专利名称：取代的吡咯烷衍生物用作hiv蛋白抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明是关于对抵抗特殊的还原病毒显示活性的化合物、生产这些化合物的方法、药物的制备、以及利用这些化合物去和由还原病毒所引起的感染作斗争的方法。
1983年，一种被称为人体免疫缺陷病毒第1型(HIV-1)的还原病毒被确定为后天免疫缺陷综合症(AIDS)的病源体，见R.C.Gallo和L.Montagnier，Scientific American(科学美国人)，259(4)，40(1988)。这种病毒已经成为具有惊人比率的一种疫病。最近，密切相关的病毒，人体免疫缺陷病毒第2型(HIV-2)已被鉴定为AIDS的第2种病源体。
作为病源体的人体免疫缺陷病毒(HIV)的识别和大量繁殖这种病毒方法的发展，已经导致在体外能抑制HIV复制的化合物的发现。照这样识别的抑制剂化合物的最重要的类别是一群属于双脱氧核苷类化合物，其中3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶核苷(也称为利多伍啶(Zidovndine)或AZT)以及新近的2′，3′-双脱氧肌苷(也称为迪多诺欣(didanosine)或DDI)用来治疗某些具有HIV感染症状的病人。业已发现这类化合物通过抑制逆转录酶干扰HIV的生活周期。这种酶把病毒RNA转化为双链的脱氧核糖核酸(DNA)，而其本身是HIV复制的一种必需酶。除了抑制逆转录酶外，HIV生活周期的其他阶段也已弄明，成为发展抗AIDSO药物的目标。越来越受到注意的一个目标是一种被称为HIV蛋白酶的HIV-编码酶。这种酶，象逆转录酶，由pol基因编码，并且对于HIV生长是必需的，它负责使gag(p55)或gag-pol(p180)蛋白质内产生某些分裂而释放出结构蛋白质，例如p17和p24，和酶，包括其本身，这些酶可在成熟的感染的病毒粒子内找到。因此，HIV蛋白酶的抑制剂能阻断HIV的生活周期。
最近几年来对于HIV蛋白酶所给予的日益增长的关注可从发现阻断这种酶的药物报告的增加上反映出来。例如，可看由D.W.Norbeck和D.J.Kempf写的关于蛋白酶的抑制剂方面的最新回顾，登在Annual Report In Medicinal Chemistry，26，141(1991)上。正如在最近的回顾中提到(由D.H.Rich等人发表的，登在J.Med.Chem.33，1285(1990)和N.A.Roberts等人发表的，登在Science，248，358(1990)上)，在具有p17/p24底物断裂点序列的缩氨酸中，通过羟乙基胺过度态类似物(TSA)的取代，可以获得两种有效的HIV蛋白酶抑制剂的系列产品。Roberts等人的引导化合物的生物学研究论文已经由H.A.Overton等人发表，登在Virology，179，508(1990)上，由J.A.Martin等人发表的登在Biochem、Biophys.Res.Commun.，176，180(1991)上和由J.C.Craig等人发表的登在Antiviral Chemistry andChemotheraphy，2，181(1991)上。
其它公开的具有羟乙基胺TSA的HIV蛋白酶抑制剂的包括B.K.Handa等人，欧洲专利申请案第346847号，1989，12，20公开。
G.B.Dreyer等人，欧洲专利申请案第352000号，1990，1，24.公开。
D.J.Kempf等人，欧洲专利申请案第402646号，1990，12，19.公开。
和K.E.B.Parkes等人，加拿大专利申请案，第2，030，415号，1991，6，12.公开。
J.A.Martin和S.Redshaw，欧洲专利申请案，第432695号，1991，6，19.公开。
本发明描述了取代的吡咯烷衍生物，这些衍生物具有乙基胺TSA结合在它们的结构内。这些衍生物都是HIV蛋白酶的有效抑制剂。尤其是这些化合物具有抑制HIV导致的人体细胞的细胞病变的能力已被展示。这些性质，加之相对选择性作用的属性以及明显的无毒性，使这类化合物成为与HIV感染对的有用药物。
本发明的化合物如式1所示
其中X为R2OC(O)，R2C(O)或R2NR2C(O)，其中R2为(ⅰ)低碳烷基，(ⅱ)低碳环烷基，(ⅲ)苯基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基，(ⅳ)苯基(低碳)烷基或苯基(低碳)烷基，其中它的芳香基部分以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代，(ⅴ)1-萘基或2-萘基，(ⅵ)(Het)或(Het)-(低碳烷基)，其中Het表示5或6元、含有1个或2个选自氮、氧和硫的杂环原子的单价杂环基，或(ⅶ)2-喹啉基或3-喹啉基，而R2为氢或低碳烷基;
或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或以低碳烷基或卤素单取代的、双取代的或三取代的苯基;
B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基;低碳环烷基;(低碳环烷基)-(低碳烷基);苯基甲基;或以羟基、羧基、低级烷氧羰基、氨基羰基、(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基;
R1为低碳烷基或低碳环烷基;
Y为低碳烷基;低碳环烷基;苯基或以卤素，羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基;苯基甲基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基甲基;或Y为W(CH2)
Z，其中W为氧代、硫代、亚硫酰基或硫酰基，Z为低碳烷基;苯基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基;或(Het)，其中(Het)的定义如前所述;而n为0或1;
或式(1)化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
关于式1中术语“B为不存在”，表示符号B已经成为把“X”连接到该仲氨基上的共价健，否则这个氨基将被连接到“B”。
