基于代谢组学的食管癌早期筛查标志物及其试剂盒的制作方法

1.本发明属于医药生物技术领域，具体公开了基于代谢组学的食管癌早期诊断标志物及其试剂盒。


背景技术：

2.食管癌是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一。据2018年世界卫生组织(who)最新资料显示,全球每年新发食管癌病例57万人，死亡约51万人，位居全球范围内肿瘤发病率第七位和死亡率第六位。国家癌症中心统计发布的2015年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析中显示，我国新发食管癌病例占世界的一半。
3.由于食管癌起病非常隐匿,早期发现和诊断极为困难，临床上首诊患者多为中晚期，导致治疗预后不理想，5年生存率偏低。且随着人口基数的不断增大和食管癌期望寿命的延长，庞大的食管癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，是肿瘤预防及控制的重点。
4.目前，胃镜是临床诊断食管癌最有效的检查,各种胃镜技术的开展对食管癌早期诊断有重要贡献。但胃镜普查存在很多局限性，一是对胃镜医师操作经验的要求较高；存在被检查者耐受性差的问题；二是在无症状人群中存在胃镜活检操作盲目、不规范的现象；三是胃镜在食管癌高发区无症状人群筛查中食管癌和各类癌前病变的检出率均较低，这些原因使得胃镜检查很难在食管癌高发区的无症状人群中大范围开展。如果能找到一项无创性的食管癌检测手段，即对于预测食管癌患病风险具有较高特异性和敏感性的分子靶标对食管癌的早期发现、高危人群预警和精准筛查都具有十分重要的意义。
5.食管癌发生是一个复杂的多因素、多阶段的过程，其确切发病机制尚不明确。但有研究发现，血液代谢组学为筛查新的食管癌生物标记物提供了可能，在食管癌患者和非食管癌患者中，代谢产物的表达水平有明显差异。体现了代谢组学分析血液代谢物在食管癌早期诊断中的巨大潜力。
6.随着代谢组学技术的飞速发展，食管癌大规模的关联研究大量涌现，发现了一批食管癌高表达代谢产物，为无症状高危人群预警和精准筛查、食管癌早期诊断奠定了坚实基础。然而目前还没有有效的食管癌早期诊断和普查的制剂，若能筛选出食管癌高表达代谢产物作为生物标志物，对我国食管癌早期诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选及精准治疗开辟新的途径。


技术实现要素：

7.针对现有技术总存在的问题和不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于食管癌筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供用于食管癌筛查的标志物的检测试剂在制备食管癌筛查产品中的应用，本发明的目的之三旨在提供一种用于食管癌筛查的试剂盒。
8.为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
9.本发明第一方面提供了一种用于食管癌筛查的标志物，所述标志物为mg(22:6)、
尿刊酸(urocanic acid)、蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、3
‑
羟基丁酸(3
‑
hydroxybutyrate)中的至少一种。
10.根据上述的标志物，优选地，所述标志物为血清标志物。
11.本发明第二方面提供了一种上述第一方面所述标志物的检测试剂在制备用于食管癌筛查产品中的应用。
12.根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为血清。
13.根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为通过色谱法、质谱法或色谱
‑
质谱联用法检测样本中所述标志物的试剂。
14.根据上述的应用，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法。
15.根据上述的应用，优选地，所述色谱
‑
质谱联用法为气相色谱
‑
质谱联用法、液相色谱
‑
质谱联用法、高效液相色谱
‑
质谱联用法、气相色谱
‑
串联质谱联用法、液相色谱
‑
串联质谱联用法或高效液相色谱
‑
串联质谱联用法。
16.本发明第三方面提供了一种用于食管癌筛查的试剂盒，所述试剂盒含有检测上述第一方面所述标志物的检测试剂；所述标志物为mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸中的至少一种。
17.根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过色谱法质谱法或色谱
‑
质谱联用法检测样本中的所述标志物的试剂。
18.根据上述的试剂盒，优选地，所述色谱法为气相色谱法、液相色谱法或高效液相色谱法；所述色谱
‑
质谱联用法为气相色谱
‑
质谱联用法、液相色谱
‑
质谱联用法、高效液相色谱
‑
质谱联用法、气相色谱
‑
串联质谱联用法、液相色谱
‑
串联质谱联用法或高效液相色谱
‑
串联质谱联用法。
19.根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还含有上述第一方面所述标志物的标准品。
20.根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒的检测样本为血清。
21.与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
22.(1)本发明通过代谢组学的方法首次发现mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸这四种物质能够用于食管癌早期筛查检测，通过检测人血清中mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸的表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌；经验证，本发明单独采用mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸中任意一个标志物进行食管癌筛查时，roc曲线的auc值均在0.7以上；多个标志物联合使用时，roc曲线的auc值比单个指标更接近于1，区分效果好，诊断效果好。因此，本发明用于食管癌筛查的标志物可用于食管癌的早期筛查。
23.(2)本发明将mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四种标志物作为一个组合用于早期食管癌筛查检测时，其检测灵敏度高达90.8％(即早期食管癌患者中应用这四个标志物进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为90.8％)，特异度达到了92.3％(即非食管癌患者中应用这四个标志物进行诊断时确定为未患食管癌者的比率为92.3％，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率(2％
‑
3％)，可用于食管癌
高发区无症状高危人群人群的大规模筛查，同时也为实现食管癌高发区无症状高危人群长期跟踪提供重要的检测手段，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为食管癌患者和家庭带来极大的福祉。
