一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒及其制备方法与流程

一种检测人分拣微管连接蛋白17的elisa试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种检测人分拣微管连接蛋白17的elisa试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.分拣微管连接蛋白17(sorting nexin 17，snx17)是分拣微管连接蛋白家族最具代表性成员，人源基因定位在2号染色体(2p23
‑
p2)，分子量为52.9kda，肽链长度为470aa，分布于所有组织和多种不同类型的细胞，是存在于初级内体的一种衔接蛋白，负责调控多种细胞膜蛋白的转运和蛋白分选等重要细胞生物学过程。
3.snx17具有两个保守结构域：phox同源结构域(phox
‑
homology domain,px domain)和ferm(4.1r/ezrin/radixin/moesin
‑
like domain)结构域。px结构域大多由3个β折叠伴随3个α螺旋构成，在它们第一和第二个螺旋之间富含脯氨酸的环状结构域，能够直接结合磷酸肌醇的磷酸。px结构域主要的结合靶点为磷脂酰肌醇
‑3‑
磷酸(ptdlns3p，pi3p)，通过与pi3p的相互结合，将snx17募集定位于早期内体膜上，进而引导调节不同的细胞过程，包括胞吞作用、内体分选和货物运输。ferm结构域由4.1r蛋白、埃兹蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)与膜突蛋白(moesin)4个成员组成，与多种膜蛋白中的
“‑
npxy
‑”
基序具有高亲和力，因此snx17通过ferm结构域与
‑
npxy
‑
基序的相互作用进而绑定蛋白质，参与膜蛋白的转运和蛋白质的分选。同时ferm结构域还是snx17与p选择素的羧基端相互作用的关键部位，可以调节众多膜相关因子及下游信号分子，参与细胞形态构建及信号转导。
4.snx17通过两个保守结构域从而与多种疾病的发生和发展相关联。t细胞活化的关键成分是受体向细胞表面的内体再循环，从而允许信号和抗原识别的持续整合。而snx17通过其ferm结构域与tcr和lfa
‑
1相互作用从而防止tcr和lfa
‑
1在溶酶体中的积累和降解，进而促进tcr和lfa
‑
1的循环利用，并最终影响t细胞的活化以及抗原刺激后细胞间的相互作用，从而使免疫突触处的t细胞活化达到最佳状态。
5.snx17作为胞内蛋白广泛存在于肌细胞中，在心肌梗死中通过抑制serca2a蛋白的溶酶体降解途径从而保留功能性serca2a蛋白来产生抗心律失常作用，提示snx17在心肌梗死中可作为一种内源性抗心律不齐因子。snx17还与jag1a和krit1蛋白相互作用促进其再循环。而jag1a蛋白是notch信号通路成员，此信号通路涉及斑马鱼神经发生和胰腺发育。而snx17和krit1之间的联系，和脑内发生的海绵状血管瘤的畸形密切相关。此外，snx17还可能参与重症肌无力的发病机制。研究表明snx17的ferm结构域能识别低密度脂蛋白受体家族如lrp1的蛋白胞内区域，促进相关受体蛋白的高效重复利用。并有研究也证明了snx17与lrp4存在相互作用关系，而lrp4抗体是诱导重症肌无力发生的关键抗体之一。
6.因此，snx17作为多种疾病研究中的相关因子，通过定量检测组织匀浆或血清样本中snx17的含量不仅有助于相关疾病致病机制的研究而且还具有作为疾病生物标志物的潜在功能。目前尚无文献报道针对组织匀浆或血清样本中snx17的含量提供一种准确、简便、
灵敏度高的检测手段。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种检测人分拣微管连接蛋白17(snx17)的试剂盒，该试剂盒可定量检测人血清或组织匀浆中的snx17，不仅有助于开展snx17参与的相关疾病致病机制研究，而且其检测到的snx17还具有作为疾病生物标志物的潜在功能，可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。
8.本发明的目的之二在于提供检测人分拣微管连接蛋白17的试剂盒的制备方法。
9.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
10.一种检测人分拣微管连接蛋白17(snx17)的elisa试剂盒，所述试剂盒中包括已包被抗体的酶标板、酶标抗体，所述包被抗体为鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。
