专利名称：维生素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇(维生素D3)及1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。它们可用下述结构表示 其中W是O或是(H，OH)。
它们可用作治疗肿瘤疾病，治疗过度增生性皮肤病及治疗皮脂腺疾病的药剂。
本发明还涉及含有效量的式Ⅰ化合物及药学上可接受的载体的药用组合物，以及式Ⅰ化合物在制备刺激HL-60细胞的分化作用或减少人体角质化细胞增生的药物方面的用途。
式Ⅰ化合物(下文也称为1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3及1，24，25-(OH)3-16-烯-D3是1，25-二羟基-16-烯-胆钙化甾醇(下文称为1，25-(OH)3-16-烯-D3)的代谢产物。它们可以通过将1，25-(OH)2-16-烯-D3灌注到鼠的肾内，提取灌注液，分离出式Ⅰ化合物来制备。我们惊异地发现，1，25-(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，24，25-(OH)3-16-烯-D3能抵抗来自其它羟化酶的进一步水解作用。
式Ⅰ化合物能刺激HL-60细胞的分化作用，因而能使该化合物用作治疗肿瘤疾病例如白血症的药剂。它们还能减少人体角质化细胞的增生，因而使该化合物能用作治疗过度增生性皮肤病例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病的药物。
对于治疗过度增生性皮肤病，例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化疾病及角化病，式Ⅰ化合物能以表皮给药的方式用于需要这种治疗的病人，例如剂量范围为每克皮肤表面配剂1-1000μg。式Ⅰ化合物也能以口服给药的方式治疗肿瘤疾病如白血症，以及治疗过度增生性皮肤病如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病，例如其剂量范围为每天0.1-10μg。
1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用，因而使该化合物可用于治疗肿瘤疾病，该化合物的活性可通过下述本技术领域公知的试验方法说明1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3在HL-60细胞形态学分化作用方面的效果。
a)方法所采用的组织培养基是补充了谷氨酰胺，抗生素和20%牛胎儿血清的RPMI-1640(Gibco)。
将1，25(OH)2-16-烯-D3和1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3溶于足量的乙醇中，得到1mM的储备液。当处理该化合物时应避光并储存于暗处的-20℃氩气氛中。储备液在上述组织培养基中被稀释至下表1所指出的浓度。将储备液放入烧瓶中，补加足量乙醇，使最终浓度为0.1%。
HL-60肿瘤细胞株最初从前髓细胞白血症病人体内得到，并可从American Type Culture Collection(ATCC＃CCL240)得到。将该细胞在组织培养基中一周两次连续传代保存在液体培养物中。对每个试验点，使细胞在复制烧瓶中生长，将该细胞以每瓶106个细胞的比率接种并于上述化合物存在下生长共4天。作为载体的乙醇在每个试验的所有稀释度下应保持恒量，以便不影响在所用浓度下(＞0.1%)该细胞的分化作用。于37℃温育4天后，评价培养物的细胞分化作用。
通过氮兰四唑(NBT)还原的生物化学方法来定量被分化的细胞，将1ml细胞悬浮液从每个烧瓶中取出，离心10分钟，再悬浮于约200μl工作溶液中，该工作溶液每mlNBT含100ng十四烷酰佛波醇乙酸乙酯并存放于放在冰上的有盖的管形瓶内。NBT在计数当天被制成新鲜的在生长基中的浓度为1mg/ml。该细胞在37℃水浴中温育30分钟，取一部分放入血球计，测定每约200个细胞中的兰-黑细胞总数，然后计算被分化细胞的百分比。
b)结果其结果，其中包括诱发50%细胞分化的化合物浓度(ED50)列于表1
