植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制作方法

专利名称：：植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物领域中一株植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素。
背景技术：
：食品安全问题是世界范围内的重要课题，在我国这样的发展中国家问题尤为突出，近年来我国食源性疾病患者的数目一直居高不下，由微生物引起的食物中毒情况非常严重。食源性疾病的持续增加使公众和政府开始重新审视现行食品防腐方法的有效性。添加化学防腐剂是人类使用的重要食品保藏方法，但经长期的研究发现过量食用合成的防腐剂对血压、心脏、肾脏等有不良影响，甚至有些化学防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。热杀菌也是食品加工过程中杀灭微生物的重要方法，但对某些低温制品，如低温肉制品，加热温度过高，其色泽、风味会发生明显变化，营养价值也大幅降低。其他物理方法如紫外消毒、过滤除菌、钴60照射法等，对人体无毒害作用，但当包装打开以后，又有再次染菌而腐败的可能。因此，开发出广谱、高效、稳定、安全的天然食品防腐剂是食品工业发展的必然趋势。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或前体多肽；这些物质在达到一定数量时可以杀灭或抑制与之相同或相似生境的其他微生物；一般产生细菌素的细菌都存在特异性免疫基因，所产细菌素不会对产生菌本身造成伤害。据报道3099%的细菌和弧菌产生至少一种细菌素。虽然有多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌可产生细菌素，但由乳酸菌产生的细菌素作为食品防腐剂更受人们的青睐，因为乳酸菌被认为是安全的(GRAS)，而且大多数产生细菌素的乳酸菌都分离自天然食品，因此它们更适合在食品中应用。乳酸菌细菌素作为一类天然食品防腐剂有广阔的开发前景。但目前所研究的乳酸菌细菌素主要对革兰氏阳性细菌有抑制或杀灭作用，对革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌及病毒一般没有抑制作用。因而只能用于抑制革兰氏阳性细菌引起的食品腐败，不能抑制由大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等革兰氏阴性细菌引起的食品腐败变质。另外许多细菌素，如Msin，在食品中应用抑菌活性不太稳定，在pH中性时活性丧失，限制了其在食品工业中的发展，所以有必要大力发展其他细菌素，开发出广谱、高效、对热和PH等稳定的新型乳酸菌细菌素，加速细菌素在食品工业中的应用，提高食品的质量和安全。细菌素与临床抗生素在生物合成、作用机制、抑菌谱等方面明显不同，到目前为止没有发现人体对细菌素具有明显抗性，而且细菌素可以安全、有效地使用以达到控制目标病原微生物生长的目的。所以乳酸菌细菌素在医学领域也将具有良好的应用前景。
发明内容本发明的目的是提供一株植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素，这种植物乳杆菌细菌素抑菌谱广，对热和PH稳定。上述目的通过以下技术方案实现一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，已于2009年06月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCCNo.3151，地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。所述的植物乳杆菌KLDS1.0391从内蒙古传统乳制品“焦克”中分离得到。在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形，中间隆起，边缘整齐，菌体两端钝圆、短小直杆，菌体大小0.40.7μπιΧ23μπι，为无芽孢革兰氏阳性杆菌，API50CHL糖醇发酵试验、16SrRNA序列同源性分析试验和recA基因多重PCR方法鉴定该菌为植物乳杆菌。一种上述植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391为生产菌株，采用改良MRS培养基，进行发酵、纯化后用M0DIA-T0F质谱测定得到植物乳杆菌细菌素的分子量为2180Da。所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，所述的改良MRS培养基的组成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸氢二氨、硫酸镁、K2HPO4·3Η20、蒸馏水，其质量百分含量为胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸锰0.025%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二氨0.2%、硫酸镁0.058%,K2HPO4·3H200.2%、蒸馏水95.417%。所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，所述的发酵条件为发酵温度30°C，恒pH5.0，发酵时间241!。