11.进一步地，所述包被抗体的浓度为2μg/ml，酶标抗体的稀释比例为1:400。
12.进一步地，所述试剂盒中还包括人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、tmb显色液、反应终止液。
13.进一步地，所述样品稀释液为1
×
磷酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％pbst溶液，反应终止液为2m h2so4。
14.进一步地，所述试剂盒的检测对象为人血清或组织匀浆。
15.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
16.检测人分拣微管连接蛋白17的elisa试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品的制备：将人分拣微管连接蛋白17质粒转化入表达菌，向表达菌中加入诱导剂诱导人分拣微管连接蛋白17表达，然后从诱导表达的菌液中提取表达得到的人分拣微管连接蛋白17、纯化、透析、冷冻干燥得到人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品；优选地，诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(iptg)。
18.(2)抗体的包被过程为：将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体包被酶标板，孵育、封闭，即得已包被抗体的酶标板；
19.(3)酶标抗体的制备：采用改良naio4标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体；
20.(4)组装试剂盒：将步骤(2)的已包被抗体的酶标板、步骤(3)的酶标抗体与步骤(1)得到的人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、tmb显色液、反应终止液组装成elisa试剂盒。
21.进一步地，所述步骤(1)人分拣微管连接蛋白17质粒由以下过程得到：将菌液中带有his标签载体为pet
‑
28a的人分拣微管连接蛋白17原核表达质粒进行质粒扩增、提取，即得人分拣微管连接蛋白17质粒。
22.进一步地，步骤(3)改良naio4标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体的过程为：
23.a.将辣根过氧化物酶溶于双蒸水中，向其中加入naio4溶液，室温搅拌得到棕绿色溶液1；
24.b.向步骤a得到的溶液1中加入乙二醇放置后得到蓝色溶液2，置于醋酸钠缓冲液
中透析过夜；
25.c.向透析后的溶液2中加入na2co3缓冲液调节溶液ph为9
‑
9.5，立即加入兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体得到溶液3，放置过夜；
26.d.向溶液3中加入nabh4溶液，放置后得到溶液4，然后进行透析过程；
27.e.向透析后的溶液4中加入中性甘油，得到辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。
28.所述包被抗体的浓度及酶标抗体的稀释比例的筛选过程为：
29.a.将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体稀释至不同浓度，包被酶标板，每一浓度分别包被三个纵、横行；
30.b.甩干酶标板中的包被抗体，加入5％牛血清白蛋白封闭过夜；
31.c.将人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品稀释至不同浓度作为抗原液，分别加入到步骤b的酶标板的横行中进行孵育；
32.d.甩干抗原液，洗涤，向步骤c的酶标板纵行中加入不同稀释比例的辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体进行孵育；
33.e.甩干酶标抗体，洗涤，向酶标板每孔加入tmb显色液、反应终止液，酶标仪读取od值，筛选得到包被抗体的浓度和酶标抗体的稀释比例。
34.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
35.本发明提供了一种检测人分拣微管连接蛋白17的elisa试剂盒，该检测试剂盒为双抗体夹心法elisa试剂盒，可用于定量检测人血清或组织匀浆样本中的snx17，具有操作简单、特异性强、重复性好、敏感度高等优点。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，该方法制备得到的定量检测snx17的elisa试剂盒不仅有助于开展snx17参与的相关疾病致病机制研究，且检测到的snx17还具有作为疾病生物标志物的潜在功能，可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。
