一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于生物化学分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.免疫抑制剂是一类可抑制机体异常反应的药物，能够抑制与免疫反应有关细胞(t细胞和b细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，降低免疫应答。在临床上主要用于防止器官移植时的排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗，如风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。随着人类对免疫应答规律认识的不断深入，一些高效低毒的新型免疫抑制剂如环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司等，得到了开发和应用。免疫抑制剂的药代动力学存在明显的个体内及个体之间的差异，且治疗浓度与中毒浓度接近，血药浓度稍高出现毒副作用，稍低则出现排斥反应，治疗窗很窄。由于药物的疗效和毒副作用均与用药剂量密切相关，可通过体内药物浓度的监测，合理地指导临床调整用药剂量，确保药物浓度处于安全有效的治疗范围。
3.免疫抑制剂可以单独使用，也可联合使用以增强药物疗效或减轻药物毒副作用。从作用机理上来看，环孢霉素a和他克莫司属于钙神经蛋白抑制剂，主要通过抑制t细胞活化而发挥免疫抑制作用。环孢霉素a是由11个氨基酸构成的环肽，具有较强的亲脂性，血液中约50％的环孢霉素a被红细胞摄取，30％结合在血浆脂蛋白和其他蛋白上，可使用全血或血浆对其进行血药浓度的监测。他克莫司是从链霉菌的代谢产物中分离得到大环内酯类化合物，体外实验证实其免疫活性是环孢霉素a的50
‑
100倍。他克莫司主要经胃肠道吸收，在血中绝大部分分布于红细胞，临床上使用全血血药浓度的监测来调整其最佳用药剂量。西罗莫司及其衍生物依维莫司是三烯大环内酯类化合物，为哺乳动物西罗莫司靶蛋白抑制剂，用药后广泛分布于各组织，在血液中主要与红细胞结合，因此临床上也采用全血样本进行药物浓度监测。
4.目前国内外有关全血中免疫抑制剂的测定方法报道很多，常见的方法有：免疫分析、液相色谱法，在众多的方法中，液相串联质谱法为测定免疫抑制剂的首选方法。但是以往方法普遍存在操作过程复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、检测通量低的问题，这主要都是因为样品前处理过程繁琐、稳定性差所造成的。
5.现有的免疫抑制剂样品前处理方法主要有蛋白沉淀、液液萃取等，如cn109187839a，采用硫酸锌和甲醇溶液作为蛋白沉淀剂对全血样本进行前处理，从而进行样本中他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢霉素a四种免疫抑制剂的检测，但由于其样本前处理过程存在稳定性差的问题，导致检测结果容易受干扰，误差大，检测灵敏度不高。
6.因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、检测通量高、检测准确度和灵敏度高、成本低、人工工作量小等优点的免疫抑制剂样品前处理方法，使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供一种改进的高效液相色谱串联质谱同时检测全血中4种免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法，通过在内标液中添加抗氧化剂维生素e，并与含有七水合硫酸锌、纯化水和甲醇的内标稀释液混合，用于样本前处理，一步操作实现红细胞处理、蛋白沉淀和内标添加，并使免疫抑制剂在溶液基质中更加稳定，从而提升检测准确性和灵敏度；同时本发明还采用同位素标记的西罗莫司作为依维莫司的内标，用于代替同位素标记的依维莫司，克服了依维莫司对同位素标记依维莫司的干扰，满足检测要求，降低内标成本，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