所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，所述的纯化按以下步骤进行将上述发酵得到的发酵液离心，取上清液，向所述的上清液中加入饱和硫酸铵，至硫酸铵饱和度为70%，4°C搅拌过夜，离心取沉淀得到含有细菌素的沉淀物；将该沉淀物复溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝胶层析柱层析，所述层析条件为缓冲液为PH5.0的0.05ml/L乙酸钠和0.lmol/L的氯化钠混合液，流速3ml/min，90min96min出现的蛋白峰为细菌素活性峰；将该细菌素活性峰收集液冻干浓缩后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色谱柱进一步纯化，所述反向层析条件为缓冲液A为5%的乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，洗脱缓冲液B为90%乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，线性梯度洗脱，34.5min35min出现的蛋白峰为细菌素活性峰；将该细菌素活性峰用截流分子量为IOOODa的透析袋透析即得到植物乳杆菌细菌素。本发明的有益效果1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391产生的细菌素对热和pH稳定，在121°C热处理30min后活性不变，在pH210范围内活性稳定。可被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，可被木瓜蛋白酶、蛋白酶K和α-糜蛋白酶部分失活，不能被α-淀粉酶失活。作用方式是杀菌，两小时内能杀灭90%以上的指示菌。KLDS1.0391产生细菌素的抑菌谱广，可抑制乳酸菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性菌；沙门氏菌、假单胞菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌。该植物乳杆菌细菌素在体内抑制沙门氏菌试验证明该细菌素可在小鼠体内有效抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，对鼠伤寒沙门氏菌造成的疾病具有缓解作用。植物乳杆菌细菌素具有很好的热和PH稳定性及较高的安全性，作为食品防腐剂具有良好的应用前景，另外在医药和饲料工业也会有很好的应用前景。具体实施例方式实施例1:一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，已于2009年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCCNo.3151。所述的植物乳杆菌KLDS1.0391从内蒙古传统乳制品“焦克”中分离得到。在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形，中间隆起，边缘整齐，菌体两端钝圆、短小直杆，菌体大小0.40.7μπιΧ23μπι，为无芽孢革兰氏阳性杆菌，API50CHL糖醇发酵试验、16SrRNA序列同源性分析试验和recA基因多重PCR方法鉴定该菌为植物乳杆菌。实施例2一种上述植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，以植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391为生产菌株，采用改良MRS培养基，进行发酵、纯化后用M0DIA-T0F质谱测定得到植物乳杆菌细菌素的分子量为2180Da。具体步骤为1.对植物植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDSl.0391的抑菌活性分析抑菌活性分析方法抑菌活性测定采用琼脂扩散法。1.2%的素琼脂，按每平皿IOmL倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7%琼脂的营养琼脂培养基，冷至50°C左右，每IOOmL接入0.6mL过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒6mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径6mm；在孔中加入50μL无细胞发酵上清液，超净工作台上放置3小时；置于适宜培养条件下进行培养；用游标卡尺测量抑菌圈直径。2.细菌素的生产将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391使用改良的MRS培养基发酵，所述的改良MRS培养基的组成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸氢二氨、硫酸镁、K2HPO4·3H20、蒸馏水，其质量百分含量为胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸锰0.025%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二氨0.2%、硫酸镁0.058%、K2HPO4·3H200.2%、蒸馏水95.417%。发酵条件为发酵温度30°C，恒pH5.0，发酵时间24h。发酵液12000Xg，4°C离心15min,上清液加入3mol/L氢氧化钠中和至中性，pH6.57.0，经0.22μm的滤膜过滤排除剩余菌体细胞制成无细胞发酵上清液以鼠伤寒沙门氏菌为指示菌进行(1)和(2)的实验。(1)排除过氧化氢的干扰过氧化氢酶溶解在0.02mol/L的无菌水中配成母液，力口入无细胞发酵上清液中使过氧化氢酶的终浓度为5.0mg/ml，37°C水浴2h后取出，检测过氧化氢酶处理后无细胞发酵上清液的抑菌活性，用加入等量水的无细胞发酵上清液做对照，比较处理样品与对照样品的抑菌圈差异。(2)蛋白类抑菌物质的确定蛋白酶K用无菌水配成母液，加入无细胞发酵上清液中，使蛋白酶K终浓度达到1.Omg/ml，混勻后37°C水浴2h后取出，检测处理后发酵液的抑菌活性，用加入等量无菌水的无细胞发酵上清液做对照，比较处理样品与对照样品的抑菌圈差异。(3)蛋白和多肽的初步分离将饱和度为100%的硫酸铵加入无细胞发酵上清液中，使硫酸铵终浓度达到70%。