这些数据表明，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3的效力比母体化合物1，25-(OH)2-16-烯-D3要大。而且，对于1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3，引起50%细胞分化所必须的有效剂量(ED50)仅为约0.035μM，而对于母体化合物1，25(OH)2-16-烯-D3，ED50值为约0.08μM。从上述结果可以看出1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用。因之，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能刺激HL-60细胞的分化，因之能将它用作为治疗肿瘤疾病例如白血病的药物。
化合物1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能减少人体角质化细胞的增生，因此使该化合物可用于治疗过度增生性皮肤病，该化合物的活性能通过本领域公知的下述试验方法阐述。
角质化细胞增生期间形态学变化的定量所需材料及方法。
1.培养条件。通过包皮环切术收集人体新生期的包皮，并放于含Dulbeccos Modified Eagle′s Medium(DMEM)中，其中含10%血清。一到达试验室里，就将它们整理修剪掉过量的真皮，并在4℃下用胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)溶液处理过夜。从真皮中剥下表皮，并于含大豆胰蛋白酶抑制剂的缓冲盐水中搅拌，以便除去基础角质化细胞，除去角膜层。将被分开的细胞离心，再悬浮于上述介质中，计数。并将该细胞放于塑料培养碟或盘中，其在角质化细胞生长介质(KGM)中的密度为25，000细胞/cm2。将该培养物于37℃有5%CO2的加湿室中温育。每周再往该培养物中加新鲜的介质2-3次。达到融合前，将于KGM中的细胞再放于6-孔一组的盘中，每孔为25，000个细胞(第一批)。
2.试验化合物溶液。1毫克量收集在琥珀色玻璃管形瓶中，并储存于-20℃下。将足量的100%乙醇加到该管形瓶中得一毫摩尔溶液，随后再将后者连续分配到小的琥珀色管形瓶中，用氩气复盖，储存于20℃。每一储备溶液解冻一次，使用后丢弃。取一部分储备溶液直接稀释到介质中，然后连续从微摩尔稀释到10-12M的浓度。在10-8-1012M的稀释液中加乙醇，达到最终浓度为0.1%。储存溶液供一个月内使用，对照培养物用0.1%乙醇处理。
3.细胞增生。第一步后约24小时，在细胞中再添加新鲜的KGM，并补充到含1.5mM CaCl2(试验1)，其中含试验化合物。在第二个试验中(试验2)该细胞在KGM中生长，未补加刺激更多增生的钙，并且生长7天而不是5天。化合物在四个浓度下进行试验，并且每个浓度下作三份。试验终止时，在培养物达到融合之前，细胞按如下方法被计数。小碟用磷酸缓冲盐水淋洗，然后用胰蛋白酶/EDTA溶液孵化15分钟。将细胞悬浮，取一部分放入等渗缓冲盐水中，用电子颗粒计数器计数。计数器应周期性地校准，以便核准角质化细胞的大小。每一孔计数三次，每个碟中的细胞数量依采用的稀释因子进行计算。表2中所列结果是在对照培养物中得到的百分抑制。
表2
试验1的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低剂量下具有某些抗增生活性，虽然这种活性不依赖于剂量。但是，试验2的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低浓度下有较强的抗增生活性。而且在低钙及较迅速分裂细胞中，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3表现出良好的剂量对曲线的依赖。两个试验的差别可能是由于在高的细胞外钙浓度下它们对角质细胞分化的效应。
这些数据指出，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3抑制皮肤细胞的增生，因此，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3可用于治疗皮肤的过度增生疾病，例如牛皮癣。
口服剂量形式为式Ⅰ化合物和药学上可接受的载体物质一起形成的胶囊、片剂等。放入到胶囊等中的上述物质可以是粘合剂如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉或明胶;赋形剂如磷酸二钙;崩解剂如玉米淀粉，土豆淀粉，或藻酸;润滑剂如硬脂酸镁，甜味剂如蔗糖，乳糖或糖精，调味剂如薄荷，冬青油或樱桃。还可以加入各种其它物质作为涂层或者改进单位剂量的物理形式。例如片剂可以用紫胶，糖或它们两者包衣。糖浆和酏剂可以含活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的甲基或丙基parabens，染料及调味剂如樱桃或柑橘调味剂。