8.一方面，本发明提供了一种同时检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒，所述检测试剂盒含有内标液，所述内标液中含有添加剂，所述添加剂为2,6
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二叔丁基对甲酚、维生素e、维生素c、β
‑
胡萝卜素、焦亚硫酸钠中的任意一种或多种。
9.本发明所述的免疫抑制剂包括环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司。
10.发明人经过大量实验证明，溶液基质中的免疫抑制剂存在明显的稳定性差的问题，比如检测试剂盒中的内标液，其中含有的免疫抑制剂同位素内标的含量非常不稳定，常温下放置几天就会出现含量严重下降的问题，从而会显著影响检测的准确性和灵敏度，导致用于检测免疫抑制剂的所有样品、标准品、内标、质控品等全都需要现用现配，给实际操作带来非常大的麻烦，检测成本高。其原因可能是，免疫抑制剂属于大环内酯类化合物，从结构上看，大环内酯类化合物分子内一般含有多个双键，化学活性较强，易发生水解，在溶液基质中稳定性差。另有研究表明三烯基团易被氧化，从而引起西罗莫司和依维莫司的降解。因此，为了更加精准地检测全血中4种免疫抑制剂的含量，首先必须克服溶液基质中免疫抑制剂的稳定性问题。
11.发明人令人惊喜地发现，添加抗氧化剂可显著提高免疫抑制剂，尤其是西罗莫司、依维莫司等三烯类大环内酯类免疫抑制剂的稳定性。
12.进一步地，所述添加剂为维生素e。
13.研究证明，当添加剂为维生素e时，抗氧化效果最明显，稳定效果最好。
14.进一步地，所述维生素e的浓度为0.5
‑
1.5mg/ml。
15.进一步地，所述维生素e的浓度为1.0mg/ml。
16.进一步地，所述免疫抑制剂为环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司中的一种或多种；所述内标液中还含有同位素标记的免疫抑制剂和乙腈，其中环孢霉素a的内标为同位素标记的环孢霉素a，他克莫司的内标为同位素标记的他克莫司，西罗莫司和依维莫司的内标都为同位素标记的西罗莫司；所述内标液以乙腈为溶剂。
17.经过大量研究数据显示，依维莫司对依维莫司同位素检测内标有干扰，所以内标中不能直接加入依维莫司的同位素内标。因为西罗莫司和依维莫司的结构非常类似，本发明采用西罗莫司的同位素内标作为依维莫司的内标，既可以满足检测要求，还可以降低内标成本，并进一步提升了检测结果的准确性和灵敏度。
18.进一步地，所述环孢霉素a的内标为环孢霉素a
‑
d4，他克莫司的内标为他克莫司
‑
13c
‑
d4，西罗莫司和依维莫司都采用西罗莫司的同位素内标西罗莫司
‑
d3。
19.所述内标液以乙腈作为溶剂，可防止大环内酯类免疫抑制剂(他克莫司、西罗莫司和依维莫司)的水解，帮助进一步提高稳定性。
20.本发明配制的含有维生素e的内标液非常稳定，可长期保存，随用随取，保质期达两年以上，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
21.进一步地，所述检测试剂盒还含有内标稀释液，所述内标稀释液包括七水合硫酸锌、纯化水和甲醇。
22.本发明将甲醇、七水合硫酸锌、纯化水制成内标稀释液，用于直接与内标液混合，得到内标工作液，加入样品中混匀，既可发挥内标的作用，还可同步实现样品中红细胞的处理、蛋白质的沉淀分离和目标物质的提取，而且该溶液体系对样品中的免疫抑制剂的溶解性较好，不需要加以冷冻干燥或液液萃取后氮吹等富集过程，分离沉淀物杂质后可直接进样检测，简化了操作过程，而且所用试剂为成本较低的常规化学试剂，降低了检测成本。
23.进一步地，所述内标稀释液中，纯化水和甲醇的体积比为3:7，七水合硫酸锌的含量为60mm；所述内标液和内标稀释液的体积比为1：24。