24.(3)本发明用于食管癌筛查的试剂盒的检测样本为血清，需血量少，群众痛苦小、接受度高；而且，操作简单，检测出结果时间短，具有广阔的市场前景和社会效益。
附图说明
25.图1为正常对照组和食管癌组正负离子模式下pca、pls
‑
da的得分图。a为正离子模式下pca得分图，b为负离子模式下pca得分图，c为正离子模式下pls
‑
da得分图，d为负离子模式下pls
‑
da得分图；
26.图2为分别采用mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
27.图3为3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
28.图4为3
‑
羟基丁酸和尿刊酸组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
29.图5为3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
30.图6为3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
31.图7为3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
32.图8为3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图；
33.图9为3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌组和正常对照组的roc曲线图。
具体实施方式
34.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
35.下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
36.实施例1：食管癌血清差异代谢标志物的筛选
37.1、实验样本
38.按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的30例健康受试者(正常对照组)和70例食管癌患者(食管癌组)。
39.30例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的正常体检人群，无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的
参考范围内。30例正常人中，男性10例，女性6例，平均年龄58.9
±
6.3岁，年龄范围40
‑
70岁。
40.70例食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期 i期)食管癌患者，均未接受放疗或化疗治疗，无其他全身性重大疾病；无长期用药的慢性病史。70例食管癌患者中，男性48例，女性32例，平均年龄58.5
±
7.0岁，年龄范围45
‑
75岁。
41.2、实验方法
42.(1)血清样本的采集及储存：
43.采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30
‑
60min，待血液凝固，以2000rpm的速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入
‑
80℃冰箱储存备用。
44.(2)主要试剂：
45.甲醇及乙腈(uplc纯)购于美国merk公司，色谱级甲酸及乙酸铵购于美国roe公司；去离子水由美国密理博(millipore)公司的milli
‑
q超纯水系统制备；内标l
‑
2氯苯丙氨酸购于上海麦克林生化科技有限公司，酮洛芬购自中国食品药品检定研究院。
46.(3)uplc
‑
q/tof
‑
ms检测：
47.a)色谱条件：
48.仪器：液相色谱agilent 1290 infinity uplc；
49.色谱柱：waters acquity uplc@hss t3(1.8um 100*2.1mm)，流速：0.4ml/min，柱温：40℃，流动相：a
‑
0.1％甲酸溶液和b
‑
乙腈(0.1％甲酸)，进样量：4ul，多步梯度洗脱。多步梯度洗脱条件如下：
[0050][0051]
b)质谱条件：
[0052]
仪器：质谱agilent 6530uhd and accurate
‑
mass q
‑
tof/ms；
[0053]
电喷雾离子源(esi)，采用正、负离子模式同时采集数据。干燥气：氮气，温度：350℃，流速：11l\min，雾化气压：45psi；毛细管电压：4000v；碎裂电压120v；分离器电压：60v；质量采集范围100
‑
1000m/z。
[0054]
c)样本处理：
[0055]
在代谢组学分析前，室温下解冻所有样品，取50μl的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μl，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μl分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(l
‑2‑
氯苯丙氨酸)的甲醇100μl或含有内标液(酮洛芬)的甲醇100μl进行复溶，l
‑2‑
氯苯丙氨酸、酮洛芬的终浓度分别为100ng/ml、1μg/ml，分别作为正负离子模式检测样本。复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液质小瓶
中进行uplc
‑
q/tof
‑
ms检测。
[0056]
(3)数据处理及分析
[0057]
1)数据的前处理
[0058]
基于uplc
‑
q
‑
tof/ms得到的数据，在r软件平台下采用xcms程序代码进行峰的提取，对齐和反卷积分析，并根据80％原则进行峰的筛选，得到包含变量(保留时间rt，质荷比m/z)、观测和峰强的三维可视化矩阵，将此数据矩阵导入simca
‑
p软件(版本13.0)进行多变量统计分析。
[0059]
2)多变量统计分析
[0060]
为了考察各组与对照组相比代谢的变化，我们采用无监督的pca和有监督的pls
‑
da的分析方法来表征差异。
[0061]
a)主成分分析(pca)：pca为无监督模式识别方法，可对未知类别的样品进行分类且对离群点比较敏感，可用于考察不同组的样本是否存在差异以及lc
‑
ms系统是否稳定。将70例食管癌患者组和30例正常对照组血清样本导入simca
‑
p软件(版本13.0)进行pca统计分析，共获得37个主成分。正离子模式下，22个主成分，所得模型累积解释率r2x＝0.689，预测率q2＝0.37；其得分图(score plot)如图1中a所示。负离子模式下，15个主成分，所得模型累积解释率r2x＝0.632，预测率q2＝0.38，其得分图(score plot)如图1中b所示。
[0062]
b)偏最小二乘法(pls
‑
da)：进一步采用监督模式识别方法将食管癌患者组合正常对照组血清样本导入simca
‑
p软件(版本13.0)进行pls
‑
da统计分析，共获得6个主成分。正离子模式下，3个主成分，r2x＝0.328，r2y＝0.984，q2＝0.974)，其得分图(score plot)如图1中c所示。负离子模式下pls
‑
