一种使用化学放光方法检测人类VEGF-A浓度的生物分析方法与流程

一种使用化学放光方法检测人类vegf
‑
a浓度的生物分析方法
技术领域
1.本发明涉及生物分析检测领域，具体涉及通过双抗体夹心法，采用化学发光的检测方式检测人类基质中vegf
‑
a浓度的方法。


背景技术：

2.血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)是在血管生成过程中是一种发挥重要作用的细胞因子。vegf家族包含vegf
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a,vegf
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b,vegf
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c,vegf
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d和vegf
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e,还有胎盘生长因子(pigf)。vegf
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a有着多样的生理学活性，包括促进内皮细胞的增殖和转移，促进蛋白水解，促进微血管渗漏，所有的这些作用均促进血管生成。vegf
‑
a通过结合vegfr
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1和vegfr
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2发挥生理学作用。在炎症条件和糖缺乏的情况下低氧能够诱导vegf
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a的表达。发炎和血管化的眼角膜中vegf
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a会上调表达。肿瘤的血管生成中vegf
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a也起到了关键的作用，多种人类的癌症中vegf
‑
a的受体vegfr上调，在体内vegf
‑
a的抗体能够有效的抑制肿瘤的生长。综上vegf
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a在视网膜疾病中是主要的靶点，且是肿瘤治疗的重要靶点，目前上市的抗vegf
‑
a的药物包含aflibercept，bevacizumab，ramucirumab，conbercept等。
3.在多种肿瘤病人中发现了vegfs浓度的上调，特别在转移性的肿瘤中vegf
‑
a的浓度有显著的提升,vegf
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a的浓度和多种肿瘤疾病的预后也有相关性。在湿性年龄相关性黄斑变性的眼科疾病中(wet
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amd),vegf
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a被认为眼部血管非正常生长和黄斑泄露的进程中扮演可关键的角色。血清和血浆中vegf
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a的浓度测定是肿瘤疾病病人和wet
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amd病人药物治疗预前预后的重要参考指标。目前用于vegf
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a浓度的生物分析方法以受体配体结合原理的elisa检测方法，多以试剂盒的形式存在如elisa方法r&d systems cat.dve00或者电化学发光检测方法msd cat.k151uvk等。
4.尽管vegf
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a的浓度测定方法市场上已有试剂盒可以提供，但是性能上仍然有没有满足的需求。有资料记载测得vegf的浓度在血清样本中要远远高于血浆样品，血清样本中vegf测得浓度为76to 854pg/ml，而相对应的枸橼酸钠抗凝的血浆样品vegf测得浓度为9
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42pg/ml，结果差异非常大，经研究发现血液中的血小板释放vegf是血清样品较血浆样品vegf增加的主要原因。对于血液中循环的vegf
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a的浓度测定使用枸橼酸钠抗凝的血浆样品进行测定相对于使用血清样品将会是更合适的选择。由于枸橼酸钠抗凝的血浆样品中vegf
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a的浓度较低，对于检测方法的灵敏度要求较高，而常规的elisa试剂盒如r&d systems cat.dve00在血清血浆中的检测下限为31.3pg/ml，无法满足检测的需求。电化学发光检测方法msd cat.k151uvk在血清血浆中的检测下限为2pg/ml，能够满足需求，但是整个试剂盒成本非常高，且配套使用的仪器价格高昂，相对于elisa试剂盒多种选择，msd电化学发光检测方法具有垄断地位，没有可替换的产品可供选择，一旦采购周期太长或者断货，不利于vegf
‑
a的浓度测定临床检测业务的持续进行。


技术实现要素：

5.本发明的目的提供一种使用化学放光方法检测人类vegf
‑
a浓度的生物分析方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
6.根据本发明所提供的一种使用化学放光方法检测人类vegf
‑
a浓度的生物分析方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白，检测物vegfa，检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；其中，其步骤如下：使固体介质固定住和vegf