用式1表示一组较佳的本发明化合物，其中X为R2OC(O)或R2C(O)，其中R2为低碳烷基;苯基(低碳)-烷基;苯基(低碳)烷基，其中苯基部分的位置4由氯、氟、羟基、甲基或甲氧基所取代;1-萘基;2-萘基;2-呋喃基;2-噻嗯基;2-吡啶基;4-吡啶基;2-吡啶基、甲基;4-噻唑基甲基或2-喹啉基;或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或以低碳烷基或卤素在选自位置2，4和6的位置作单、双或三取代的苯基;
B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基，或以羟基单取代的低碳烷基，低碳烷氧基羰基，氨基羰基，(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基;
R1为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，2-甲基丙基，环丙基，环丁基，环戊基或环己基;
Y为低碳环烷基、苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-氟苯基、4-甲苯基、4-甲氧苯基、苯甲基、(4-氟苯基)甲基或(4-甲苯基)甲基;或Y为W(CH2) Z，其中W和n的定义如前所述，而Z为低碳烷基、苯基、2-呋喃基、2-噻嗯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、4-噻唑基、2-嘧啶基、4，6-二甲基-2-嘧啶基或2，6-二甲基-4-嘧啶基;
或该组较佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式1表示一组更佳的化合物，其中X为叔-丁氧羰基、苄氧羰基、(4-氯-苯基)甲氧羰基、(4-羟苯基)甲氧羰基、(4-甲氧苯基)甲氧羰基、乙酰基、苯甲酰基、1-萘羰基、2-萘羰基、2-吡啶甲氧羰基、2-喹啉羰基、苯氧乙酰基、(2-甲苯氧基)乙酰基、(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基、(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基、(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基、(4-氯苯氧基)-乙酰基或(4-氟-2，6-二甲基苯氧基)乙酰基;
B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，甲氧羰基甲基，乙氧羰基甲基或氨基羰基甲基;
R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;
Y为环己基，苯基，4-氯苯基，4-氟苯基，4-甲氧苯基，苄基，(4-甲氧苯基)甲基，2-甲基丙氧基，苯氧基，2-吡啶氧基，3-吡啶氧基，4-吡啶氧基，2-嘧啶氧基，4，6-二甲基-2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，2-吡啶甲氧基，4-噻唑基甲氧基，2-嘧啶甲氧基，苯硫基，苯亚硫酰基，苯硫酰基，2-吡啶基硫基，3-吡啶基硫基，4-吡啶基硫基，2-嘧啶基硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶基硫基，苄硫基，苄亚硫酰基，苄硫酰基，(2-吡啶甲基)硫基，(3-吡啶甲基)硫基或(4-吡啶甲基)硫基;或该组更佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式1表示一组最佳的化合物，其中X为叔一丁氧羰基，苄氧羰基，乙酰基，2-萘基羰基，2-吡啶甲氧羰基，2-喹啉羰基;
B为缬氨酰基，异亮氨酰基或天冬酰胺酰基;
R1为1，1-二甲基乙基或环丙基，和Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基、2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基;或该组最佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式Ⅰ表示另一组最佳的化合物，其中X为(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基或(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在;R1为1，1-二甲基乙基;而Y的定义如上述最后例子所示;或为该另一组最佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
关于式1的化合物，较好的是其中B为二价基-NHCHR4C(O)-，这个带有R4的不对称的碳原子具有(S)构型。
包括在本发明的范围之内的是一种用于治疗人体HIV感染的药物组合物，这种药物组合物包含式1的化合物，或在治疗上可以接受的它的盐，以及可药用的载体。
本发明的范围亦包括一种用于治疗人体HIV感染的方法，这种方法包括服用有效量的式1化合物，或在治疗上可接受的它的盐。
在此范围中还包括一种用于保护人体细胞抵抗HIV发病机理的方法，这种方法包括用抗-HIV有效量的一种式1化合物或在治疗上可接受的它的盐，处理上述的细胞。
下文叙述制备式1化合物的方法。
通常，这里所用的供标明氨基酸与保护基的缩写，是以IUPAC-IUB生物化学命名委员会的建议为基础的，见European Journal of Biochemistry 138，9，(1984)。例如，Val，Ile，Asn，与Len分别表示L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、与L-亮胺酸的残基。
本文所用的术语“低碳烷基”，单独或和原子团结合，表示含有1至6个碳原子的直链烷基基团和含有3至4个碳原子的支链烷基基团以及包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基，1-甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基和1，1-二甲基乙基。