da得分图，3个主成分，r2x＝0.378，r2y＝0.99，q2＝0.982)。其得分图(score plot)如图1中d所示。
[0063]
3)基于uplc
‑
q
‑
tof/ms检测食管癌组和正常对照组之间差异性代谢产物的挖掘及鉴定：
[0064]
由图1可以看出，食管癌组和正常对照组有一定的分离趋势。pls
‑
da的拟合度和预测能力均良好。我们采用食管癌组和正常对照组pls
‑
da模型下的vip值与单因素统计分析的p值相结合，vip>1.0且p<0.05的变量认为有显著差异性，有显著差异性的变量认为是差异代谢生物标志物。
[0065]
筛选出的差异变量，需要归属其所代表的生物标志物。基于uplc
‑
q
‑
tof/ms技术的代谢物鉴定主要是通过代谢物谱库进行匹配：在uplc
‑
q
‑
tof/ms总离子流图上找到差异变量的质谱图，将差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比，比如hmdb(http://www.hmdb.ca)，metlin(http://metlin.scripps.edu)和kegg(http://www.kegg.jp)，初步鉴定上述差异代谢物的结构，最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级ms裂解谱比对，确定差异代谢物的结构，并配制已知浓度的系列标准品溶液，通过标准曲线进一步确定差异代谢物含量。
[0066]
3、实验结果
[0067]
按照上述思路，最终鉴定出4个区分食管癌组和正常对照组的差异代谢物，具体如表1所示。与正常对照组相比，食管癌组患者血清中mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸的含量上调。
[0068]
表1基于lc
‑
ms检测的食管癌组和正常对照组的差异代谢物统计数据分析结果
[0069]
编号差异代谢物分子式vipp值倍值1mg(22:6)c25h38o41.690.0420.362尿刊酸c6h6n2o21.360.0151.433蛋氨酸亚砜c5h11no3s1.380.0121.8843
‑
羟基丁酸c4h8o31.590.0001.59
[0070]
实施例2：差异代谢物诊断区分食管癌患者和健康人的能力评估
[0071]
1、单个差异代谢物诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0072]
基于实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸的含量数据进行分析，采用受试者工作曲线(roc曲线)来评估每一种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的能力。
[0073]
mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸单独诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线如图2所示。根据roc曲线统计各差异代谢物的roc曲线的曲线下面积auc、灵敏度和特异度，结果如表2所示。
[0074]
表2四种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的auc
[0075]
编号差异代谢物auc灵敏度特异度1mg(22:6)0.77354.3％90.0％2尿刊酸0.79855.7％90.0％3蛋氨酸亚砜0.83170.0％80.0％43
‑
羟基丁酸0.86480.0％90.0％
[0076]
roc曲线的曲线下面积auc作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，auc为0.5时，即无诊断意义；auc在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；auc在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；auc＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。由图2和表1可知，mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四个标志物单独用于区分食管癌患者和正常人的roc曲线的auc均能达到0.7以上，表明mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜或3
‑
羟基丁酸能够单独诊断区分食管癌患者和正常人，且具有较好的准确性。
[0077]
进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的代谢物相对含量为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，具体如表3所示。
[0078]
表3四种差异代谢物单独诊断区分食管癌患者和正常人的约登指数和截断值
[0079]
编号差异代谢物约登指数最佳截断值1mg(22:6)0.4430.7162尿刊酸0.4570.6703蛋氨酸亚砜0.5000.61543
‑
羟基丁酸0.7000.564
[0080]
2、多个差异代谢物组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0081]
(1)3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0082]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30
例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝mg(22:6)相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
4.467 4.734x1 4.088x2；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图3所示。
[0083]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸和mg(22:6)组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.895，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.539。
[0084]
(2)3
‑
羟基丁酸和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0085]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸和尿刊酸的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝尿刊酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸和尿刊酸在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