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a的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的vegf
‑
a也固定在固体介质上，然后使用可以结合vegf
‑
a的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体需要直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的底物进行显色检测。
7.在一些实施方式中，检测抗体的标记物为hrp。
8.在一些实施方式中，具体的操作步骤如下：抗vegf融合蛋白用1xpbs稀释到2μg/ml，100μl/孔加入96酶标板白板中，4度过夜孵；第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，加入300μl/孔的封闭液，室温200rpm孵育1小时；vegfa标准品使用样品分析液进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/ml，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8125pg/ml，3.9063pg/ml，1.9531pg/ml，0.9766pg/ml，0.4883pg/ml，样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将生物素化的抗vegfa抗体稀释到100ng/ml,以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将hrp标记的链霉亲和素1：200进行稀释后，以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前半小时将化学发光检测试剂a液和b液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μl/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪使用化学发光的检测程序进行读数。
9.在一些实施方式中，所述洗涤液成分为1
×
pbs 0.1％tween 20，所述封闭液/方法分析液成分为1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20。
10.在一些实施方式中，所述样品分析液成分为方法分析液中加入10％兔血清。
11.在一些实施方式中，包括检测试剂盒，所述试剂盒包括96孔板、包被蛋白、检测抗体、化学发光检测试剂。
12.在一些实施方式中，所述试剂盒是以96孔板为固相载体。
13.在一些实施方式中，所述试剂盒采用酶直接或者间接和检测抗体结合，使用酶特异性的化学发光底物进行化学发光的检测，该酶是但不限于hrp、luciferase，对应底物为该酶的化学发光底物。
14.该试剂盒采用的抗体不限，与elsia方法，msd方法相比，具备高灵敏性的特点，灵敏度可达0.4883pg/ml,有较宽的检测范围，检测上限和下限的浓度比值可达1023倍；elisa试剂盒方法和msd试剂盒方法主要的不同的地方在于elisa使用hrp直接或者间接对于第二个抗体进行标记，使用tmb底物进行显色，最终以吸光度读值(od值)作为信号数据。msd试剂盒使用钌试剂直接或者间接对于第二个抗体进行标记，使用msd的read buffer(包含tripropylamine)，通过电刺激得到电化学发光的数值作为信号数据。基于显色检测的原
理，elisa试剂盒方法和msd试剂盒方法的固体介质的实体也不相同，elisa为底部透明的96孔板，msd为底部不透明且有能够进行电传导的电路的96孔板。msd试剂盒方法较elisa试剂盒方法较为灵敏的关键点在于其不同的显色原理，elisa吸光度的检测方法需要仪器提供光源而msd电化学发光无需仪器提供光源，没有仪器提供的光源干扰msd的检测方法更够区分更加微弱的光信号，从而更加灵敏的检测到痕量的vegf
‑
a。
15.该试剂盒可适用于血清样品，血浆样品的检测，且具备很好的方法平行性。
16.本发明可选用elisa方法一样或者类似的包被蛋白和检测抗体(检测抗体的标记物hrp)，使用与elisa方法不同的底物进行显色，通过检测化学发光的信号进行vegf
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a的浓度测定。该测定方法能够利用elisa方法的优势，即利用相同的包被蛋白和检测抗体，能够有较低的试剂成本且来源广泛的包被蛋白和检测抗体可供选择。有着msd方法同样的优势，采用化学发光的检测方法进行检测，仪器无需提供光源，没有仪器提供的光源干扰，化学发光的检测方法更够区分更加微弱的光信号，从而更加灵敏的检测到痕量的vegf
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a，能够达到msd试剂盒相当的灵敏程度。综上使用化学发光方法进行试剂耗材配比进行试剂盒的组装，用于定量检测vegf
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a浓度的生物分析方法一种成本较低，灵敏度高，来源可控能够进行可持续业务的分析方法。
17.有益效果：发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，高能级的激发态将会在短时间内返回到低能级的基态释放能量，该能量以光子的形式释放出来。根据分子或者原子形成激发态的能量来源不同发光可以分为光刺激发光、生物发光、电刺激发光、化学发光等。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。检测反应体系中的某些物质分子，如酶、底物等在进行化学反应的时候，由于吸收了反应时产生的化学能，使信号分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。化学发光检测方法主要是依据检测体系中待测物的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性相关的原理，利用仪器捕捉化学发光，将光信号转换成电信号，通过电信号的大小来确定待测物含量的一种痕量分析方法。现有的化学发光分析技术多用于蛋白免疫印迹领域，使用酶标记抗体进行反应，当加入化学发光底物(如鲁米诺，双氧水等)进行酶促化反应，产生光信号。信号可通过感光胶片或专用的成像设备来采集。使用化学发光分析技术可检测到低至飞克(10