本文所用的术语“低碳环烷基”，单独或和原子团结合，表示含有自3至6个碳原子的饱和的环烃基，以及包括环丙基、环丁基、环戊基与环己基。
本文所用的术语“低碳烷氧基”表示含有1至6个碳原子的直链烷氧基，含有3至4个碳原子的支链烷氧基以及包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、己氧基，1-甲基乙氧基，丁氧基和1，1-二甲基乙氧基。后一基团通常称为叔一丁氧基。
本文所用的术语“卤素”表示选自溴、氯、氟或碘的卤素基。
本文所用的术语“Het”表示从5-或6-元饱和的或不饱和的杂环中除去一个氢原子而衍生的单价基，该5或6元饱和的或不饱和的杂环含有选自氮、氧和硫的1至2个杂原子。此杂环可任选地带有1或2个取代基;例如，低碳烷基、低碳烷氧基、卤素、氨基或低碳烷基氨基。适合的杂环与可任选取代的杂环的实例包括吡咯烷、四氢呋喃、噻唑烷、吡咯，1H-咪唑，1-甲基-1H-咪唑，异噁唑，噻唑，2-甲基噻唑，2-氨基噻唑，哌啶，1，4-二噁烷，4-吗啉，吡啶，2-甲基吡啶，嘧啶，4-甲基嘧啶和2，4-二甲基嘧啶。
关于氨基酸的术语“残基”，表示自对应的α-氨基酸通过除去羧基上的羟基和α-氨基的一个氢原子而衍生的基。
本文所用的术语“可药用的载体”表示对于活性成份是一种无毒性、通常为惰性的载体，它对活性成份不具不利的影响。
本文所用的术语“有效量”表示本发明的化合物的预定量足够有效地对抗体内的HIV。
方法通常，式1的化合物按已知之方法，使用已知适合于反应物的反应条件来制备。制备方法的描述可于标准教科书内找到，标准教科书诸如"Annual Report In Organic Systheesis-1990(“有机合成之年度报告-1990”)K.Turnbull等人，Eds，大学出版公司，圣地亚哥，加州，美国，1990(与先前的年度报告)，"Vogel′s Textbook of Practical Orgainic Chemistry"(“沃杰的实用有机化学教科书”)，B.S.Furniss等人，Eds，龙门集团有限公司，艾塞司省，英国，1986，与"The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology"(肽分析，合成，生物学")，E.Grass等人，Eds，大学出版社，纽约，纽约州，美国，1979-1987，第1至9册。
更加详细地，制备式1化合物的方法包括(a)将式2的环氧化物，其中X的定义如本文所述
和式3的吡咯烷羧酰胺反应
其中R1和Y的定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X，R1与Y的定义如本文所述，而B为不存在;或(b)将式4的化合物
式中R2与Y的定义如本文所述，和羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，R1与Y的定义如本文所述，而B为不存在;
(c)在偶联剂存在的情况下，偶联式4化合物，其中R1与Y的定义如本文所述，和式X-NHCHR4COOH的α-氨基酸，其中X与R4的定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X、R1与Y的定义如本文所述，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4的定义如本文所述，或
(d)将式5的化合物
其中R1、R4与Y的定义如本文所述，与羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，R2与Y的定义如本文所述，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4的定义如本文所述;以及(e)如果有需要，可将如由前面(a)、(b)、(c)或(d)部分所获得的式1的化合物转变成在治疗上可接受的酸式加成盐。
需注意的是式1化合物的种类，其中X为通常使用的N-保护基，例如Boc，Z，Fmoc或对一甲氧苄氧羰基，用方法(a)和(c)时非常容易而便利地获得。这种种类的容易获得性使它们变得可作为优选路线的中间体，分别经由方法(b)与(d)，以产生式1的相应化合物，其中X不是通常使用的N-保护基。因此，作为中间体，此类式1的化合物将被去保护(也就是说，将保护基除去)，依据方法(b)与(d)将所得的N-末端自由胺用作式4或式5的相应的化合物，依B为不存在或存在，以最终制备式1化合物，其中X不是通常使用的N-保护基，例如，2-吡啶甲氧羰基或2-喹啉羰基。
更为清楚地，按照前面的方法(a)，B为不存在的式1化合物可通过把式2环氧化物加入式3吡咯烷羧酰胺的N-烷基化反应制备。在20°～110℃的温度范围内，使两种反应物在如二醇、四氢呋喃或二甲基甲酰胺的惰性溶剂中接触，能使这种反应合宜地完成。反应时间取决于温度和反应物的性质，通常在2～24小时的范围内。
按照方法(b)，通过式4的相应的化合物和羧酸X-OH(其中X分别为在本文中所定义的R2C(O)或R2AOCH2C(O)的活性衍生物反应，可以获得式1的化合物(其中B不存在，而X为在本文中所定义的R2C(O)或R2AOCH2C(O)。合适的活性衍生物是能够提供适当的酰基X-CO的酰化剂，并且包括相应的酸性卤化物，优先选用氯化物或溴化物，活性脂类，酐类或混合酐类。按照已知的方法和完成反应的条件可以使反应完成。这些方法包括通过选择适当的反应物的比例或者如果需要，通过向与期望的活性基竞争的任何其他的活性基临时提供已知的保护基，来达到所希望的反应选择性的方法。通常，温度为0°～50℃，反应时间从15分钟到24小时的范围内，在如四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二氯甲烷的惰性溶剂中完成这种反应。