6.275 6.918x1 4.275x2；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸和尿刊酸的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图4所示。
[0086]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.899，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.539。
[0087]
(3)3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0088]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝蛋氨酸亚砜相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
5.585 6.829x1 4.864x2；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图5所示。
[0089]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.906，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.524。
[0090]
(4)3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0091]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30
例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝mg(22:6)相对含量，x3＝尿刊酸)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
9.508 7.582x1 0.444x2 9.810x3；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图6所示。
[0092]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.915，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.515。
[0093]
(5)3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0094]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝蛋氨酸亚砜相对含量，x3＝尿刊酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
8.977 6.074x1 6.445x2 4.457x3；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图7所示。
[0095]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和尿刊酸组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.931，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.515。
[0096]
(6)3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0097]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)的相对含量作为自变量(设x1＝3
‑
羟基丁酸相对含量，x2＝蛋氨酸亚砜相对含量，x3＝mg(22:6)相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
12.920 7.417x1 9.490x2 6.209x3；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图8所示。
[0098]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸、蛋氨酸亚砜和mg(22:6)组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.928，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算
约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.515。
[0099]
(7)3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌患者和正常人的能力：
[0100]
以实施例1中uplc
‑
q
‑
tof/ms检测的食管癌组(70例食管癌患者)和正常对照组(30例正常人)血清样本中3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜的相对含量作为自变量(设x1＝mg(22:6)相对含量，x2＝尿刊酸相对含量，x3＝蛋氨酸亚砜相对含量，x4＝3
‑
羟基丁酸相对含量)，以组别(食管癌组和正常对照组)作为应变量，对3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜在食管癌组和正常对照组血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：logit[p]＝
‑
14.585 8.281x1‑
1.469x2 11.017x3 8.563x4；再将各血清样本中3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜的相对含量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异度，然后根据计算得到的灵敏度和特异度绘制roc曲线，roc曲线如图9所示。
[0101]
由roc曲线可知，3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸和蛋氨酸亚砜组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线下面积auc为0.967，具有较高的准确性。进一步根据roc曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度 特异度
‑
1)，约登指数最大时对应的logit[p]值为诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值，最佳截断值为0.515。
[0102]
将上述单个、多个差异代谢物组合诊断区分食管癌患者和正常人的roc曲线auc值、灵敏度、特异度、约登指数和最佳截断值进行统计，具体如表4所示。
[0103]
表4不同差异代谢物组合用于诊断区分食管癌患者和正常人的auc值
[0104][0105]