式Ⅰ化合物也可以非肠道药剂形式给药，如为此目的的注射溶液或悬浮液。化合物最好以冻干剂或干粉的形式提供，它们可用通常的载体如水或干粉的形式提供，它们可用通常的载体如水或等渗盐水冲稀。
含1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3的表皮用药的剂量形式是软膏及药膏配方，其中有含油的，可吸附的，水溶性的及乳化型的底基如凡士林，羊毛脂，聚乙二醇等。
洗剂是液体制剂，可以是简单的溶液直到含精细分散物质的水或含水醇制剂。洗剂中含悬浮剂或分散剂，例如纤维素衍生物如乙基纤维素或甲基纤维素，明胶或树胶。将活性成份加到载体如水，醇或甘油中。凝胶体是半固体制剂，它是将活性成份的溶液或悬浮液在载体中进行凝胶化制成的。载体可以是含水的或无水的，使用凝胶化试剂例如多亚甲基羧酸进行凝胶化。并用碱中和到合适的凝胶稠度，所用碱例如是氢氧化钠及胺如多乙基可可胺。
此处所用表皮用药剂这一术语是指，加入到合适的药学上可接受的载体中的活性成份，用在需要在局部发挥其作用的发炎位置上。因此，表皮药组合物是一种该化合物在外部直接和皮肤接触使用的药物形式。表皮药剂包括凝胶，软膏，洗剂，药膏，粉剂，气雾剂及其它通常的剂型，即通过将式Ⅰ化合物和公知的药学上的表皮药剂载体相混合制得的用于皮肤的药物。除了用于皮肤以外，本发明的表皮药组合物也用于治疗粘膜发炎，这种粘膜对于该药物的表面应用应是可接受的。例如该表皮组合物可用于口腔或较低结肠的粘膜。
实施例1晶型的1，25(OH)2-16-烯-D3用U.S.5，087，619所述方法合成。如Am.J.physiol，1982，243，E265-271及Biochemistry，1987，26，324-331所述，鼠肾用1，25(OH)2-16-烯-D3灌注。将冷的1，25(OH)2-16-烯-D3(400nmoles)加入到100ml灌注液中，肾灌注进行8小时。最终肾灌注液的脂类提取物按照Can.J.Biochem1959，37，911-917所述方法进行操作。约100ml最终灌注液的大块脂类提取液(bulk lipid)的一半直接进行高压液相层析(HPLC)。HPLC分析用由50ml灌注液得到的脂类提取液进行，条件如下Zorbax-SIL柱，己烷2-丙醇(90∶10)。于脂类提取时将已知量25(s)，26(OH)2-D3加到灌注液中，以便一般地评价维他命D代谢物的提取。收集流过第一个HPLC的每一个别代谢物的馏份，进行第二次HPLC，用相同的Zorbax SIL柱，用二氯甲烷2-丙醇(94∶5)洗脱。从第二个HPLC得到的每一代谢物再用第一个HPLC系统层析两次。此时，每一代谢物的纯度对于其结构鉴定方法是合适的。对照用的灌注液以类似的方式用冷的1，25(OH)2-D3进行操作。最终灌注液的脂类提取液用和上述相同的HPLC系统进行分析。
我们发现，1，25(OH)2-16-烯-D3主要代谢为两个代谢物。两种代谢物的UV光谱的最大吸收为265nm，最小吸收为228nm。这表明两个代谢物均含有完整的5，6-顺-三烯生色团。1，25(OH)2-16-烯-D3和它的两个代谢物的质谱在m/z285显示一个峰，该峰是由于主要的甾体核的侧链开裂(C-17/C-20分裂)。峰m/z267和249是峰m/z285两次连续失水的结果。峰m/z152代表A环加6碳及7碳片断，峰m/z152失水产生基峰m/z134。1，25(OH)2-16-烯-D3和它的两个代谢物的质谱中，峰m/z285，267，249，152和134的集合的共同存在指出，断甾核是不变的，两个新的代谢物仅仅是由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上出现的变化造成的。
两个代谢物之一的质谱的分子离子m/z430(M )暗示着该新的代谢物是三羟基代谢物，并且由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上引入了羟基而形成的。峰m/z59指出，该代谢物含完整的C-25羟基，同时C-26或C-27未出现水解作用。同时，该代谢物对高碘酸的氧化作用是敏感的，这一发现建议，在该新代谢物侧链上的另一羟基邻近于C-25羟基。因之可以作出结论这个额外的羟基处于C-24上。该代谢物鉴定为1，24，25(OH)3-16-烯-D3。