‑
15g)级别的痕量的蛋白，灵敏度极高。但是蛋白免疫印迹实验需要以膜为固体载体，一块膜上的上样量不高，不能满足医药工业界药物研发高通量的检测需求，复杂的操作过程导致结果的稳定性较差，不能满足临床检测的精密度，准确度和稳定性等方法性能的需求。
18.受体配体结合酶联免疫技术早在19世纪70，80年代就开发出来用于替代放射性同位素标记技术用于研究蛋白质间的相互作用(配体
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受体，抗原
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抗体)和浓度测试，到如今已经接近50年的历史了。elisa技术和msd技术均脱胎于受体配体结合酶联免疫技术，elisa技术和msd技术以96孔板为固体载体，使用不同的显色底物进行检测，均有着高通量，方法的精密度，准确度和稳定性优异的特点。
19.本发明所采用的试剂盒，使用化学发光分析技术结合受体配体结合酶联免疫技术，以96孔板为固体载体，发挥化学发光分析技术的高灵敏优势的同时，也具备elisa技术和msd技术高通量，方法的精密度，准确度和稳定性优异的特点。
20.化学发光方法定量检测vegf
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a浓度的生物分析方法灵敏度低至0.5pg/ml，且板间
精密度和板内精密度<10％。
附图说明
21.图1为本发明的一种实施方式的一种使用化学放光方法检测人类vegf
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a浓度的生物分析方法的化学发光方法vegfa的标准曲线。
具体实施方式
22.下面结合说明书附图，对本发明进行进一步详细的说明。
23.如图1中所示，
24.实施例1 elisa方法vegfa标准曲线的建立
25.抗vegf融合蛋白(百英生物，货号b576801)用1xpbs稀释到2μg/ml，100μl/孔加入96酶标板(深圳市金灿华实业，106
‑
004)中，4度过夜孵。第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，加入300μl/孔的封闭液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)，室温200rpm孵育1小时；vegfa标准品(标准品来自试剂盒r&d货号dy293b
‑
05)使用样品分析液(样品稀释液成分为方法分析液中加入10％兔血清)进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/ml，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8125pg/ml，3.9063pg/ml，1.9531pg/ml，样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将生物素化的抗vegfa抗体(r&d货号baf293)稀释到100ng/ml,以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将hrp标记的链霉亲和素(r&d货号dy998)1：200进行稀释后，以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前半小时将tmb显色液(thermo，货号34028)a液和b液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μl/孔加入微孔板中，室温孵育10分钟后加入50μl/孔elisa终止液终止，使用酶标仪(molecular device型号spectramax plus384)使用吸光度发以450nm为检测波长，650nm为参比波长，进行读数，读数结果使用softmax软件(molecular device)，采用4参数进行标准曲线拟合，权重因子选择1。
26.经过数据分析，elisa方法vegfa标准曲线进行函数拟合后数据分析结果见下表，相对于背景信号为0.0628，最大检测信号为3.369，有54倍的检测窗口，以标准曲线各浓度点的回测偏差bias％在25％以内点计算，elisa方法的检测范围7.8125
‑
2000pg/ml。
[0027][0028]
实施例2 msd方法vegfa标准曲线的建立
[0029]
抗vegf融合蛋白(百英生物，货号b576801)用1xpbs稀释到2μg/ml，100μl/孔加入msd板上(msd，货号l15xa
‑
3)中，4度过夜孵。第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，加入300μl/孔的封闭液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)，室温200rpm孵育1小时；vegfa标准品((标准品来自试剂盒r&d货号dy293b
‑
05)使用样品分析液(样品稀释液成分为方法分析液中加入10％兔血清)进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/ml，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8125pg/ml，3.9063pg/ml，1.9531pg/ml，样品分析液作为空白样品；取封闭好的msd板，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将生物素化的抗vegfa抗体(r&d货号baf293)稀释到100ng/ml,以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将hrp标记的链霉亲和素(r&d货号dy998)1：200进行稀释后，以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前配置2x msd read buffer t(msd，货号r92tc