24.进一步地，所述检测试剂盒还含有系统适用性溶液，所述系统适用性溶液包含环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司中的一种或多种，以及同位素标记的环孢霉素a、他克莫司和西罗莫司中的一种或多种，还包含溶剂和添加剂，所述溶剂为含添加剂的乙腈，所述添加剂为2,6
‑
二叔丁基对甲酚、维生素e、维生素c、β
‑
胡萝卜素、焦亚硫酸钠中的任意一种或多种。
25.系统适用性溶液用于系统适用性测试，在样本检测前，用高效液相色谱串联质谱检测直接进样3次系统适用性溶液，通过目标物质的保留时间、响应强度及其精密度判定高效液相色谱串联质谱系统是否正常。
26.系统适用性溶液以乙腈作为溶剂，可防止大环内酯类免疫抑制剂(他克莫司、西罗莫司和依维莫司)的水解，帮助进一步提高稳定性。
27.进一步地，所述系统适用性溶液的添加剂为维生素e。
28.进一步地，所述维生素e的浓度为0.5
‑
1.5mg/ml。
29.进一步地，所述维生素e的浓度为1.0mg/ml。
30.本发明配制的含有维生素e的系统适用性溶液非常稳定，可长期保存，随用随取，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
31.实验证明，本发明提供的内标液和系统适用性溶液，在2
‑
8℃下可稳定存放两年以上。
32.进一步地，所述检测试剂盒还含有标准样品、质控样品和液相色谱流动相；所述标准样品和质控样品采用含基质添加剂的无菌牛血作为基质配制；所述基质添加剂中含有维生素e；所述标准样品为含有标准浓度的环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司中的任意一种或多种的样品；所述质控样品为含有低中高三个不同水平浓度的样品；所述液相色谱流动相包括流动相a和流动相b，流动相a为2mm乙酸铵
‑
0.1％甲酸水溶液，流动相b为2mm乙酸铵
‑
0.1％甲酸甲醇溶液。
33.进一步地，所述标准样品和质控品的制备包括以下步骤：以含基质添加剂的无菌牛血作为基质，加入环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司中的任意一种或多种标准溶液，配制系列浓度的免疫抑制剂标准样品和质控样品。制得的标准样品和质控样品可冻干或以液态形式保存。
34.采用无菌牛血配制标准样品和质控品，一方面可提供模拟人全血样品的基质环
境，降样品检测时的基质效应，提高标准曲线和质控样品的准确性及可靠性；另一方面由于牛血的易获得性，还可降低试剂盒的生产成本。
35.在一些方式中，所述基质添加剂包括防腐剂proclin 300、抗氧化剂维生素e、稳定剂叔丁醇、增溶剂聚乙二醇、抗凝剂edta
‑
2na、赋形剂牛血清白蛋白，以获得防腐、抗氧化、稳定、增溶、抗凝和赋形等效果。
36.采用流动相a为2mm乙酸铵
‑
0.1％甲酸水溶液，流动相b为2mm乙酸铵
‑
0.1％甲酸甲醇溶液进行检测时，灵敏度高，使用50μl全血时，四种免疫抑制剂的标曲最低浓度点(s1)完全满足最低定量的要求。
37.另一方面，本发明提供了一种检测全血中的免疫抑制剂的方法，采用如上所述的检测试剂盒进行检测；包括系统适用性测试、样品制备、样品前处理和样品检测；其中，所述样品前处理包括以下步骤：取内标液和内标稀释液以1：24的比例混匀，得到内标工作液；取样品与内标工作液按照1∶3～1∶7混匀，离心，取上清进行高效液相色谱串联质谱检测。
38.进一步地，样品检测过程中，以同位素标记的西罗莫司作为依维莫司的内标，从而检测依维莫司的含量。
39.进一步地，样品前处理过程中，样品和内标工作液的体积比为1∶5。
40.进一步地，所述样品前处理包括以下步骤：取内标液和内标稀释液以1：24的比例混匀，得到内标工作液；取50μl样品加入到96孔板或离心管中；加入250μl内标工作液，涡旋5分钟；室温静置5分钟后再涡旋5分钟；在至少4000rpm转速下离心10分钟，取上清用高效液相色谱串联质谱检测。