在另一代谢物质谱中的分子离子m/x428，暗示着该新代谢物是由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上引入了氧化官能团的结果形成的。峰m/z59指出，该代谢物如同1，24，25(OH)3-16-烯-D3一样，含完整的C-25羟基，同时C-26或C-27未出现变化。当用硼氢化钠还原时，该代谢物被转化成在HPLC上和1，24，25(OH)3-16-烯-D3共同迁移的产物。该代谢物被鉴定为1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3。
实施例2软胶囊口服剂mg/胶囊1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3或1，24，25(OH)3-16-烯-D30.0001-0.010丁基化的羟基甲苯(BHT)0.016丁基化的羟基苯甲醚(BHA)0.016MyglyolR-812qs或聚乙二醇4001601.将BHT及BHA悬浮于MyglyolR-812或聚乙二醇400中，温热至约50℃，搅拌至溶解。
2.将1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3或1，24，25(OH)3-16-烯-D3溶在第一步的溶液中。
3.将第二步的溶液装进软胶囊。
所有步骤均在氮气氛中操作并避光。
实施例3软胶囊口服剂mg/胶囊1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D30.001-0.010a-生育酚0.016
MyglyolR-812qs 1601.将a-生育酚悬浮于MyglyolR-812中，温热至约50℃，搅拌至溶解。
2.将1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3溶在第一步的溶液中。
3.将第二步的溶液装入软胶囊。
所有步骤均在氮气氛中操作并避光。
实施例4软胶囊口服剂mg/胶囊1，24，25(OH)3-16-烯-D30.0001-0.010a-生育酚0.016聚乙二醇400qs160用聚乙二醇代替MygliolR-812，与实施例3的步骤相同。
权利要求
1.化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。
2.权利要求1的化合物用作有治疗活性的化合物，特别是用于刺激HL-60细胞的分化作用或减少人体角质细胞的增生。
3.制备权利要求1中的化合物的方法，该方法包括将1，25-二羟基-16-胆钙化甾醇灌注到鼠肾中，提取灌注液并分离出1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。
4.一种药物组合物或口服药用组合物，特别是用于刺激HL-60-细胞分化或减少人体角质细胞增生，它包括有效量的权利要求1中的化合物及载体，特别是表皮药用组合物，其中1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇或1，24，25-三羟基-16-烯胆钙化甾醇的数量约为1-1000μg，其中1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇或1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇的量为0.1-10μg。
5.权利要求1化合物的用途，用于制造刺激HL-60细胞分化作用或减少人体角质细胞增生的药物。
全文摘要
本发明涉及化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇，它们刺激HL-60细胞的分化作用，从而它们能用作治疗肿瘤疾病如白血病的药剂，它们还能减少人体角质细胞的增生，从而使它们用作治疗皮肤过度增生疾病如牛皮癣的药剂。它们可通过将1，25-二羟基-16-烯-胆钙化甾醇灌注到鼠肾中，提取灌注液并分离出1，25-二羟基-16-烯-24-氧化胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯胆钙化甾醇来制备。
文档编号C07C401/00GK1106384SQ94116578
公开日1995年8月9日 申请日期1994年9月28日 优先权日1993年10月1日
发明者J·A·麦克莱恩, S·G·雷迪, M·R·厄斯考克维思 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