样品在4°C条件下用磁力搅拌器最小转速搅拌过夜，10000Xg，4°C离心30min，沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH6.5)，然后检测抑菌活性。上述不同处理对抑菌活性的影响结果如下无细胞发酵上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径无明显变化处理前10.45mm,处理后10.43mm；蛋白酶K作用后，不能产生清晰抑菌圈，用硫酸铵盐析沉淀后的样品抑菌圈达到16.14mm。表明发酵上清液经排除菌体细胞、酸和过氧化氢等干扰因素，并进行了初步的蛋白质分离后，仍有抑菌活性，说明该抑菌活性是由蛋白类物质引起的，从而判定植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391产生的抑菌物质为细菌素。3.细菌素的分离纯化将上述发酵液经12000Xg，4°C离心15min，收集上清液，上清液用0.22μm滤膜过滤，除去菌体及其它杂质。无细胞发酵上清液用琼脂扩散法测定细菌素抑菌活性。1.2%的素琼脂，按每平皿IOmL倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7%琼脂营养琼脂培养基，冷至50°C左右，每IOOmL接入0.6mL过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒6mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径6mm；在孔中加入50μL无细胞发酵上清液，超净工作台上放置3小时；置于适宜培养条件下进行培养。用游标卡尺测量抑菌圈直径，或将细菌素样品用0.025mol/L的乙酸钠溶液二倍稀释(PH6.5)，取样50μL进行实验，观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(IAU)，其倒数即为细菌素效价值AU/ml。无细胞发酵上清液80°C处理IOmin防止细菌素降解，用饱和度为70%的硫酸铵盐析，在4°C条件下用磁力搅拌器最小转速搅拌过夜，10000Xg，4°C离心30min，沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH6.5)。将该含有细菌素的沉淀物复溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝胶层析柱层析纯化；所述层析条件为缓冲液为pH5.0的0.05ml/L乙酸钠和0.lmol/L的氯化钠混合液，流速3ml/min,90min96min出现的蛋白峰为细菌素活性峰。将该细菌素活性峰收集液冻干浓缩后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色谱柱进一步纯化；所述反相层析条件为缓冲液A为5%的乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，洗脱缓冲液B为90%乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，线性梯度洗脱，34.5min35min出现的蛋白峰为细菌素活性峰。将该细菌素活性峰用截流分子量为IOOODa的透析袋透析；透析后用M0DIA-T0F质谱测定得到该细菌素的分子量。各步纯化后得到的细菌素的结果如表1所示，细菌素的分子量为2180Da。表1植物乳杆菌细菌素的分离纯化结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.细菌素的活性测试菌株选择有代表性的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株39株，见表2，测定了植物乳杆菌细菌素粗提物对这些菌株的抑菌活性。表2测试菌株及来源<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用步骤2的抑菌活性分析方法，即分别将测试菌加入到适宜其生长的软琼脂培养基中，在底层有琼脂的平皿上倾倒6mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径6mm；在孔中加入50μL细菌素粗提液，超净工作台上放置3小时；置于适宜培养条件下进行培养。用游标卡尺测量抑菌圈直径。细菌素粗提液为用饱和度为70%的硫酸铵盐析无细胞发酵上清液，在4°C条件下用磁力搅拌器最小转速搅拌过夜，10000Xg，4°C离心30min，沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH6.5)得到的细菌素样品。试验结果如表3所示，表明植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391的抑菌谱很广，不仅可抑制乳酸菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等革兰氏阳性细菌，而且能抑制沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性细菌。表3植物乳杆菌细菌素的抑菌谱<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.细菌素的特性采用步骤3的纯化方法，无细胞发酵上清液80°C处理IOmin后用饱和度为70%的硫酸铵盐析，在4°C条件下用磁力搅拌器最小转速搅拌过夜，10000Xg，4°C离心30min，沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH6.5)。将该含有细菌素的沉淀物复溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝胶层析柱层析纯化；所述层析条件为缓冲液为pH5.0的0.05ml/L乙酸钠和0.lmol/L的氯化钠混合液，流速3ml/min，90min96min出现的蛋白峰为细菌素活性峰，取该活性峰收集液调蛋白浓度为lmg/ml作为细菌素纯化液。