‑
1)，以150μl/孔加入msd板中后，立即使用酶标仪(msd型号1300)使用化学发光的方法进行读数，读数结果使用softmax软件(molecular device)，采用4参数进行标准曲线拟合，权重因子选择1。
[0030]
经过数据分析，msd方法vegfa标准曲线进行函数拟合后数据分析结果见下表，相对于背景信号为232，最大检测信号为15312，有66倍的检测窗口，以标准曲线各浓度点的回测偏差bias％在25％以内计算，msd方法的检测范围31.25pg/ml
‑
2000pg/ml。
[0031][0032]
实施例3化学发光方法vegfa标准曲线的建立
[0033]
抗vegf融合蛋白(百英生物，货号b576801)用1x pbs稀释到2μg/ml，100μl/孔加入96酶标板白板(thermo 436110)中，4度过夜孵。第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，加入300μl/孔的封闭液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)，室温200rpm孵育1小时；vegfa标准品((标准品来自试剂盒r&d货号dy293b
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05)使用样品分析液(样品分析液成分为方法分析液中加入10％兔血清)进行梯度稀释，稀释起始浓度为500pg/ml，然后两倍梯度稀释10个点，标准曲线的标准品浓度范围为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8125pg/ml，3.9063pg/ml，1.9531pg/ml，0.9766pg/ml，0.4883pg/ml，样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将生物素化的抗vegfa抗体(r&d货号baf293)稀释到100ng/ml,以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1
×
pbs 0.1％tween20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1
×
pbs 1％bsa 0.1％tween 20)将hrp标记的链霉亲和素(r&d货号dy998)1：200进行稀释后，以100μl/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前半小时将化学发光检测试剂(thermo货号37074)a液和b液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μl/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪(tecan型号infinite f plex)使用化学发光的检测程序进行读数，读数结果使用softmax软件(molecular device)，采用4参数进行标准曲线拟合，权重因子选择1/y^2。
[0034]
经过数据分析，vegfa标准曲线图见图1，标准曲线进行函数拟合后数据分析结果见表3，相对于背景信号为66276，最大检测信号为31397025，有470倍的检测窗口，标准曲线各浓度点的回测偏差bias％在25％为标准，方法的检测范围扩展到0.4883
‑
500pg/ml，具有极佳的灵敏程度和回测准确度。
[0035][0036]
表3：经函数拟合后标准曲线各浓度点参数
[0037]
综合elisa方法，msd方法和化学发光方法进行vegfa的标准曲线的建立可以得到以下的结论，使用相同或者类似的包被蛋白，检测抗体，利用受体配体结合酶联免疫技术，采用不同的光学显色方法，相对于elisa方法，msd方法，化学发光方法进行vegfa的检测灵敏程度提高了10
‑
60倍，检测的灵敏度可达0.4883pg/ml，且该方法有较宽的检测范围，检测上限和下限的浓度比值可达1023倍。msd方法在此实验中并未得到较高的灵敏度数据的可能原因是利用msd技术进行自主方法开发，而不是依赖试剂盒，还未到最优的条件。
[0038]
实施例4化学发光方法血清样品的平行性测试
[0039]
按照实施例3中试剂和耗材组成的试剂盒，按照操作步骤进行实验，在标准品稀释准备这步，同时进行血清样品的准备，血清样品用样品稀释液分别进行2，4，8，16倍稀释。利用实施例3相同的数据处理方式进行标准曲线拟合，血清样品测得的结果见下表。
[0040]
9个血清样品检测结果表明，每个样品在四个稀释度水平内都能够测得接近的浓度值，说明方法中的标准品vegfa和血清中的样品在此方法体系内有类似的剂量响应曲线，方法的平行性很好。在低浓度样品sm07中，sm07样品稀释16倍检测的结果低至1.569pg/ml，和sm07样品稀释2倍检测的结果16.89pg/ml，经稀释倍数校准后能够得到接近的浓度值,说明在灵敏度附近，方法依然有较好的平行性，受到基质的影响较小，方法比较稳固。
[0041][0042]
实施例5化学发光方法血浆样品的平行性测试
[0043]
按照实施例3试剂和耗材组成的试剂盒，按照操作步骤实验，在标准品稀释准备这步，同时进行血浆样品的准备，血浆样品用样品稀释液分别进行2，4，8倍稀释。利用实施例3相同的数据处理方式进行标准曲线拟合，血清样品测得的结果见下表。
[0044]
6个血浆样品检测结果表明，5/6的样品在三个稀释度水平内都能够测得接近的浓度值，说明方法中的标准品vegfa和血浆中的样品在此方法体系内有类似的剂量响应曲线，方法的平行性很好，该受到基质的影响较小，方法比较稳固。
[0045][0046]
实施例6化学发光方法的精密度和准确度测试
[0047]
按照实施例3试剂和耗材组成的试剂盒，按照操作步骤进行实验，以理论浓度为250pg/ml，15.625pg/ml和1.9531pg/ml的标准品作为qc样品。利用实施例3相同的数据处理方式进行qc样品的浓度计算。进行了3次测试，三次的检测结果见下表，三次测得的结果表明该化学发光方法定量检测vegf
‑
a浓度的生物分析方法的精密度在正负5％以内，方法的准确度在正负5％以内，说明该方法有极佳的精密度和准确度
[0048][0049]
以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也视为发明保护之内。