技术领域：
本发明涉及化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇(维生素D3)及1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。它们可用下述结构表示 其中W是O或是(H，OH)。
它们可用作治疗肿瘤疾病，治疗过度增生性皮肤病及治疗皮脂腺疾病的药剂。
本发明还涉及含有效量的式Ⅰ化合物及药学上可接受的载体的药用组合物，以及式Ⅰ化合物在制备刺激HL-60细胞的分化作用或减少人体角质化细胞增生的药物方面的用途。
式Ⅰ化合物(下文也称为1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3及1，24，25-(OH)3-16-烯-D3是1，25-二羟基-16-烯-胆钙化甾醇(下文称为1，25-(OH)3-16-烯-D3)的代谢产物。它们可以通过将1，25-(OH)2-16-烯-D3灌注到鼠的肾内，提取灌注液，分离出式Ⅰ化合物来制备。我们惊异地发现，1，25-(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，24，25-(OH)3-16-烯-D3能抵抗来自其它羟化酶的进一步水解作用。
式Ⅰ化合物能刺激HL-60细胞的分化作用，因而能使该化合物用作治疗肿瘤疾病例如白血症的药剂。它们还能减少人体角质化细胞的增生，因而使该化合物能用作治疗过度增生性皮肤病例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病的药物。
对于治疗过度增生性皮肤病，例如牛皮癣，基础细胞癌，角质化疾病及角化病，式Ⅰ化合物能以表皮给药的方式用于需要这种治疗的病人，例如剂量范围为每克皮肤表面配剂1-1000μg。式Ⅰ化合物也能以口服给药的方式治疗肿瘤疾病如白血症，以及治疗过度增生性皮肤病如牛皮癣，基础细胞癌，角质化症及角化病，例如其剂量范围为每天0.1-10μg。
1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用，因而使该化合物可用于治疗肿瘤疾病，该化合物的活性可通过下述本技术领域公知的试验方法说明1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3在HL-60细胞形态学分化作用方面的效果。
a)方法所采用的组织培养基是补充了谷氨酰胺，抗生素和20%牛胎儿血清的RPMI-1640(Gibco)。
将1，25(OH)2-16-烯-D3和1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3溶于足量的乙醇中，得到1mM的储备液。当处理该化合物时应避光并储存于暗处的-20℃氩气氛中。储备液在上述组织培养基中被稀释至下表1所指出的浓度。将储备液放入烧瓶中，补加足量乙醇，使最终浓度为0.1%。
HL-60肿瘤细胞株最初从前髓细胞白血症病人体内得到，并可从American Type Culture Collection(ATCC＃CCL240)得到。将该细胞在组织培养基中一周两次连续传代保存在液体培养物中。对每个试验点，使细胞在复制烧瓶中生长，将该细胞以每瓶106个细胞的比率接种并于上述化合物存在下生长共4天。作为载体的乙醇在每个试验的所有稀释度下应保持恒量，以便不影响在所用浓度下(＞0.1%)该细胞的分化作用。于37℃温育4天后，评价培养物的细胞分化作用。
通过氮兰四唑(NBT)还原的生物化学方法来定量被分化的细胞，将1ml细胞悬浮液从每个烧瓶中取出，离心10分钟，再悬浮于约200μl工作溶液中，该工作溶液每mlNBT含100ng十四烷酰佛波醇乙酸乙酯并存放于放在冰上的有盖的管形瓶内。NBT在计数当天被制成新鲜的在生长基中的浓度为1mg/ml。该细胞在37℃水浴中温育30分钟，取一部分放入血球计，测定每约200个细胞中的兰-黑细胞总数，然后计算被分化细胞的百分比。
b)结果其结果，其中包括诱发50%细胞分化的化合物浓度(ED50)列于表1