由表4可知，与单一差异代谢物相比，采用3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜中任意两种差异代谢物联合诊断区分食管癌患者和正常人时，其roc曲线的auc均能达
到0.89以上，auc明显高于单一差异代谢物诊断；采用3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜中任意三种差异代谢物联合诊断区分食管癌患者和正常人时，其roc曲线的auc均能达到0.9以上；当采用3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜四种标志物联合诊断区分食管癌患者和正常人时，其roc曲线的auc达到最大为0.967，且食管癌诊断的灵敏度和特异度也达到了最高，分别为90.8％、92.3％；由此说明，四个差异代谢物联合用于食管癌诊断时，诊断效果最佳。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0～1，约登指数越接近于1，其诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。随着差异代谢物组合数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，其中，3
‑
羟基丁酸、mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜四种标志物组合时，其约登指数达到最大为0.831，表明4种标志物组合用于诊断食管癌的方法具有较好的诊断价值。
[0106]
实施例3：四种差异代谢物在食管癌筛查中的应用
[0107]
1、血清样本的采集
[0108]
按严格的筛选和排除标准收集郑州大学第一附属医院经过年龄与性别匹配的50例健康受试者(正常对照组)和50例食管癌患者(食管癌组)。
[0109]
健康受试者的入组标准为：无心血管、呼吸、肝脏、肾脏、胃肠道、内分泌、血液、精神、或神经系统疾病以及上述疾病病史，无急性或者慢性疾病，无任何肿瘤相关的证据，无药物过敏史，筛选时临床实验室检查结果在正常的参考范围内。
[0110]
食管癌患者的入组标准为：经过内镜确定和组织病理学证实的食管癌患者，均未接受放疗或化疗治疗；无其他全身性重大疾病；无长期用药的慢性病史。
[0111]
2、实验方法
[0112]
血清样本的采集及储存：采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30
‑
60min，待血液凝固，以2000rpm的速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入
‑
80℃冰箱储存备用。
[0113]
3、分析方法
[0114]
按照实施例1所述的uplc
‑
q
‑
tof/ms实验方法对50例食管癌患者血清和50例正常人血清进行四种代谢物(mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸)的定性与定量测定。
[0115]
其中，单独采用mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜或3
‑
羟基丁酸进行食管癌诊断时，根据血清样本中mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜或3
‑
羟基丁酸的含量与实施例2计算得到的对应差异代谢物的最佳截断值大小判断样本的阴性与阳性，若血清样本中差异代谢物的含量高于最佳截断值，则判断为食管癌患者，反之，则判断为正常人。
[0116]
采用mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四种代谢标志物中任意两种或三种或四种的组合进行食管癌诊断时，将血清样本中mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸含量代入实施例2对应组合的logistic回归方程中，根据计算得到的logit[p]值与实施例2计算得到的对应组合诊断区分食管癌患者和正常人的最佳截断值大小，判断样本的阴性与阳性，若组合的logit[p]值高于其对应的最佳截断值，则判断为食管癌，反之，则判断为正常人。
[0117]
3、检测结果
[0118]
100例血清样本的诊断结果如表5所示。由表5可知，单个差异代谢物或多个差异代谢物组合均可应用于食管癌的筛查；采用单个差异代谢物进行食管癌筛查时，其阳性预测
值能够达到80％以上，阴性预测值能够达到60％以上；而且，采用mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四种代谢标志物组合对100例样本的进行检测：阳性预测值为86.8％，阴性预测值为91.5％，预测的准确度最高。由此证明，本发明mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四种标志物组合对早期食管癌具有较好的筛查性能，可对早期食管癌进行较为准确的判断。
[0119]
表5四种代谢标志物组合诊断食管癌的结果
[0120][0121]
实施例4：基于本发明的代谢标志物的食管癌筛查试剂盒的制备
[0122]
基于本发明的筛选得到的4个与食管癌相关的代谢标志物，设计了食管癌筛查试剂盒，该试剂盒包括如下成分：
[0123]
标志物的标准品：mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸中的至少一种，该试剂盒可以包含其中一种、或者任意多种、或者4种代谢标志物的标准品，可以根据需求进行组合。当涉及一种以上代谢标志物的标准品时，可以将各个标志物的标准品单独封装，也可以将各个标志物的标准品混合制成混合物封装。
[0124]
进一步地，该试剂盒还含有血清代谢物提取溶剂——甲醇，含有采用uplc
‑
q/tof
‑
ms检测过程采用的流动相试剂(流动相试剂与实施例1色谱检测过程采用的流动相试剂相同)。
[0125]
试剂盒使用过程：收集受试者血清于
‑
80℃冰箱冻存，实验前将血清样本在4℃冰箱中解冻后，取50μl的血清样本，然后加入3倍量的甲醇150μl，涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min。吸取离心过后的上清液各75μl分别放入到2个1.5ml离心管中，利用氮吹仪将上清液吹干，吹干后再分别利用含有内标液(l
‑2‑
氯苯丙氨酸)的甲醇100μl进行复溶，复溶后再涡旋30s进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，13000rpm条件下离心10min，吸取离心过后的上清液，后将上清液放置于液
质小瓶中进行uplc
‑
q/tof
‑
ms检测。
[0126]
uplc
‑
q/tof
‑
ms检测是按照实施例1的uplc
‑
q
‑
tof/ms仪器设定方法对处理后的血清样本进行分析，并参照实施例1数据处理方法对标志物进行定量与定性分析。
[0127]
使用此食管癌检测试剂盒时，建议同时检测mg(22:6)、尿刊酸、蛋氨酸亚砜、3
‑
羟基丁酸四个标志物，以进一步提高检测效能。
[0128]
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的不足，且具高度产业利用价值。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。