按照方法(C)，在偶联剂存在的情况下，通过偶联式4的化合物和式α-NHCHR4COOH的α-氨基酸，可以获得B为二价基-NHCHR4C(O)-的式1的化合物，-NHCHR4C(O)-中的R4如本文中所定义。用偶联剂来促进一个反应物的自由羧基和另一个反应物的自由氨基的脱水偶联是大家熟知的;例如，见“肽分析、合成，生物学”，第1至8卷，出处见上文。合适的偶联剂例子是1，1′-羰基-二咪唑或N，N′-二环己基-碳化二亚胺。其它例子是在N，N′-二环己基-碳化二亚胺存在下的1-羟基苯并三唑或N-乙基-N′-[(3-二甲基-氨基)丙基]碳化二亚胺。一种非常实际和有用的偶联剂是在商业上可获得的(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，无论是其本身或在1-羟基苯并三唑的存在下。另一个非常实际和有用的偶联剂为在商业上可以获得的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基
四氟硼酸盐。
偶联反应在惰性溶剂中进行，惰性溶剂如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺。加入过量的有机胺如二异丙基乙胺或N-甲基吗啉，使反应混合物的酸碱度维持在pH值大约为8。反应温度通常在-20°到30℃左右，反应时间从15分钟到8小时。
参考方法(d)，此方法按上文所述的方法(b)相同的方式实行，唯一的例外是用式5的化合物代替式4的化合物作为起始物料。
用作方法(a)的起始物料的式2的环氧化物都是已知的或者能用已知的方法制备的。更正确地说，式2的环氧化物已由B.K.Handa等人描述，欧洲专利申请案第346，847号，1989，12，20.公开，或者式2的环氧化物可由该专利申请案中描述的方法制造。
这些方法的其它起始物料，也就是说式3的吡咯烷羧酰胺，与式4及式5的化合物，均为新化合物，因此，成为本发明的目的之一。制备式4与5的化合物的适合方法已于上文提到。通过对已知相应的吡咯烷羧酸的标准胺化作用，可以制备式3的吡咯烷羧酰胺。其亦可用F.Soucy，D.Wernic与P.Beaulieu的方法制备。J.Chem.Soc.Perkins Trans.1，2885(1991)。生产式5的吡咯烷羧酰胺的方法将于下文的实例中说明。
本发明的式1化合物可以在治疗上可接受的酸式加成盐的形式而获得。这些盐类的实例为带有有机酸的盐类，所说的有机酸如乙酸、乳酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸或对-甲苯磺酸，亦可为聚合酸，如单宁酸或羧甲基纤维素，和带有无机酸的盐类，所说的无机酸如氢卤酸，例如盐酸，硫酸，或磷酸。假如想要，可把1个具体的酸式加成盐转化为另一种酸式加成盐，例如无毒性、可药用的盐，即可通过用登在Helv.Chim.Acta，43，1849(1960)上、由R.A.Boissonnas等人描述的方法，用适当的离子交换树脂处理。
通常，在治疗上可接受的式1的肽的盐类在生物学上完全相当于这些肽本身。
式1的化合物或在治疗上可接受的它的盐的HIV蛋白酶抑制性质和抗HIV致病原因的细胞保护作用，可通过生物化学的、微生物学的与生物学的方法说明。
用于说明式1的化合物或它们的在治疗上可接受的盐类的HIV蛋白酶抑制性质的一种特别有用的方法为“重组HIV蛋白酶HPLC分析法”。此方法以试验化合物抑制具有氨基酸序列的十肽(底物)的HIV蛋白酶的酶水解的能力为基础，这种氨基酸系列含有一个已知的HIV聚蛋白质的HIV蛋白酶断裂点;见H.G.Krausslich等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，86，807，(1989)。这种分析法的详述以及作为式1化合物的例子所获得的结果在下文的实例中叙述。
式1的化合物或在治疗上可接受的它们的盐类保护细胞抵抗HIV感染的能力，可以用评估试验化合物对人体T细胞系内HIV的细胞致病性的抑制作用的微生物学的方法说明。这些方法的典型例子描述于S.Harada与N.Yamamoto，Jpn.J.Cancer Res.(Gann)，76，432(1985)，和S.Harada等人，Science，229，563(1985)。以后者方法为基础的一种分析法在下文的实例中叙述。
当本发明的化合物，或在治疗上可接受的它的盐，用于和人体的HIV感染作斗争时，可以用一种含有一种或多种可药用的载体的赋形剂经口腔、表皮或非胃肠道引入肽，各种载体的比例取决于这种化合物的溶解度和化学性质，所选择的给药途径和生物学上标准的应用。对于口服给药，可以将这种化合物或在治疗上可接受的它的盐配制成单位剂量形式，例如胶囊或片剂，在可药用的载体内，每个胶囊或片剂大约含5～150mg预定量的活性成分。对于表皮给药，可以将这种化合物用可药用的、含有0.01～2%，最好是0.05～1%活性剂的赋形剂配制。这类配方可为乳膏、洗剂、舌下片剂最好是经皮给药的贴剂或颊贴剂。对于非胃肠道给药，以带有可药用的赋形剂或载体的组合物的形式，通过静脉、皮下或肌肉注射引入式1的化合物。对于通过注射给药，使用在无菌液体赋形剂中的化合物溶液是较佳的，这种赋形剂也可以含有别的溶液，例如缓冲剂或保护剂以及足够量的可药用的盐类或葡萄糖，以使溶液等渗压。
用于上述配方的适合的赋形剂或载体可以在标准的教科书中找到，例如，在"Remington′s Pharmaceutical Sciences"，18th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Penn，1990.(“雷明顿的制药科学，第18版，麦克出版公司，伊斯顿，宾州，1990)。
化合物的剂量随给药方式和所选择的具体的活性剂而变化。而且，将随治疗下的特定宿主而变。通常，治疗以小剂量开始，明显小于肽的最佳剂量，其后，此剂量以小的增加量增加直至在该情况下达到最佳的效果。通常，非常希望在一般能产生抗病毒效果的结果而不会造成任何不利的或有害的副作用的浓度水平引入这种化合物。
对于口服给药，每天每公斤体重5～150mg，较佳的范围为每公斤5～50mg，引入这种化合物或在治疗上可接受的盐。关于全身性给药，虽然前面提到的变化情况会发生，以每天每公斤体重10μg～1000μg的剂量引入式1的化合物。
对于医治HIV感染，虽然上文揭示的各种配方都是有效和相当安全的药物，但不排除这些配方和其它的抗病毒药物或药剂的同时服用可获得有利的结果的可能性，象这样的其他的抗病毒药物或药剂包括可溶的CD4，利多伍啶(Zidovudine)，迪多诺欣(didanosine)、查西他宾(Zalcitabine)，膦甲酸三钠，三唑核苷(ribavarin)、无环鸟苷(acyclovir)，或抗病毒的干扰素，(例如，α-干扰素或中间白细胞素-2(interleukin-2))。