这些数据表明，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3的效力比母体化合物1，25-(OH)2-16-烯-D3要大。而且，对于1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3，引起50%细胞分化所必须的有效剂量(ED50)仅为约0.035μM，而对于母体化合物1，25(OH)2-16-烯-D3，ED50值为约0.08μM。从上述结果可以看出1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能诱发人体前髓细胞的分化作用。因之，1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能刺激HL-60细胞的分化，因之能将它用作为治疗肿瘤疾病例如白血病的药物。
化合物1，25-(OH)2-24-氧代-16-烯-D3能减少人体角质化细胞的增生，因此使该化合物可用于治疗过度增生性皮肤病，该化合物的活性能通过本领域公知的下述试验方法阐述。
角质化细胞增生期间形态学变化的定量所需材料及方法。
1.培养条件。通过包皮环切术收集人体新生期的包皮，并放于含Dulbeccos Modified Eagle′s Medium(DMEM)中，其中含10%血清。一到达试验室里，就将它们整理修剪掉过量的真皮，并在4℃下用胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)溶液处理过夜。从真皮中剥下表皮，并于含大豆胰蛋白酶抑制剂的缓冲盐水中搅拌，以便除去基础角质化细胞，除去角膜层。将被分开的细胞离心，再悬浮于上述介质中，计数。并将该细胞放于塑料培养碟或盘中，其在角质化细胞生长介质(KGM)中的密度为25，000细胞/cm2。将该培养物于37℃有5%CO2的加湿室中温育。每周再往该培养物中加新鲜的介质2-3次。达到融合前，将于KGM中的细胞再放于6-孔一组的盘中，每孔为25，000个细胞(第一批)。
2.试验化合物溶液。1毫克量收集在琥珀色玻璃管形瓶中，并储存于-20℃下。将足量的100%乙醇加到该管形瓶中得一毫摩尔溶液，随后再将后者连续分配到小的琥珀色管形瓶中，用氩气复盖，储存于20℃。每一储备溶液解冻一次，使用后丢弃。取一部分储备溶液直接稀释到介质中，然后连续从微摩尔稀释到10-12M的浓度。在10-8-1012M的稀释液中加乙醇，达到最终浓度为0.1%。储存溶液供一个月内使用，对照培养物用0.1%乙醇处理。
3.细胞增生。第一步后约24小时，在细胞中再添加新鲜的KGM，并补充到含1.5mM CaCl2(试验1)，其中含试验化合物。在第二个试验中(试验2)该细胞在KGM中生长，未补加刺激更多增生的钙，并且生长7天而不是5天。化合物在四个浓度下进行试验，并且每个浓度下作三份。试验终止时，在培养物达到融合之前，细胞按如下方法被计数。小碟用磷酸缓冲盐水淋洗，然后用胰蛋白酶/EDTA溶液孵化15分钟。将细胞悬浮，取一部分放入等渗缓冲盐水中，用电子颗粒计数器计数。计数器应周期性地校准，以便核准角质化细胞的大小。每一孔计数三次，每个碟中的细胞数量依采用的稀释因子进行计算。表2中所列结果是在对照培养物中得到的百分抑制。
表2
试验1的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低剂量下具有某些抗增生活性，虽然这种活性不依赖于剂量。但是，试验2的数据表明，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3在较低浓度下有较强的抗增生活性。而且在低钙及较迅速分裂细胞中，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3和1，25(OH)2-16-烯-D3表现出良好的剂量对曲线的依赖。两个试验的差别可能是由于在高的细胞外钙浓度下它们对角质细胞分化的效应。
这些数据指出，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3抑制皮肤细胞的增生，因此，1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3可用于治疗皮肤的过度增生疾病，例如牛皮癣。
口服剂量形式为式Ⅰ化合物和药学上可接受的载体物质一起形成的胶囊、片剂等。放入到胶囊等中的上述物质可以是粘合剂如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉或明胶;赋形剂如磷酸二钙;崩解剂如玉米淀粉，土豆淀粉，或藻酸;润滑剂如硬脂酸镁，甜味剂如蔗糖，乳糖或糖精，调味剂如薄荷，冬青油或樱桃。还可以加入各种其它物质作为涂层或者改进单位剂量的物理形式。例如片剂可以用紫胶，糖或它们两者包衣。糖浆和酏剂可以含活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的甲基或丙基parabens，染料及调味剂如樱桃或柑橘调味剂。