41.所述的系统适用性测试为在样本检测前，用高效液相色谱串联质谱检测直接进样3次系统适用性溶液，通过目标物质的保留时间、响应强度及其精密度判定高效液相色谱串联质谱系统是否正常。
42.本发明提供的检测方法样品用量少，仅50μl，降低了临床采血难度。
43.进一步地，所述样品检测包括液相色谱和串联质谱检测，采用梯度洗脱；串联质谱，采用电喷雾离子源(esi)和正离子多反应监测扫描模式(mrm)。
44.进一步地，所述梯度洗脱时间需2min，梯度洗脱程序为：
45.时间(min)流动相a％流动相b％流速(ml/min)0.0080200.50.280200.512980.51.62980.52.080200.5
46.采用以上洗脱条件，可以排除全血基质对四种免疫抑制剂检测的干扰，保证了检测的准确性。检测时间短，整个检测时间2.0min，缩短了样品检测时间，采用特定梯度洗脱程序进行梯度洗脱，保证了样品分离效果，通过质谱实现四种免疫抑制剂的同时精准检测，大大缩短了单个样品的检测时间，有效降低分析成本，而且可报告范围广，可准确分析不同血药浓度水平的全血样品。
47.进一步地，高效液相色谱条件为：色谱柱为c18色谱柱，流动相流速为0.5ml/min，柱温在55℃。
48.进一步地，所述的质谱条件为：
[0049][0050]
进一步地，所述的质谱条件为：用于检测的四种免疫抑制剂及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
[0051][0052]
进一步地，所述方法还包括数据分析，主要步骤为：绘制标准曲线，计算待测人全血样品中免疫抑制剂的浓度。
[0053]
再一方面，本发明提供了维生素e用于制备免疫抑制剂溶液的稳定剂的用途，所述免疫抑制剂为环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司中的一种或多种。
[0054]
本发明具有以下有益效果：
[0055]
(1)在内标液中添加抗氧化剂维生素e，并与含有七水合硫酸锌、纯化水和甲醇的内标稀释液混合，用于样本前处理，既可发挥内标的作用，还可同步实现红细胞处理、蛋白沉淀和目标物质提取，并使免疫抑制剂在溶液基质中更加稳定，从而提升检测准确性和灵敏度；
[0056]
(2)在内标液和系统适用性溶液中添加维生素e，并以乙腈为溶剂，使内标液和系统适用性溶液非常稳定，可长期保存，保质期两年以上，随用随取，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
[0057]
(3)采用同位素标记的西罗莫司作为依维莫司的内标，用于代替同位素标记的依维莫司，克服了依维莫司对同位素标记依维莫司的干扰，满足检测要求，降低内标成本，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
附图说明
[0058]
图1为实施例1中标准曲线s1的色谱图
具体实施方式
[0059]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
[0060]
实施例1样本制备、前处理和检测
[0061]
一、样本制备
[0062]
1、标准曲线和质控样品的配制
[0063]
将免疫抑制剂环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司标准品配制成混合溶液，作为标准品工作液和质控品工作液的储备液，采用含基质添加剂1.0mg/ml维生素e的无菌牛血作为基质配制，配制标准曲线和质控样品。
[0064]
4种免疫抑制剂在标准品中具有10个系列浓度(s1～s10)，如表1所示：
[0065]
表1、4种免疫抑制剂在标准品中的10个系列浓度(s1～s10)
[0066][0067][0068]
4种免疫抑制剂在质控品中具有低(l)、中(m)、高(h)三个系列浓度，如表2所示：
[0069]
表2、4种免疫抑制剂在质控品中的三个系列浓度
[0070]
ng/ml环孢霉素a他克莫司西罗莫司依维莫司l30333m300303030h800808080