下述实例进一步说明本发明。溶液百分比或比例表示体积对体积的相互关系，除非另作说明。温度以摄氏度数表示。在Bruker 200MHz光谱计上记录质子核磁共振(NMR)光谱;以每百万分(PPM)记录该化学位移(δ)。在实例中使用的缩写包括Boc叔-丁氧羰基;Bop(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐;Bu叔-丁基;BZL苄基;DIEA二异丙基乙基胺;DMF二甲基甲酰胺;HEPESN-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙基磺酸;Et2O乙醚;EtOAc醋酸乙酯;EtOH乙醇，HPLC高效液体色谱MeOH甲醇;Ph苯基;THF四氢呋喃;Z苄氧羰基。
实例14(S)-苄氧基-N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺的制备。
(a)N-保护的酸，1-(叔-丁氧羰基)-4(S-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸，通过4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸｛顺-4-羟基-L-脯氨酸，由S.G.Ramaswamy与E.Adams所描述，登在J.Org.Chem.(有机化学期刊)，42，3440(1977)上｝和二-叔-丁基碳酸盐，在过量NaOH的存在下，在THF/H2O(1∶1)溶液中于室温下反应18小时来制备。
(b)将这样获得的N-保护的酸(400mg，1.73mmol)溶解在DMF(7ml)中。将氢化钠(99%，87mg，3.63mmol)加入到此溶液中。将此混合物在室温下(20～22℃)搅拌2小时，加入苄基溴(1.03ml，8.65mmol)并将此混合物于室温下搅拌18小时。其后，将此混合物用EtOAc稀释，冷却到0℃并且加入10%的柠檬酸水溶液使成酸性(pH3)，分离有机层，用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。残留的黄色油状物用色层分离法纯化(SiO2，洗脱液∶己烷-醋酸乙脂，9∶1)，可得到4(S)-苄氧基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酸苄基脂(301mg，70%)。
(c)将新得化合物(301mg，0.73mmol)溶于MeOH/H2O(2∶1，4ml)中，将此溶液搅拌并冷却至0℃。加入2M的氢氧化钠水溶液(1.16ml)，10分钟后，使混合物升温至室温，然后在同样的温度下搅拌18小时。其后，用Et2O/己烷(1∶1，10ml)和水(5ml)将反应物稀释。分离水相，用Et2O/己烷(1∶1)萃取2次，冷却至0℃，用10%的柠檬酸水溶液使成酸性(pH3)，并用EtOAc萃取(3次)。混合的EtOAc萃取物用水(2次)和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并在减压下浓缩。将残留物于高真空下干燥得到4(S)-苄氧基-1-(叔-丁氧羰基)-吡咯烷-2(S)-羧酸的定量产品。
(d)将在CH2Cl2中的新得化合物的0.2M溶液(234.7ml，0.73 mmol)加到DIEA(127μl，0.74m mol)中，随后加入叔-丁胺(84.4μl，0.803m mol)与BOP(387mg，0.0876m mol)。通过定时检验将反应混合物的pH值维持在8(在需要时，可加入DIEA)的同时，在室温下将反应混合物搅拌3小时。其后用EtOAc将反应化合物稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(2次)、水与盐水依次地洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。将所得的黄色油状物用快速色层分离法(flash chromatography)(Sio2，洗脱液∶己烷-EtOAc，7∶3之后6∶4)纯化，可获得标题化合物(252mg，92%)。1NMR(CDCl3)δ7.40-7.25(m，5H)，6.05(broad s，1H)，4.6-4.35(broad d，2H)，4.2-4.05(m，2H)，3.8-3.55(m，2H)，2.55-2.1(m，2H)，1.46(s，9H)，1.20(broad s，9H)。
实例21-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(S)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式4∶R1＝C(CH3)3，和Y-OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备(a)将在6N盐酸/二噁烷中实例1的标题化合物的(250mg，0.664m mol)的溶液，在室温下搅拌20分钟，然后在减压下浓缩至干燥。将残留物用EtOAc(10ml)与2N NaOH水溶液(3ml)稀释。将此混合物在室温下搅拌15分钟。分离有机层，用最小量的水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并于减压下浓缩至干燥。将残留物于高真空下干燥，可得4(S)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，即式3的羧酰胺其中R1为C(CH3)3，Y为OCH2Ph{C(O)NHR1/Y＝顺式｝。
(b)将新得化合物在无水EtOH(5ml)中与3(S)-(苄氧羰基)-1，2(R)-环氧-4-苯基丁烷(180mg，0.604m mol)混合，就是式2环氧化物，其中X为Z，见上文B.K.Handa等人，将混合物回流加热18小时，然后在减压下浓缩至干燥。通过快速色层分离法将残留物纯化(SiO2，洗脱液CHCl3-MeOH，39∶1然后19∶1)，可得4(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛(苄氧羰基)氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(220mg，63%)，为白色泡沫状。