式Ⅰ化合物也可以非肠道药剂形式给药，如为此目的的注射溶液或悬浮液。化合物最好以冻干剂或干粉的形式提供，它们可用通常的载体如水或干粉的形式提供，它们可用通常的载体如水或等渗盐水冲稀。
含1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3的表皮用药的剂量形式是软膏及药膏配方，其中有含油的，可吸附的，水溶性的及乳化型的底基如凡士林，羊毛脂，聚乙二醇等。
洗剂是液体制剂，可以是简单的溶液直到含精细分散物质的水或含水醇制剂。洗剂中含悬浮剂或分散剂，例如纤维素衍生物如乙基纤维素或甲基纤维素，明胶或树胶。将活性成份加到载体如水，醇或甘油中。凝胶体是半固体制剂，它是将活性成份的溶液或悬浮液在载体中进行凝胶化制成的。载体可以是含水的或无水的，使用凝胶化试剂例如多亚甲基羧酸进行凝胶化。并用碱中和到合适的凝胶稠度，所用碱例如是氢氧化钠及胺如多乙基可可胺。
此处所用表皮用药剂这一术语是指，加入到合适的药学上可接受的载体中的活性成份，用在需要在局部发挥其作用的发炎位置上。因此，表皮药组合物是一种该化合物在外部直接和皮肤接触使用的药物形式。表皮药剂包括凝胶，软膏，洗剂，药膏，粉剂，气雾剂及其它通常的剂型，即通过将式Ⅰ化合物和公知的药学上的表皮药剂载体相混合制得的用于皮肤的药物。除了用于皮肤以外，本发明的表皮药组合物也用于治疗粘膜发炎，这种粘膜对于该药物的表面应用应是可接受的。例如该表皮组合物可用于口腔或较低结肠的粘膜。
实施例1晶型的1，25(OH)2-16-烯-D3用U.S.5，087，619所述方法合成。如Am.J.physiol，1982，243，E265-271及Biochemistry，1987，26，324-331所述，鼠肾用1，25(OH)2-16-烯-D3灌注。将冷的1，25(OH)2-16-烯-D3(400nmoles)加入到100ml灌注液中，肾灌注进行8小时。最终肾灌注液的脂类提取物按照Can.J.Biochem1959，37，911-917所述方法进行操作。约100ml最终灌注液的大块脂类提取液(bulk lipid)的一半直接进行高压液相层析(HPLC)。HPLC分析用由50ml灌注液得到的脂类提取液进行，条件如下Zorbax-SIL柱，己烷2-丙醇(90∶10)。于脂类提取时将已知量25(s)，26(OH)2-D3加到灌注液中，以便一般地评价维他命D代谢物的提取。收集流过第一个HPLC的每一个别代谢物的馏份，进行第二次HPLC，用相同的Zorbax SIL柱，用二氯甲烷2-丙醇(94∶5)洗脱。从第二个HPLC得到的每一代谢物再用第一个HPLC系统层析两次。此时，每一代谢物的纯度对于其结构鉴定方法是合适的。对照用的灌注液以类似的方式用冷的1，25(OH)2-D3进行操作。最终灌注液的脂类提取液用和上述相同的HPLC系统进行分析。
我们发现，1，25(OH)2-16-烯-D3主要代谢为两个代谢物。两种代谢物的UV光谱的最大吸收为265nm，最小吸收为228nm。这表明两个代谢物均含有完整的5，6-顺-三烯生色团。1，25(OH)2-16-烯-D3和它的两个代谢物的质谱在m/z285显示一个峰，该峰是由于主要的甾体核的侧链开裂(C-17/C-20分裂)。峰m/z267和249是峰m/z285两次连续失水的结果。峰m/z152代表A环加6碳及7碳片断，峰m/z152失水产生基峰m/z134。1，25(OH)2-16-烯-D3和它的两个代谢物的质谱中，峰m/z285，267，249，152和134的集合的共同存在指出，断甾核是不变的，两个新的代谢物仅仅是由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上出现的变化造成的。
两个代谢物之一的质谱的分子离子m/z430(M )暗示着该新的代谢物是三羟基代谢物，并且由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上引入了羟基而形成的。峰m/z59指出，该代谢物含完整的C-25羟基，同时C-26或C-27未出现水解作用。同时，该代谢物对高碘酸的氧化作用是敏感的，这一发现建议，在该新代谢物侧链上的另一羟基邻近于C-25羟基。因之可以作出结论这个额外的羟基处于C-24上。该代谢物鉴定为1，24，25(OH)3-16-烯-D3。