[0071]
2、内标液和内标稀释液的配制
[0072]
(1)内标液的配制
[0073]
配制混合内标准品工作液，环孢霉素a
‑
d4、他克莫司
‑
13c
‑
d4、西罗莫司
‑
d3的浓度分别为1μg/ml、50ng/ml和50ng/ml，并加入添加剂1.0mg/ml的维生素e，乙腈为溶剂，混合配制成内标液。
[0074]
(2)内标稀释液的配制
[0075]
分别量取17.8g的七水合硫酸锌、300ml纯化水和700ml甲醇，配置成内标稀释液。
[0076]
3、系统适用性溶液的配制
[0077]
分别取含100μg/ml的环孢霉素a
‑
d4、5μg/ml的他克莫司
‑
13c
‑
d4、5μg/ml的西罗莫司
‑
d3的混合内标液20μl，含8μg/ml环孢霉素a、0.8μg/ml他克莫司、0.8μg/ml西罗莫司和
0.8μg/ml依维莫司的混合标准品溶液100μl，含1.0mg/ml ve的乙腈溶液59.88ml，混合配制成系统适用性溶液。
[0078]
二、样本前处理
[0079]
(1)取内标液和内标稀释液以1：24的比例混匀，得到内标工作液；
[0080]
(2)取50μl样品，加入到96孔板或离心管中；
[0081]
(3)加入250μl内标工作液，涡旋5分钟，室温静置5分钟后再涡旋5分钟，在至少4000rpm转速下离心10分钟，取上清待测。
[0082]
三、样本检测
[0083]
取上清用高效液相色谱串联质谱检测，标准曲线最低点的谱图详见附图1。具体分析条件如下：仪器方法为采用梯度洗脱；串联质谱，采用电喷雾离子源(esi)和正离子多反应监测扫描模式(mrm)。色谱柱为c18色谱柱，流动相流速为0.5ml/min，柱温在55℃，梯度洗脱程序为：
[0084]
时间(min)流动相a％流动相b％流速(ml/min)0.0080200.50.280200.512980.51.62980.52.080200.5
[0085]
质谱条件为：
[0086][0087]
用于检测的四种免疫抑制剂及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
[0088][0089]
可以通过选择反应监控检测到的离子对，以及对应的保留时间，来确定4种免疫抑制剂的检测，并通过各种免疫抑制剂的内标进行定量。
[0090]
样品通过液相色谱分离后，不同的免疫制剂在不同洗脱时间出峰，并且被质谱多反应监测模式检测到，从而检测其含量。按照标样s1系列浓度，以含添加剂1.0mg/ml维生素e的无菌牛血作为基质配制待测样品进行检测，检测图谱如图1所示。由图1可见，按照本实施例提供的方法，可以同时准确检测4种免疫抑制剂。
[0091]
实施例2添加抗氧化剂对免疫抑制剂稳定性的影响
[0092]
本实施例按照实施例1提供的方法，并分别使用不同种类的抗氧化剂配制成同浓度的内标液和系统适用性溶液，在37℃条件下放置14天，考察不同抗氧化剂对内标液中包含环孢霉素
‑
d4、他克莫司
‑
13c
‑
d4、西罗莫司
‑
d3和系统适用性溶液中包含的环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司的保质期影响。抗氧化剂包括2,6
‑
二叔丁基对甲酚、维生素e、维生素c、β
‑
胡萝卜素、焦亚硫酸钠。结果如表1和表2所示：
[0093]
表1、不同抗氧化剂对系统适用性溶液中包含的环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司的37℃14天稳定性影响
[0094][0095]
表2、不同抗氧化剂对内标液中包含环孢霉素
‑
d4、他克莫司
‑
13c
‑
d4、西罗莫司
‑
d3、依维莫司
‑
d4的37℃14天稳定性影响
[0096][0097]
由表1和表2都可以看出，在不添加抗氧化剂的情况下，在37℃条件下放置14天，系统适应性溶液的免疫抑制剂，以及内标液中的同位素标记的免疫抑制剂含量都出现明显降低，尤其是他克莫司、依维莫司和西罗莫司，含量几乎呈断崖式下跌，可见系统适应性溶液和内标液中的4种免疫抑制剂或其同位素内标都是非常不稳定的。
