一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物-蚯蚓的急性毒性测试方法与流程

一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法
技术领域
1.本发明属于土壤中污染物毒性检测技术领域，特别涉及一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法。


背景技术：

2.土壤作为一个活跃的开放系统，大部分被释放到环境中的污染物质会通过各种途径(大气、水体和生物等)进入土壤中。当污染物含量超过土壤环境容纳量时会导致土壤结构和理化性质的恶化，进而引起土壤质量和肥力水平的下降，甚至会对人体和其他生物的生存繁衍与生命安全造成威胁。因此，对土壤污染的毒性检测方法和风险评估逐渐受到世界各国环境保护领域的广泛关注。
3.蚯蚓是土壤中的原著生物，适应能力强、对污染物敏感、体型易于培养和操作，因而被广泛应用于污染物的生物毒性测试和土壤污染风险评估，尤其在污染土壤环境风险分级、污染物土壤质量基准与标准的制定、特定污染场地环境风险评价、污染场地修复效果评价等方面有重要的应用价值，被公认为最理想的监测土壤污染的指示生物。国际标准化联合会和经济合作与发展组织等标准化机构都公布过一系列标准的蚯蚓急性毒性实验方法。但是这些标准方法都不适用于测定挥发性有机物(vocs)。
4.根据世界卫生组织(who)的定义，挥发性有机物是指在常温下，沸点50℃
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260℃的各种有机化合物。在我国，挥发性有机物是指常温下饱和蒸汽压大于70pa、常压下沸点在260℃以下的有机化合物，或在20℃条件下，蒸汽压大于或者等于10pa且具有挥发性的全部有机化合物。
5.当用现有蚯蚓急性毒性实验方法对挥发性有机物染毒的土壤进行毒性测试时，会发现污染物浓度低时，蚯蚓出现逃逸现象，但是蚯蚓无死亡；污染物浓度高时，蚯蚓停留在土壤表面，并很快死亡。同时现有蚯蚓急性毒性实验方法还存在耗材废料多、实验周期长、蚯蚓易逃逸等缺点，因此一种耗材少，周期短并且适用于测定挥发性有机物的蚯蚓急性毒性实验方法是十分有必要的。