(c)新得化合物(220mg，0.384m mol)经过氢解作用(5%Pd/C，1氢气的大气压，MeOH，3.5小时)，可得标题化合物，该化合物按照下列实例的偶联方法立即用。
实例34(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3，和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备按照下述的偶联方法制备标题化合物将DIEA(33.4μl，0.192m mol)，保护的氨基酸Z-Val-OH(53.1mg，0.211m mol)和Bop(102mg，0.23m mol)加到在CH2Cl2中实例2的标题化合物(0.192m mol)的0.2M溶液中。在将混合物在室温下搅拌2小时的同时，通过定时检验将反应混合物的pH值维持在8，并在需要时可加入DIEA。其后，将反应混合物用EtOAc稀释，用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水和盐水依次洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并于减压下浓缩。将残留物用快速色层分离法纯化(SiO2，洗脱液∶CHCl3-MeOH，39∶1)，可得本实例之标题化合物，为白色固体(108mg，83%)。FAB质量光谱，m/z673.3(M H) 。
实例44(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1、2、3顺序的方法，但将实例1(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸(反式-4-羟基脯氨酸-2-羧酸)替代，见上文S.G.Ramaswamy与E.Adams，则可获得标题化合物。FAB质量光谱，m/z673.3(M H) 。
实例54(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1，2顺序的方法，但将实例1的(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)羧酸替代，并将如此得到的1-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酸胺进行下述的偶联步骤，则可得标题化合物。
将1-羟基苯并三唑(20.1mg，0.148m mol)加到冷却到0℃的THF(2mL)中的N，N′-二环己基碳化二亚胺(34mg，0.165m mol)溶液中。将此混合物搅拌15分钟。将在DMF(1mL)中经保护的氨基酸Z-Asn-OH(395mg，0.148m mol)溶液和前述的1-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(35.4mg，0.083m mol)溶液加到此混合物中。使此混合物缓慢的升温至室温，随后搅拌18小时。其后，用EtOAc将此混合物稀释。将有机相分离，用饱和的NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，在减压下浓缩至干燥。用快速色层分离法(SiO2，洗脱液∶EtOAc/MeOH，97∶3然后19∶1)将该白色残留物纯化，可得本实例的标题化合物。EI质量光谱，m/e689.2(M 2H) 。
(注意先前例举的在N，N′-二环己基碳化二亚胺存在的情况下，利用1-羟基苯并三唑的偶联方法代表为制备B为氨基酸残基Asn的式1化合物的较好的偶联方法。)实例64(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1-C(CH3)3，和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备按照实例1与2顺序的方法和实例5的偶联方法，可获得标题化合物。FAB质量光谱，m/z688.4(M H) 710.4(M Na) 。
实例71-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(S)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺｛式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2CH(CH3)3;C(O)NHR1/Y＝顺式｝的制备按照实例1，2与3顺序的方法，但将实例1的(b)节步骤中的苄基溴用等量的2-甲基丙基溴替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/z583.3(MH2-C4H3) 。
实例81-(｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(R)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺｛式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2CH(CH3)2;C(O)NHR1/Y＝反式｝的制备按照实例1、2与3顺序的方法，但将实例1的(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸替代，在实例1(b)节步骤中的苄基溴用等量的2-甲基丙基溴替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/e583.3(MH2-C4H3) 。
实例94(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-环丙基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝环丙基和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1、2与3顺序的方法，但将实例1(a)节中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸替代，而于实例1(d)节中的叔-丁胺用等量的环丙胺替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/e657.5(M H) 。