(1)对温度的稳定性将细菌素纯化液分别取Iml加入到小离心管中，分别在60°c、80°c、10(rc和121°c保持30min，用冰冷却后做抑菌实验，用未加热的细菌素粗提液作对照，测其抑菌活性。结果表明，60800C、100°C和121°C处理30min抑菌圈直径均未发生明显变化，见表4，说明细菌素对热稳定。(2)对pH的稳定性将细菌素纯化液分别取Iml加入到小离心管中，分用3mol/L的NaOH和HCl将细菌素的pH调为2、3、4、5、6、7、8、9、10，37°C温浴72h后将pH调回6.5，然后测定抑菌活性，结果表明，细菌素对酸和碱有一定耐受作用，见表4。(3)对蛋白酶的敏感性将细菌素纯化液分别取Iml加入到小离心管中，调pH到各蛋白酶的最适作用PH，其中胃蛋白酶和木瓜蛋白酶调到2.0，胰蛋白酶和中性蛋白酶调到7.0，α-糜蛋白酶调到7.5，碱性蛋白酶调到8.0。按终浓度lmg/ml加入各蛋白酶后，37°C下温育2h。将pH调回到6.5，做抑菌实验，用未加蛋白酶处理的细菌素纯化液做对照。结果表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶可使细菌素完全失活，木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶中性蛋白酶和碱性蛋白酶使细菌素部分失活，见表4。表4植物乳杆菌素对温度、PH和蛋白酶的稳定性抑菌活力(抑菌圈直径单位mm)温度 时间KLDS1.0391pHKLDS1.0391酶(lmg/mL)KLDS1.0391未加热处理13。88士0,24PH2.012.59±0.27未加酶13.87±0.2260°C30min13,89土0.32pH3.012.81士0.39胃蛋白酶一80°C30min13.89士0.20PH4.013.41士0.40胰蛋白酶—IOOOSOmin13.87土0,33pH5.013.64士0.11木瓜蛋白酶10.15士0.2712rC30min13.88±0.28PH6.013.73±0.39蛋白酶K10.21士0.20pH7.013.69士0.24α-糜蛋白酶10.51士0.51ΡΗ8.013.61士0.24中性蛋白酶10.78±0.42ΡΗ9.013.16士0.33碱性蛋白酶10.42士0.35pH10.013.05士0.34由此可见，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391产生的细菌素对热和pH稳定，在121°C处理30min后活性基本不变，在pH210范围内活性稳定，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶失活。实施例3应用植物乳杆菌细菌素抑制由沙门氏菌引起的疾病1.试验动物清洁级昆明种小鼠112只，雌雄各半，体重1822g，饲喂小鼠全价颗粒料，室温控制在1822°C，相对湿度60p%，人工昼夜(12h白昼，12h黑夜)。2.试验方法(1)沙门氏菌感染小鼠小鼠买回后适应性饲养3天进行试验，每只小鼠注射0.3ml2X108cfu/ml的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，此剂量可使小鼠感染但并不足以使小鼠在4h内死亡。(2)分组和剂量注射沙门氏菌后的小鼠分成3个细菌素剂量组、一个阳性对照组和一个空白对照组，每组雌雄各8只。小鼠染毒4小时后开始治疗，细菌素低剂量组80mg/kg体重，细菌素中剂量组400mg/kg体重，细菌素高剂量组2000mg/kg体重，以上各组通过灌胃注入到小鼠体内。阳性对照组注射80mg/kg头孢唑林钠，空白对照组不投药，各组小鼠以相同投药浓度治疗7天。试验期间各组小鼠均自由饮水，自由采食，观察小鼠的每日采食量、外观体征(包括被毛光泽、精神状态、呼吸动作、分泌物、排泄物、饮食、活动、行为等)、异常表现和中毒症状等。分别于给药后的第8天进行各项指标的测定，测定指标如下各组试验小鼠存活情况。细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠各脏器中沙门氏菌的变化情况取各组小鼠的血液、肝脏、脾脏、回肠和结肠按重量比19加入到无菌水中，勻浆后稀释涂布HE琼脂平板，检测各组小鼠脏器中沙门氏菌的变化情况。血常规检验检验红细胞(RBC)、白细胞(WBC)数、白细胞分类计数、血红蛋白(HGB)含量、红细胞比积(HCT)、红细胞体积(MCV)血红蛋白含量(MCH)等。血液生化指标检查测定血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、血清白蛋白(TP)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等指标。3.试验结果(1)各组小鼠存活情况感染鼠伤寒沙门氏菌后，各组小鼠均有发烧畏寒等症状，感染8小时后小鼠出现死亡，试验一周后各组小鼠的存活情况见表5。表5细菌素对感染沙门氏菌小鼠的存活情况<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表5可以看出，各剂量组细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠一周后，小鼠的存活率与空白对照组相比都有明显提高，随着细菌素剂量升高，其存活率也有所上升。但细菌素各剂量组都有小鼠死亡，说明细菌素不能完全治疗由沙门氏菌引起的感染。(2)细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠各脏器中沙门氏菌的变化情况细菌素治疗感染沙门氏菌的小鼠一周后，小鼠血液、肝脏、脾脏、十二指肠、回肠、结肠、粪便中的沙门氏菌数量明显少于未治疗组，高剂量组与头孢唑林钠治疗组小鼠体内的活菌数相当，见表6。