技术实现要素：

6.针对现有蚯蚓急性毒性实验方法耗材废料多、实验周期长、蚯蚓易逃逸和不适用于挥发性有机物的特点，本发明提出了一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法。
7.本发明的技术方案是这样实现的：
8.一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法，包括以下步骤：
9.s1：蚯蚓清肠
10.选取经过未污染土壤驯化的蚯蚓，在试验条件下清肠，得到受试蚯蚓备用；
11.蚯蚓清肠的具体步骤包括：在底部铺有一层滤纸的1l平底烧杯中加入少量超纯水，以刚浸没滤纸为宜。将蚯蚓放在滤纸上，用塑料薄膜封口并扎孔，将烧杯放入温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱，避光培养，清肠24h。
12.s2：土壤染毒
13.取土壤于密封管中进行预处理，调节水土重量比1：4，并迅速密封，在试验条件下平衡处理；
14.s3：正式试验
15.随机将步骤s1获得的受试蚯蚓放进步骤s2的密封管中，在试验条件下记录受试蚯蚓的毒性效应参数；
16.密封管为特制密封管，该密封管为底玻璃管(内径2.6cm
×
高8 cm)。
17.s4：毒性评价
18.根据步骤s3获得的受试蚯蚓的毒性效应参数计算受试土壤对蚯蚓的效应浓度lc
x
值，并对土壤毒性进行评价。
19.进一步的，步骤s1中蚯蚓为赤子爱胜蚓(eisenia fetida)或者安德爱胜蚓(eisenia andrei)。
20.更进一步的，上述两种蚯蚓为湿重在300
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600mg、3月龄以上身体前端出现鞍状或环带状生殖带、体态正常的健康蚯蚓。
21.进一步的，步骤s1、步骤s2和步骤s3中试验条件为温度20
±
2℃，湿度70％
‑
90％，避光培养。
22.进一步的，步骤s2中土壤选取实际污染土壤或标准土壤；
23.其中，土壤为实际污染土壤，实际污染土壤在调节水土重量比前，实际污染土壤与参比土壤或标准土壤混合；
24.土壤为标准土壤，标准土壤为人工土壤，人工土壤在调节水土重量比前，进行染毒预处理；人工土壤配方按重量份数计，包括以下组分：泥炭藓10份，高岭粘土20份，工业石英砂69份，碳酸钙0.3
‑
1.0 份。
25.上述参比土壤为不含污染物且采集地点靠近污染点的土壤。泥炭藓中无明显植物残体，风干，磨细，ph：5.5
‑
6.0；高岭粘土中高岭石含量不低于30％，工业石英砂中50
‑
200μm粒径的细砂含量在50％以上，碳酸钙为分析纯，研磨成粉末，起到调节土壤ph的作用，可调节土壤ph至6.0
±
0.5。
26.当步骤s2中土壤选取标准土壤时，需要根据受试化学物质的物理化学和毒性特点，采用不同方式进行染毒预处理。
27.更进一步的，土壤染毒预处理的方式根据受试化学物质的物理化学和毒性特点，采用不同方式进行染毒预处理，土壤染毒预处理的方式为：
28.受试物为固体受试化学物质：固体受试化学物质为水溶性物质时，将固体受试化学物质溶入超纯水中，然后与土壤混均；或者受试物为疏水性物质时，先将固体受试化学物质与土壤充分混合，然后再补超纯水；
29.或者受试物为液体受试化学物质：液体受试化学物质为水溶性物质时，将受试物溶入超纯水中，然后与土壤混均；或者液体受试化学物质为高毒难溶性物质时，先将受试物溶解于低毒或无毒的有机溶剂中，然后再与土壤混均；或者液体受试化学物质为低毒难溶
性物质时，将液体受试化学物质直接与土壤混合。
30.其中，液体受试化学物质中，高毒难溶性物质的实例包括但不限于二甲苯，低毒难溶性物质的实例包括但不限于三氯乙烯，低毒或无毒的有机溶剂的实例包括但不限于二甲基亚砜。进一步的，步骤s3 中毒性效应参数为蚯蚓的死亡数量和中毒症状，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡。
31.进一步的，步骤s3中受试蚯蚓放进密封管中在试验条件下培养 48h，于24h和48h分别记录受试蚯蚓的毒性效应参数，每个浓度处理重复10次。
32.进一步的，步骤s4的效应浓度lc
x
值采用单位概率回归分析法计算。
33.更进一步的，lc
x
为lc
50
，r2≥0.7。
34.本发明公开了一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法，针对现有标准蚯蚓急性毒性实验方法不适用于挥发性有机物的缺点，提出一种易于操作、实验结果稳定性良好和剂量
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效应相关性高的测定土壤中挥发性有机物对土壤中蚯蚓的急性毒性实验方法，本方法可判断土壤中挥发性有机物对土壤生物的急性毒性，具有速度快，成本低且精度高的特点。
附图说明
35.图1为实施例1中二甲苯对蚯蚓的急性毒性测试结果图；
36.图2为实施例2中三氯乙烯对蚯蚓的急性毒性测试结果图。
具体实施方式
37.为了进一步说明本发明的技术方案，结合以下实施例具体说明。
38.实施例1与实施例2中标准土壤的ph值为6.0
±
0.5，包括以下重量份数的原料，泥炭藓10份(无明显植物残体，风干，磨细，ph： 5.5
‑
6.0)，高岭粘土20份(高岭石含量不低于30％)，工业石英砂69 份(50
‑
200μm粒径的细砂含量在50％以上)，碳酸钙0.3
‑
1.0份(分析纯，研磨成粉末，用于调节标准土壤的ph至6.0
±
0.5)
39.实施例1：一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法，包括以下步骤：
40.s1.蚯蚓清肠
