2、a3的混合液。
41.鞘液是指pbs溶液(又称为磷酸盐缓冲溶液)，不会破坏细胞的生物特性。本实施例中采用鞘液，且将芯片设计为图1所示结构，目的是基于聚焦原理，使得细胞在流经微流控沟道时居中，进而保障受力均匀，减少甚至消除因各个细胞受力不均匀而导致形变程度不同所产生的误差，继而影响细胞因软硬程度不同而形变不同的准确度。若不考虑受力不均的影响，芯片结构也可以不设计鞘液注入部和鞘液流道。
42.如图1所示，微流控芯片还包括设置于细胞流出部的多个支撑柱70，其作用是防止微流控芯片坍塌。在使用时，将微流控芯片固定在显微镜上，找到最佳观测区域，然后利用恒压泵使鞘液和细胞同时进样，并采用相同大小的进样速度。
43.如图5所示，为微流控芯片的制作流程图，制作流程包括以下步骤：
44.(1)硅片预处理。
45.硅片预处理的目的是防止固化后的pdms与阳膜剥落时发生黏附现象。预处理的具体操作是：将硅片放入通风橱中，利用三氯硅烷化合物对硅片进行处理，并待其挥发完毕。对硅片进行预处理也可以提高硅片的使用时间。
46.pdms全称为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane)，是一种高聚物材料，其优点在于价格便宜、具有良好的透光透气性、具有一定的化学惰性等,因此采用pdms来加工微流控芯片。
47.(2)pdms制作。
48.首先，将pdms的预聚物和固化剂以10：1的比例进行配置。为了避免细胞和芯片之间发生黏附，也可以在配置好的液态pdms内加入1
‰
的tritonx
‑
100。配置好的液态pdms重量约为35g，并将其放入搅拌机中进行充分的搅拌，使液态pdms与tritonx
‑
100充分混合。
49.其次，将预处理过的硅片置于称量皿内，并保持称量皿与硅片之间水平，然后用胶带进行固定；将混合后的液态pdms缓慢浇注到称量皿上，使其均匀并完全覆盖住硅片，然后对浇注后的称量皿抽真空，以除去pdms中的气泡。
50.最后将抽完气泡的称量皿置于烘箱内，在90℃的环境下处理两小时使pdms固化。在放入烘箱时，需要保持称量皿水平，避免pdms在固化后高度不一致。
51.(3)切割与打孔。
52.首先将pdms与硅片进行分离。在操作时要动作轻缓，以防硅片碎裂。将印有芯片的那一面朝上，再按照设计好的边线将其切成与盖玻片大小相似的方块。
53.然后再使用打孔针打出pdms上芯片的入口和出口。在每次打孔时可蘸取少量酒精，可减少打孔时的摩擦力，提高打孔速度。
54.(4)键合封装。
55.将pdms用镊子放置在烧杯中，并加入适量的无水乙醇开始超声清洗，三到五分钟后完成清洗操作。本实验采用等离子氧化的方法来封装微流控芯片，将清洗过的pdms与盖玻片一起放入刻蚀机中，经过60秒的氧化处理之后，将pdms与盖玻片进行键合。在键合时要小心按压芯片，防止微流控沟道倒塌，并在键合好的芯片表层贴一层胶带，以防止受到污染等。最后将微流控芯片置于85℃的烤箱内烘烤两小时，使微流控芯片完全键合。
56.当然，本实施例中提供的方法是实验中比较优越的制备方法，对于制备方法中涉及的各项条件，例如烘烤温度、烘烤时间等，可以有不同的实施方式，在本实施例提供的条
件中的大致范围内都是可行的。
57.如图6所示，基于深度学习和微流控芯片的细胞形变检测系统，包括图1所示的微流控芯片、恒压泵、显微镜和相机，恒压泵用于将鞘液和细胞样品分别泵入微流控芯片中的鞘液注入部和细胞注入部，显微镜则用于对微流控芯片中的微流控沟道区域进行放大，相机优选为高速相机，使得采集的图像更清晰，高速相机用于在显微镜的辅助下，捕捉细胞形变过程的视频图像。检测时，选取细胞经过微流控沟道时发生形变的9张图片，如图7a
‑
7i所示。采集视频图像后还需要对视频图像进行分析，所以检测系统中还包括计算机，或者可执行图像分析的其他电子设备，计算机或其他电子设备基于深度学习进行图像分析，根据细胞的形变程度确定细胞的类型，例如变软的细胞、变硬的细胞。
58.本实施例中，基于深度学习进行细胞形变检测，网络模型采用卷积神经网络。卷积神经网络有多种，为了得到更好的效果，实验中采用了3种卷积神经网络模型，具体是vgg16、resnet网络、s