实例104-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R，S)、4(R)与4(S)的异构体(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1＝C(CH3)3和Y＝BzL)的制备通过用上述由F.Soucy，D.Wernic与P.Beaulieu所描述的方法，4-苄基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酸的4(R)与4(S)非对映异构体的混合物(3∶2，W/W)，可由丝氨酸内酯与3-苯基-2-丙烯溴获得。按照实例1(d)节的步骤，在BOP存在的情况下，该非对映异构的混合物和叔-丁胺偶联，可得到4-苄基-N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R)与4(S)的异构体的相应的非对映异构的混合物。其后，按照实例2(b)节的步骤并使用新得非对映异构的混合物作为式3的羧酰胺，则可得到4-苄基-1-｛3(S)-｛(苄氧羰基)-氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基-丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R)与4(S)异构体的相应非对映异构的混合物。FAB质量光谱，m/z558(M H) 。接着，按照实例5的偶联方法，后者非对映异构的混合物与N-保护的氨基酸Z-Asn-OH反应，可得4-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4R与4S异构体的相应的非对映异构的混合物。FAB质量光谱，m/z672(M H) 。
用HPLC技术分离的这两个异构体，可得到相应的纯4R与4S异构体。更进一步的举例说明。将20mg上文最后提到的混合物的样品溶解在2.5mL的50%醋酸水溶液中(起始条件)，装在Whatman Magnum 9
中，C10十八甲硅烷基柱(0.94×50cm)中。起始的柱平衡条件如下10%A与90%B(泵A0.06%三氟醋酸于乙腈中，泵B0.06%三氟醋酸于水中)。一旦相应于醋酸(在溶剂前面)的高峰通过，一个线性梯度就跟着而来。异构体分离方案如下在3mL/min和230nm下，10-30%的A5分钟，30%的A10分钟，随后，30-100%的A110分钟。4(R)异构体与4(S)异构体分别在60%A(9.2mg)和63% A(8.3mg)下被收集。
实例11N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝-丁基｝-4(R)-(2-嘧啶基硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1X＝2-喹啉羰基，B＝Val，R1＝(C(CH3)3和Y＝2-嘧啶基硫基)的制备(a)将N-保护的酸(17.5g，75.6m mol，描述于实例1(a)节)溶解在CH2Cl2(300mL)与EIDA(13mL，76.6m mol)中。将叔-丁胺(8.73mL，83.1m mol)加到此溶液中，随后加入BOP(40g，90.7m mol)与DIEA(13mL，151m mol)。将混合物于室温下搅拌7小时，随后用EtOAc稀释。分离有机相，用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水(2次)和盐水(2次)洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干燥。用Et2O/EtOAc(9∶1)将固体残留物研制，收集在过滤器上，用Et2O洗涤并干燥，得到N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(15.6g，72%)。
(b)将新得化合物(5.0g，17.5m mol)溶解在甲苯/THF(3∶1，175mL)中。在室温下将三苯膦(5.72g，21.8m mol)与咪唑(1.08g，30.5m mol)加到此溶液中。将此混合物升温至45-50℃，加入碘(5.54g，21.8m mol)在45-50℃下用力搅拌混合物80分钟。其后，将反应混合物冷却并用Et2O和水稀释。分离有机层，用饱和的NaHCO3水溶液(1次)和盐水(1次)洗涤、干燥(MgSO4)并蒸发至干燥，则可得棕色油状物，内含少许固体(三苯膦氧化物)。将油状固体用Et2O研制并将固体收集在过滤器上。将滤液蒸发至干燥，则可得棕色油状物。用快速色层分离法将该油状物纯化(SiO2，洗脱液EtOAc/己烷，1∶4)，可得N-叔-丁基-1-(叔-丁基羰基)-4(S)-碘吡咯烷-2(S)-羧酰胺，为黄色固体(4.83g，70%)。1NMR(CDCl3)δ6.2-6.0(broads，1H)，4.27-4.0(m，3H)，3.75-3.55(m，1H)，2.9-2.5(m，2H)，1.47(s，9H)，1.38(s，9H)。
(c)将2-嘧啶硫醇(1.06g，9.46m mol)分批加到冷却的(0℃)DMF(10mL)中的氢化钠(99%，182mg，7.57m mol)悬浮液中。将混合物在相同的温度下搅拌30分钟。其后，将在DMF(5ml)中的上文(b)节的产物(1.5g，3.79m mol)的溶液滴入该混合物。将此反应混合物于室温下搅拌18小时后，再用EtOAc和水稀释。分离有机相，用冷水(1次)、1N的NaOH水溶液(2次)在盐水(1次)洗涤、干燥(MgSO4)，并蒸发至干燥，得到固体。将此固体用Et2O研制，可得N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，为一种灰白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ8.53-8.51(d，J＝4.85Hz，2H)，7.01-6.96(t，J-4.85，10.0Hz，1H)，5.97-5.75(broad s，1H)，4.4-4.2(m，2H)，4.1-3.91(m，1H)，3.70-3.35(m，2H)，2.92-2.75(m，1H)，1.47(s，9H)，1.36(s，9H)。FAB质量光谱(m/z)381(M H) ，403(M Na) 。