表6细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠各脏器中沙门氏菌菌数变化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注同行脚标不同表示差异显著。(3)细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠的血常规指标变化除低剂量组小鼠红细胞分布宽度变异系数外，存活小鼠的各项血常规指标均未发生明显变化，见表7。表7细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠的血常规指标变化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注同行脚标不同表示差异显著。(4)细菌素治疗后小鼠的血液生化指标变化感染沙门氏菌的小鼠用细菌素治疗后，从中剂量组开始包括阳性对照组小鼠的谷丙转氨酶升高，可能是细菌素和药物治疗加重了肝脏的负担。用细菌素治疗后小鼠的总蛋白、白蛋白和甘油三酯含量开始恢复，见表8。表8细菌素治疗感染沙门氏菌小鼠的血液生化指标变化<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上可以看出，用细菌素治疗感染鼠伤寒沙门氏菌的小鼠后，小鼠治愈率提高，存活小鼠血液、肝脏、脾脏、十二指肠、回肠、结肠、粪便中鼠伤寒沙门氏菌菌数明显减少。小鼠的各项血常规指标和生化指标无明显变化，说明植物乳杆菌细菌素可以缓解由沙门氏菌引起的病变。权利要求一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，其特征是已于2009年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3151。2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌KLDS1.0391，其特征是从内蒙古传统乳制品“焦克”中分离得到，在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形，中间隆起，边缘整齐，菌体两端钝圆、短小直杆，菌体大小0.40.7μmX23μm，为无芽孢革兰氏阳性杆菌，API50CHL糖醇发酵试验、16SrRNA序列同源性分析试验和recA基因多重PCR方法鉴定该菌为植物乳杆菌。3.一种根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，其特征是以所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391为生产菌株，采用改良MRS培养基，进行发酵、纯化后用M0DIA-T0F质谱测定得到植物乳杆菌细菌素的分子量为2180Da。4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，其特征是所述的改良MRS培养基的组成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸锰、乙酸钠、柠檬酸氢二氨、硫酸镁、K2HPO4·3H20、蒸馏水，其质量百分含量为胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸锰0.025%、乙酸钠0.5%、柠檬酸氢二氨0.2%、硫酸镁0.058%,K2HPO4·3H200.2%、其余为蒸馏水。5.根据权利要求3或4所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，其特征是所述的发酵条件为发酵温度30°C，恒pH5.0，发酵时间24h。6.根据权利要求3或4所述的植物乳杆菌所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素的制备方法，其特征是所述的纯化按以下步骤进行将上述发酵得到的发酵液离心，取上清液，向所述的上清液中加入饱和硫酸铵，至硫酸铵饱和度为70%，4°C搅拌过夜，离心取沉淀得到含有细菌素的沉淀物；将该沉淀物复溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝胶层析柱层析，所述层析条件为缓冲液为PH5.0的0.05ml/L乙酸钠和0.lmol/L的氯化钠混合液，流速3ml/min，90min-96min出现的蛋白峰为细菌素活性峰；将该细菌素活性峰收集液冻干浓缩后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色谱柱进一步纯化，所述反向层析条件为缓冲液A为5%的乙腈水溶液加入0.1%的三氟乙酸，洗脱缓冲液B为90%乙腈水溶液加入0.的三氟乙酸，线性梯度洗脱，34.5min35min出现的蛋白峰为细菌素活性峰；将该细菌素活性峰用截流分子量为IOOODa的透析袋透析即得到植物乳杆菌细菌素。全文摘要一株植物乳杆菌及其所产的可抑制革兰氏阴性菌的细菌素，该细菌素抑菌谱广，对热、pH稳定，可被蛋白酶降解，不会在人体内残留，安全性高。本发明的菌株于2009年6月29日保藏，保藏号为CGMCCNo.3151，生产菌株从内蒙古传统乳制品“焦克”中分离得到，在MRS培养基上，菌落为乳白色圆形，中间隆起，边缘整齐，菌体两端钝圆、短小直杆，菌体大小0.4～0.7μm×2～3μm，为无芽孢革兰氏阳性杆菌，API50CHL糖醇发酵试验、16SrRNA序列同源性分析试验和recA基因多重PCR方法鉴定该菌为植物乳杆菌。以所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391为生产菌株，采用改良MRS培养基，进行发酵、纯化后得到植物乳杆菌细菌素。本发明用于食品防腐剂。文档编号C07K14/335GK101812414SQ20091007265公开日2010年8月25日申请日期2009年8月6日优先权日2009年8月6日发明者孟祥晨,王辉,贡汉生申请人:东北农业大学