附图说明
36.图1为本发明未诱导的含snx17质粒的rosetta表达菌菌液蛋白和iptg诱导snx17大量表达的rosetta表达菌菌液蛋白的sds
‑
page凝胶电泳图；
37.图2为本发明8m尿素变性条件下his标签snx17蛋白纯化效果图，其中cl为细菌裂解液，ft为上样穿流液；w1
‑
w3为变性裂解液洗涤1
‑
3；w4
‑
w8为变性洗涤液洗涤；e1
‑
e4为洗脱液1
‑
4；
38.图3为本发明纯化的纯化的snx17蛋白与鼠源抗snx17单克隆抗体、兔源抗snx17多克隆抗体的western blot图；
39.图4为本发明制备得到的的snx17蛋白冻干粉数码照片；
40.图5为本发明不同浓度的snx17抗原液的od值标准曲线图；
41.图6为本发明elisa试剂盒检测正常人、重症肌无力患者和肌炎患者血清中snx17含量的统计图(*p<0.05)。
具体实施方式
42.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不
相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
43.实施例
44.一种检测人分拣微管连接蛋白17(snx17)的elisa试剂盒，试剂盒中包括已包被抗体的酶标板、酶标抗体、snx17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、tmb显色液、反应终止液。
45.其中包被抗体为鼠源抗snx17单克隆抗体；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔源抗snx17多克隆抗体；snx17蛋白标准品为snx17蛋白冻干粉；样品稀释液为1
×
磷酸盐缓冲液；洗涤液为0.05％pbst溶液；tmb显色液主要成分为四甲基联苯胺；反应终止液为2mh2so4。
46.一种检测snx17的elisa试剂盒的制备方法：
47.1.snx17蛋白标准品的制备：
48.(1)snx17质粒的扩增：从优宝生物有限公司订购带有his标签载体为pet
‑
28a的snx17原核表达质粒，取50μl菌液加入含40mg/l卡那霉素的lb培养基中，放入180rpm/37℃摇床过夜进行质粒扩增。
49.(2)snx17质粒的提取：取5ml步骤(1)过夜培养的菌液，根据质粒提取试剂盒(天根质粒小提试剂盒dp103)说明书提取质粒。
50.(3)snx17质粒的转化：取100ng步骤(2)提取的snx17质粒，将其加入至100μl rosetta表达菌液中并混匀，冰水浴30min，42℃热击60s，然后再冰水浴2min，加入500μl的lb培养基，放入200rpm/37℃摇床1h，之后取转化菌涂布于含有40mg/l卡那霉素的lb固体培养板，37℃生长16h以后挑选单菌落扩大培养。
51.(4)snx17的诱导表达：
52.a.取步骤(3)转化有snx17质粒的rosetta表达菌液2ml，12000rpm离心1min后去上清，此时为未大量诱导snx17表达的rosetta表达菌，用100μl的1
×
buffer重悬，100℃煮样10min，12000rpm离心5min取上清，获得蛋白。
53.b.其余菌液按1:100的比例加入到含40mg/l卡那霉素的lb培养基中，280rpm/37℃摇床2h后，加入浓度为0.5mmol/l的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，180rpm/18℃摇床15h，促进snx17的大量表达。15h后取2ml被诱导表达的菌液按照步骤a中方法获取蛋白。
54.c.使用sds
‑
page电泳对两组蛋白进行验证：配制5％浓缩胶、10％分离胶，获得的两组蛋白以每孔20μg的蛋白量上样，分别以90v/30min、120v/60min电泳，电泳后的凝胶放入考马斯亮蓝中染色2h，再放入洗脱液中进行脱色，直至看见清晰的条带，以验证snx17是否大量表达。
55.结果如图1所示，相比于未诱导组，加入iptg诱导剂后snx17大量表达。
56.(5)snx17蛋白的提取：取步骤(4)大量诱导表达snx17的菌液以2000rpm离心20min，去上清，加入20ml的8m尿素变性裂解缓冲液，使用高压细胞破碎仪破碎裂解后，4℃ 12000rpm离心25min，上清即为细菌裂解液(cell lysate)。