‑
resnet网络。其中s
‑
resnet网络是由resnet网络改进而来的，改进的地方为：(1)选用了swish激活函数来提高网络的非线性；(2)使用了rmsprop优化器对权重参数进行优化，进而提升网络对红细胞可变形性的分类能力。
59.为了验证本发明方法的可靠性，实验中，采用了三组具有不同变形能力的红细胞：
60.对照组：即正常人血红细胞。取500ul的红细胞，离心处理后，去除上清液并用pbs重悬，重复三次离心操作后加入2ml的pbs重悬，并加入100ul浓度为1％的牛血清白蛋白溶液(bsa)防止红细胞黏附。
61.cacl2实验组：取500ul的红细胞，经过三次离心处理后，加入1ml浓度为500μmol/l的cacl2溶液，反应20分钟后离心红细胞，去除上清液后再加入2ml的pbs重悬，并加入100ul浓度为1％的牛血清白蛋白溶液(bsa)防止红细胞黏附。
62.h2o2实验组：取500ul的红细胞，经过三次离心处理后，加入1ml浓度为400μmol/l的h2o2溶液，反应20分钟后离心红细胞，去除上清液后加入2ml的pbs重悬，并加入100ul浓度为1％的牛血清白蛋白溶液(bsa)防止红细胞黏附。
63.利用搭建好的实验系统，分别获取三组红细胞经过微流控沟道全过程的视频信息，然后选取细胞发生变形的9张图片，利用matlab算法将这9张图片转化为一张具有时序信息的细胞变形图片，如图8所示，为正常红细胞的一张具有时序信息的细胞变形图片。利用matlab算法将这9张图片转化为一张具有时序信息的细胞变形图片为现有技术，此处为了节省篇幅，不再展开进行细致描述。
64.基于深度学习需要使用大量的样本，为了丰富样本，实验中通过上下翻转的方法对训练数据进行扩增，得到的数据如下表1所示：
65.表1
[0066][0067]
实验中，类别数num_calss设置为3，初始学习率learning_rate设置为0.05，batchsize设置为32，训练总次数设置为80000次。由于vgg16、resnet网络在图片(本方法中为细胞图片)分类中的应用已经较为成熟，本发明方法中没有对具体的训练过程进行改进，因此对于具体的训练过程不再细致阐述。s
‑
resnet网络与resnet网络的区别就是激活函数选用了swish，并使用了rmsprop优化器对权重参数进行优化，训练过程与resnet网络相同，因此训练s
‑
resnet网络的过程也不再详细阐述。
[0068]
三种网络模型在测试集上的分类结果，如下表2所示：
[0069]
表2
[0070][0071]
从表2可以看出，相比于其他两个网络模型，s
‑
resnet网络分类正确的图片数量最多，表明s
‑
resnet拥有更好的分类性能。因此，在实际检测应用中，采用s
‑
resnet网络对采集的视频图像进行分析。
[0072]
实际应用中，检测方法包括以下步骤：
[0073]
步骤1，采集待检测的细胞：取500ul的红细胞，离心处理后，去除上清液并用pbs重悬，重复三次离心操作后加入2ml的pbs重悬，并加入100ul浓度为1％的牛血清白蛋白溶液(bsa)防止红细胞黏附。
[0074]
步骤2，通过恒压泵分别将鞘液和细胞泵进微流控芯片中，并通过高速相机(即工业相机)采集微流控沟道处细胞形变的全过程视频图像。
[0075]
步骤3，从视频图像中截取其中9张图像，并组合成一张具有时序信息的图像，然后输入预先训练好的s
‑
resnet网络模型中，输出得到对该图像的分类结果，即得到对待检测细胞的分类结果。分类结果可能是变软的红细胞、正常红细胞、变硬的红细胞。
[0076]
容易理解的是，本步骤中是从视频图像中截取其中9张图像组合成一张具有时序信息的图像，但是作为其他实施方式，也不一定是9张图像，可以更多或者更少，例如6张。
[0077]
容易理解的是，红细胞的形变能力一般分为这3种，因此分类结果可能是三者之一，如果有更多的分类，则在训练网络模型时类别数num_calss对应设置更多的类别。
[0078]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。