[0098]
添加不同抗氧化剂，对系统适应性溶液和内标液中的4种免疫抑制剂或其同位素内标的稳定性都存在不同的影响。实验证明，维生素e的添加可以明显改善四种免疫抑制剂的稳定性，在37℃条件下放置14天后，系统适应性溶液和内标液中的4种免疫抑制剂或其同位素内标的含量变化在15％以内，稳定性较好。
[0099]
本实施例还进一步通过实验，验证了在2
‑
8℃情况下，放置两年后，添加了维生素e的系统适应性溶液和内标液中的4种免疫抑制剂或其同位素内标的含量依然保持稳定。
[0100]
实施例3维生素e的含量的选择
[0101]
本实施例按照实施例1提供的方法，在无菌牛血中添加环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司标准品溶液并分别加入不同浓度的维生素e，在37℃条件下放置14天，考察不同浓度的维生素e对全血中的环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司、依维莫司的保质期影响。结果如表3所示。
[0102]
表3、维生素e含量对37℃放置14天样品的检测结果影响
[0103][0104]
由表3可以看出，当维生素e浓度为0.5mg/ml时，经过37℃条件下放置14天后，依维莫司的浓度下降了22.5％，未能达到要求；当维生素e浓度为1.0mg/ml和1.5mg/ml时，环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司均未见明显下降，所以优选的维生素e浓度为1.0mg/ml。
[0105]
实施例4依维莫司对依维莫司同位素的干扰
[0106]
1、依维莫司标准品的检测结果
[0107]
本实施例按照实施例1提供的方法，取依维莫司标准品溶液用于高效液相色谱
‑
串联质谱检测，检测结果如表4所示。
[0108]
表4、依维莫司对内标对依维莫司
‑
d4的干扰
[0109][0110]
由表4可以看出，依维莫司标准品溶液中并未添加依维莫司
‑
d4，但检测结果中却在依维莫司
‑
d4通道发现信号，可见依维莫司对依维莫司同位素有干扰，因此如果采用依维莫司同位素作为内标进行检测，将会因存在的干扰而影响依维莫司的检测结果，使依维莫司的准确度结果会受到严重影响。
[0111]
2、不同浓度的依维莫司标准品溶液的检测结果
[0112]
取临床样本分别添加不同浓度的依维莫司标准品溶液，以依维莫司
‑
d4为内标检测加标后样本的回收率，平行6个样本，结果见表5。
[0113]
表5、不同浓度的依维莫司标准品溶液的检测结果
[0114][0115]
由表5可知，在不同浓度的依维莫司标准品中，以依维莫司
‑
d4为内标检测时，随着依维莫司浓度的升高，检测得到依维莫司的回收率却越来越低，当添加量达到50ng/ml时，回收率低于85％，完全不能满足准确度要求，因此添加依维莫司
‑
d4作为内标时，会严重影响依维莫司含量检测的准确度。
[0116]
西罗莫司和依维莫司的结构非常类似，大量实验(数据略)证明，采用西罗莫司的同位素内标作为依维莫司的内标，完全可以满足依维莫司的检测要求，还可以降低内标成本，并进一步提升了检测结果的准确性和灵敏度。
[0117]
实施例5临床验证性实验
[0118]
取临床样本分别加入环孢霉素a、他克莫司、西罗莫司和依维莫司标准品溶液配制成高、中、低浓度水平的回收率样本，按照实施例1提供的方法进行检测，平行6个样本，进行
前处理后计算回收率。回收率结果如表6所示。
[0119]
表6、临床验证性实验结果
[0120]
[0121][0122]
综合以上数据，我们考察了4种免疫抑制剂在低中高三个质控水平的精密度和回收率，结果显示本方法的精密度均小于7％，回收率基本在90％以上，表明该方法符合临床的检测要求。
[0123]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。