57.(6)snx17蛋白的纯化：步骤(5)获得的细菌裂解液取20μl留作后续检测用使用，其余裂解液使用碧云天的beyogold
tm
his
‑
tag purification resin(耐变性剂型)(产品编号：p2233)对snx17蛋白进行纯化，步骤严格按照产品说明书中“变性条件下his标签蛋白的大量纯化”进行，最终得到上样穿流液(flow through)、变性裂解液、变性洗涤液(变性裂解液
添加20mm咪唑)、洗脱液(变性裂解液添加250mm咪唑)，获得的洗脱液即为纯化的his标签蛋白样品。
58.(7)snx17蛋白的鉴定：将上述获得的各组分用sds
‑
page电泳进行验证，方法如上所述。结果如图2所示，洗脱液中含有snx17蛋白，证明纯化成功。
59.(8)western blot对纯化的snx17蛋白与鼠源抗snx17单克隆抗体、兔源抗snx17多克隆抗体进行特异性结合验证：
60.a.对步骤(6)获得的洗脱液用bca法进行蛋白定量，之后加入蛋白上样缓冲液，100℃煮样10min，配制5％浓缩胶、10％分离胶，以每孔20μg的蛋白量上样，分别以90v/30min、120v/60min进行电泳。
61.b.取出电泳后的凝胶，在55kd附近剪裁合适宽度的凝胶，对应凝胶大小剪裁pvdf膜，甲醇激活15s，之后放入转膜液平衡5min，将海绵、厚滤纸用转膜液浸湿后，按照正极板—海绵—厚滤纸—pvdf膜—凝胶—厚滤纸—海绵—负极板的顺序装好后置于转膜槽，倒入转膜液置于冰水浴中200ma转膜1h。
62.c.转膜后的pvdf膜用0.05％tbst配置的5％脱脂奶粉室温封闭2h，之后分别与用0.05％tbst以1:500稀释的鼠源抗snx17单克隆抗体(santa cruz，sc
‑
166957)、1:2000稀释的兔源抗snx17多克隆抗体(proteintech，10275
‑1‑
ap)孵育，于4℃过夜。
63.d.一抗孵育后用0.05％tbst洗膜3次，每次10min，分别加入用0.05％tbst以1:5000稀释的hrp标记山羊抗小鼠igg(鼎国昌盛，ih
‑
0031)、hrp标记山羊抗兔igg(鼎国昌盛，ih
‑
0011)，室温孵育2小时。
64.e.二抗孵育后用0.05％tbst洗膜3次，每次10min，将ecl试剂盒a液与b液1:1混合，将混合液滴加在膜条上，混匀孵育后立即曝光显影。
65.结果如图3所示，使用鼠源抗snx17单克隆抗体和兔源抗snx17多克隆抗体孵育，其均能显示出特异性条带，表明纯化的snx17蛋白可以与鼠源抗snx17单克隆抗体、兔源抗snx17多克隆抗体进行特异性结合。
66.(9)snx17蛋白冻干粉的制备：收集获得的洗脱液，置于双蒸水中4℃透析48h，期间更换双蒸水2～3次，收集透析后的snx17蛋白置于
‑
80℃冰箱中冷冻，待完全冻实后放入真空冷冻干燥机中制备冻干粉，即得snx17蛋白标准品。图4为制备得到的snx17蛋白冻干粉数码照片，烧杯底部的白色粉末即为snx17蛋白冻干粉。
67.2.抗体的包被过程为：将鼠源抗snx17单克隆抗体(购自santa cruz公司，sc
‑
166957)用1
×
碳酸盐缓冲液配制成2μg/ml后包被酶标板，于4℃孵育过夜后甩干，用5％bsa封闭过夜，即完成将鼠源抗snx17单克隆抗体包被到酶标板上。
68.3.酶标抗体的制备
69.本发明采用改良naio4法制备得到酶标抗体—辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔源抗snx17多克隆抗体，具体步骤如下：
70.a.称取1mg hpr溶于1ml双蒸水中，取200μl hpr与双蒸水的混合溶液，向其中加入200μl新配的0.1mol/l naio4，室温中轻搅拌20min，勿超时，溶液呈棕绿色(溶液1)。
71.b.向步骤a棕绿色溶液1中加入200μl乙二醇，放置20min溶液变蓝后得到溶液2，置于4℃、0.001mol/l醋酸钠缓冲液中透析过夜。
72.c.透析完成后的溶液中加入20μl 0.2mol/l na2co3缓冲液，使溶液ph提升至约9～
9.5后立即加入200μg待标记的兔源抗snx17多克隆抗体得到溶液3，于4℃过夜。
73.d.向溶液3中加入100μl新配制的4mg/ml nabh4溶液，4℃中放置2h后得到溶液4，于4℃、0.1mol/l的硼酸盐缓冲液中透析24h，其间更换缓冲液1～2次。
74.e.加入等量用0.1mol/l硼酸盐缓冲液配制的浓度为60％的中性甘油，于
‑
20℃中保存，即得试剂盒中的酶标抗体—hrp标记兔源抗snx17多克隆抗体。
75.4.棋盘滴定法选择包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度