41.在底部铺有一层滤纸的1l平底烧杯中加入少量超纯水，以刚浸没滤纸为宜。将蚯蚓放在滤纸上，用塑料薄膜封口并扎孔，将烧杯放入温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱中清肠24h。
42.蚯蚓为赤子爱胜蚓(eisenia fetida)，蚯蚓为湿重在300
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600mg、 3月龄以上身体前端出现鞍状或环带状生殖带、体态正常的健康蚯蚓。
43.s2.土壤染毒
44.将二甲苯溶解到二甲基亚砜中，配成相应浓度的标准溶液(根据预实验中蚯蚓不死及完全死亡的浓度，设置标准溶液的浓度为 200mg/kg，250mg/kg，300mg/kg，350mg/kg和400mg/kg这5个浓度)；同时设置溶剂对照组(即标准溶液的浓度为0mg/kg)和空白对照组(无二甲苯和二甲基亚砜，只有土壤)；
45.称取10g烘干的标准土壤于特制的密封管(特制密封管为有底玻璃管(内径2.6cm
×
高8cm)中，然后将标准溶液快速且均匀地滴入标准土壤中，并用去离子水将水土重量比调整为1：4，迅速用铝箔纸封口，将密封后的密封罐放入温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱，避光培养，平衡处理24h。用封口膜将铝箔纸紧密贴在密封管壁上，防止挥发。
46.s3.正式试验
47.受试土壤平衡24h后，快速将土搅拌，每个密封管放入1条已清肠24h的蚯蚓，再次封口，置于温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱中，避光培养48h，于24h和48h分别记录受试蚯蚓的毒性效应参数，每个浓度处理重复10次。
48.s4.实验结果
49.在整个实验过程中，空白对照组和溶剂对照组均未出现蚯蚓死亡和不适现象，证明实验生物和实验条件符合质量控制标准，毒性实验结果可信。
50.实验结果表明，暴露于低浓度的二甲苯中(二甲苯＜300mg/kg)，蚯蚓出现身体僵硬，蠕动迟缓和反应迟钝等现象；暴露于高浓度的二甲苯中(二甲苯≥300mg/kg)，蚯蚓在土壤表面剧烈挣扎，分泌体液和身体断裂等现象。蚯蚓死亡率随着二甲苯浓度的升高及暴露时间的延长均增加。
51.由图1可知，二甲苯对蚯蚓有急性毒性作用，且具有显著的剂量
ꢀ‑
效应关系。通过单位概率回归分析法得到二甲苯对蚯蚓的24h和48h 半致死浓度lc
50
分别为300.23mg/kg和221.62mg/kg(具体结果见表1)。
52.实施例2：
53.一种测定土壤中挥发性有机物对土壤生物
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蚯蚓的急性毒性测试方法，包括以下步骤：
54.s1.蚯蚓清肠
55.在底部铺有一层滤纸的1l平底烧杯中加入少量超纯水，以刚浸没滤纸为宜。将蚯蚓放在滤纸上，用塑料薄膜封口并扎孔，将烧杯放入温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱，避光培养，清肠24h。
56.蚯蚓为赤子爱胜蚓(eisenia fetida)，蚯蚓为湿重在300
‑
600mg、 3月龄以上身体前端出现鞍状或环带状生殖带、体态正常的健康蚯蚓。
57.s2.标准土壤染毒
58.称取10g烘干的标准土壤于特制的密封管(特制密封管为有底玻璃管(内径2.6cm
×
高8cm)中，然后将三氯乙烯快速且均匀地滴入标准土壤中(三氯乙烯的加入浓度根据预实验中蚯蚓不死及完全死亡的浓度，设置0mg/kg，4000mg/kg，5000mg/kg，6000mg/kg，7000mg/kg 和8000mg/kg这5个浓度)，并用去离子水将水土重量比调整为1：4，迅速用铝箔纸封口。将密封后的密封罐放入温度为20
±
2℃，湿度 70％
‑
90％的人工气候箱，避光培养，平衡处理24h。用封口膜将铝箔纸紧密贴在密封管壁上，防止挥发。
59.s3.正式实验
60.平衡24h后，快速将土搅拌，每个密封管放入1条已清肠24h的蚯蚓，再次封口，置于温度为20
±
2℃，湿度70％
‑
90％的人工气候箱中，避光培养48h，于24h和48h分别记录受试蚯蚓的毒性效应参数，每个浓度处理重复10次。
61.s4.实验结果
62.在整个实验过程中，空白对照组(即标准土壤中)未出现蚯蚓死亡和不适现象，证
明实验生物和实验条件符合质量控制标准，毒性实验结果可信。
63.实验结果表明，暴露于低浓度的三氯乙烯中(三氯乙烯 <6000mg/kg)，蚯蚓出现身体僵硬，蠕动迟缓和反应迟钝等现象；暴露于高浓度的三氯乙烯中(三氯乙烯≥6000mg/kg)，蚯蚓在土壤表面剧烈挣扎，分泌体液和身体断裂等现象。蚯蚓死亡率随着三氯乙烯浓度的升高及暴露时间的延长均增加。
64.由图2可知，三氯乙烯对蚯蚓有急性毒性作用，且具有显著的剂量
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效应关系。通过单位概率回归分析法得到三氯乙烯对蚯蚓的24h 和48h半致死浓度lc
50
分别为5332.36mg/kg和4522.41mg/kg(具体结果见表1)。
65.表1.二甲苯和三氯乙烯对蚯蚓的急性毒性
[0066][0067][0068]
挥发性有机物毒性评价标准为表2化学物质急性毒性经皮肤暴露分级标准。
[0069]
表2.急性毒性分级标准
[0070][0071]
根据化学物质急性毒性经皮肤分级标准可知(见表2)，二甲苯对蚯蚓的毒性为高毒级，三氯乙烯对蚯蚓的毒性为低毒级。
[0072]
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。