在另一代谢物质谱中的分子离子m/x428，暗示着该新代谢物是由于在1，25(OH)2-16-烯-D3的侧链上引入了氧化官能团的结果形成的。峰m/z59指出，该代谢物如同1，24，25(OH)3-16-烯-D3一样，含完整的C-25羟基，同时C-26或C-27未出现变化。当用硼氢化钠还原时，该代谢物被转化成在HPLC上和1，24，25(OH)3-16-烯-D3共同迁移的产物。该代谢物被鉴定为1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3。
实施例2软胶囊口服剂mg/胶囊1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3或1，24，25(OH)3-16-烯-D30.0001-0.010丁基化的羟基甲苯(BHT)0.016丁基化的羟基苯甲醚(BHA)0.016MyglyolR-812qs或聚乙二醇4001601.将BHT及BHA悬浮于MyglyolR-812或聚乙二醇400中，温热至约50℃，搅拌至溶解。
2.将1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3或1，24，25(OH)3-16-烯-D3溶在第一步的溶液中。
3.将第二步的溶液装进软胶囊。
所有步骤均在氮气氛中操作并避光。
实施例3软胶囊口服剂mg/胶囊1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D30.001-0.010a-生育酚0.016
MyglyolR-812qs 1601.将a-生育酚悬浮于MyglyolR-812中，温热至约50℃，搅拌至溶解。
2.将1，25(OH)2-16-烯-24-氧代-D3溶在第一步的溶液中。
3.将第二步的溶液装入软胶囊。
所有步骤均在氮气氛中操作并避光。
实施例4软胶囊口服剂mg/胶囊1，24，25(OH)3-16-烯-D30.0001-0.010a-生育酚0.016聚乙二醇400qs160用聚乙二醇代替MygliolR-812，与实施例3的步骤相同。
权利要求
1.化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。
2.权利要求1的化合物用作有治疗活性的化合物，特别是用于刺激HL-60细胞的分化作用或减少人体角质细胞的增生。
3.制备权利要求1中的化合物的方法，该方法包括将1，25-二羟基-16-胆钙化甾醇灌注到鼠肾中，提取灌注液并分离出1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇。
4.一种药物组合物或口服药用组合物，特别是用于刺激HL-60-细胞分化或减少人体角质细胞增生，它包括有效量的权利要求1中的化合物及载体，特别是表皮药用组合物，其中1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇或1，24，25-三羟基-16-烯胆钙化甾醇的数量约为1-1000μg，其中1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇或1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇的量为0.1-10μg。
5.权利要求1化合物的用途，用于制造刺激HL-60细胞分化作用或减少人体角质细胞增生的药物。
全文摘要
本发明涉及化合物1，25-二羟基-16-烯-24-氧代-胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯-胆钙化甾醇，它们刺激HL-60细胞的分化作用，从而它们能用作治疗肿瘤疾病如白血病的药剂，它们还能减少人体角质细胞的增生，从而使它们用作治疗皮肤过度增生疾病如牛皮癣的药剂。它们可通过将1，25-二羟基-16-烯-胆钙化甾醇灌注到鼠肾中，提取灌注液并分离出1，25-二羟基-16-烯-24-氧化胆钙化甾醇和1，24，25-三羟基-16-烯胆钙化甾醇来制备。
文档编号C07C401/00GK1106384SQ94116578
公开日1995年8月9日 申请日期1994年9月28日 优先权日1993年10月1日
发明者J·A·麦克莱恩, S·G·雷迪, M·R·厄斯考克维思 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
再多了解一些
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