76.a.鼠源抗snx17单克隆抗体用1
×
磷酸盐缓冲液稀释至抗体浓度分别为2μg/ml、1μg/ml和0.5μg/ml，包被酶标板，每一浓度分别包被三个纵、横行，每孔100μl(均作复孔)，4℃中过夜。
77.b.甩干酶标板中的包被抗体，加入100μl的5％bsa于4℃中封闭过夜，即完成将鼠源抗snx17单克隆抗体包被到酶标板上。
78.c.称取1mg snx17冻干粉用1ml的pbs溶解，分别稀释为50ng/ml(强阳性抗原液)、3ng/ml(弱阳性抗原液)、0ng/ml(阴性对照)的浓度，甩干封闭液，于每一横行中分别加入50μl的强阳性抗原液、弱阳性抗原液、阴性对照，37℃孵育1h。
79.d.甩干抗原液，用0.05％pbst洗涤5次，每次1min，于每一包被纵行中分别加入50μl按1:400、1:1200、1:3600稀释的hrp标记的兔源抗snx17多克隆抗体，37℃孵育1h。
80.e.甩干酶标抗体，用0.05％pbst洗涤5次，每次1min，每孔中加入50μl的tmb显色剂，37℃避光显色20～30min，加入2m h2so4终止反应，酶标仪450nm处读取od值。结果如表1所示。
81.表1
[0082][0083][0084]
选择强阳性抗原液od值在0.8左右、阴性对照od值小于0.1的组合为较理想的组合，用作后续包被抗体和酶标抗体的工作浓度，根据表1可得包被抗体浓度选用2μg/ml，酶标抗体的稀释比例选为1:400。
[0085]
实验例
[0086]
检测snx17的elisa试剂盒的评价
[0087]
1.称取1mg实施例制备得到的snx17蛋白标准品—snx17冻干粉，用1ml的pbs溶解后分别稀释至浓度为0、5、10、20、40、60、80、100ng/ml，得到不同浓度的snx17抗原液；
[0088]
2.选择年龄在18～60岁之间的正常人血清、重症肌无力患者血清和肌炎患者血清各6例，每组男女比为1:1，所有血清按1:10进行稀释；
[0089]
3.按实施例方法包被2μg/ml的鼠源抗snx17单克隆抗体，5％bsa过夜封闭后，每孔加入50μl配制的8个浓度的snx17抗原液及稀释的各组血清，37℃放置1h；
[0090]
4.甩干洗涤后加入1:400稀释的hrp标记的兔源抗snx17多克隆抗体，经过tmb显色、2m h2so4终止后于酶标仪450nm处读取od值。结果如表2、表3所示。
[0091]
表2
[0092]
snx17抗原液浓度/ng/ml051020406080100od值0.0610.1600.2360.3720.5840.7520.8530.902
[0093]
表3
[0094]
分组1(男)2(男)3(男)4(女)5(女)6(女)正常人0.1920.2130.2230.2040.1980.218重症肌无力患者0.1840.1940.2370.2460.2260.197肌炎患者0.2710.2370.2190.2450.2060.235
[0095]
5.根据8组不同浓度的snx17抗原液的od值制作标准曲线(图5)，得到的模拟曲线公式为y＝115.72x2‑
3.0479x 2.1523，r2＝0.9895。用以计算正常人、重症肌无力患者和肌炎患者血清中snx17的含量(如表4所示)，统计分析三组血清中snx17的含量是否具有差异，结果如图6所示。
[0096]
表4
[0097]
分组1(男)2(男)3(男)4(女)5(女)6(女)正常人5.8336.7537.2276.3466.0866.987重症肌无力患者5.5095.9167.9308.4057.3746.043肌炎患者9.8257.9307.0358.3526.4357.827
[0098]
结果表明，与正常人(n＝6，6.54
±
0.54)相比，重症肌无力患者血清中snx17含量(n＝6，6.86
±
1.20)略高，但差异无统计学意义(p>0.05)，而肌炎患者血清中snx17含量(n＝6，7.90
±
1.17)明显升高，且差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0099]
综上，本发明提供了一种检测snx17的elisa试剂盒，该检测试剂盒为双抗体夹心法elisa试剂盒，可用于定量检测人血清或组织匀浆样本中的snx17，具有操作简单、特异性强、重复性好、敏感度高等优势。snx17作为多种疾病研究中的相关因子，本发明提供的定量检测snx17的elisa试剂盒不仅有助于开展snx17参与的相关疾病致病机制研究，且检测到的snx17还具有作为疾病生物标志物的潜在功能，可为后续辅助患者的精准诊疗提供指导。
[0100]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。