(d)按照实例2(a)与(b)节的步骤，将新得化合物去保护，并与式2的环氧化物(其中X为Boc)反应，可得N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛(叔-丁氧羰基)氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺。FAB质量光谱，m/z;544(M H) ，566(M Na) 。
接着，按照实例2(a)节的步骤，将新得化合物去保护，并按照实例3的方法与Boc-Val-OH偶联，可得N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛N-(叔-丁氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺。FAB质量光谱(m/z)643(M H) 665(M Na) 。
(e)将于6N盐酸/二噁烷(7mL)中的新得化合物(887mg，1.38m mol)溶液于室温下搅拌20分钟。在减压下将溶剂移去。一种为白色固体的残留物在高真空下干燥20分钟，得到相应的去保护胺，为盐酸盐。将新得盐溶解在CH2Cl2(7mL)和DIEA(481μL，2.76m mol)中。把2-喹啉羧酸(263mg，1.52m mol)与BOP(732mg，1.66m mol)加入该盐的溶液中。在通过定时检验，将此混合物的pH值维持在8(在需要时可加入DIEA)的同时，将此反应混合物在室温下搅拌5小时。其后，将反应混合物用EtOAc稀释，并依次用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水(2次)与盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。所得的无色油状物用快速色层分离法(SiO2，洗脱液∶己烷-EtOAc，3∶7然后1∶9)纯化，得标题化合物，为白色泡沫状物(750mg，78%)。将该泡沫状物用Et2O研制，可得标题化合物，为白色固体(378mg，40%)。FAB质量光谱(m/z698(M H) ，720(M Na) 。化合物的NMR与指定的结构一致。
按照本实例的方法，但将(c)节内的2-嘧啶硫醇用3-吡啶甲硫醇替代，则可得N-叔-丁基-1-(2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝-氨基｝丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺。
FAB质量光谱m/z711(M H) ，733(M Na) 。
再次，按照本实例的方法，但将(c)节内的2-嘧啶硫醇用2，6-二甲基-4-羟基嘧啶取代，则可得N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-｛(2，6-二甲基-4-嘧啶基｝氧基｝
式中X是氧保护基团，
b)使式Ⅳ特定差向异构体与式Ⅴ化合物反应，生成相应的式Ⅵ特定差向异构体，所述式Ⅴ和式Ⅵ如下
作实例11中N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝-丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺的中间体)，得到N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-｛(3-嘧啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，FAB质量光谱m/z619(M H) ，641(M Na) 。
实例13重组HIV蛋白酰HPLC分析酶在大肠杆菌中可表达出HIV蛋白酶｛构建体pBRTlprt ，见W.G.Farmerie等人，Science，236，305(1987)，按照下面的条件除非另有说明，所有的溶液均为水溶液。
(ⅰ)发酵含有pBRTl prt 质粒的大肠杆菌细胞，用来接种由含100μg/mL的氨苄青霉素的卢-柏肉汤(Luria-Bertani Broth)组成的种子培养基。将烧瓶于37℃在震动下培养17小时。含有无菌M9肉汤的制备烧瓶，补充100μg/mL的氨苄青霉素，用上述的种子培养基，以1%(V/V)的浓度接种。在每一个制备烧瓶中的总体积为2L的欧伦麦耳氏(Erlenmeyer)烧瓶中的500mL。将烧瓶于37℃在震荡下培养直至细胞浓度达到对应的光密度为0.6(λ＝540μm)(没有稀释)。这种时间间隔通常为3-4小时。然后给烧瓶补充5mM三异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Organics，Cleveland，Ohio，USA)，并继续培养至细胞浓度于16-倍稀释下光密度为0.2。然后补充1mM的苯基甲基磺酰氟(PMSF)至烧瓶，并快速冷却至4℃。细菌细胞于4℃下离心回收。将湿的小片在-70℃下贮存。
(ⅱ)分析级酶的提取与制备以下所有的步骤均于4℃下实行，除非另有说明，混合解冻细胞与缓冲液A｛50mM的三(羟基甲基)氨基乙烷盐酸(Tris-HCl，pH7.4);0.6mM的乙二胺四乙酸(EDTA);0.375M的NaCl，0.2%的Nonidet p
(BDH Chemical，Ltd.，Povle，UK);1mM的PMSF}，其比例为1份细胞对9份缓冲液A。加入硅藻土(Celite 545
，John Manville，Lompoc，CA，USA)，其比例为2份对1份湿细胞重量。产生的糊状物于高速(约20，000rpm)下在Waring
工业搅拌器上进行均化8×15秒脉冲。细胞碎片/Celite
从离心收集，使用上述的均质化步骤将产生的小片用4.5份的缓冲液A对1份湿固体进行提取。混合由上述两个均质化步骤而来的上清液，并加入固体的(NH4)2SO4，将可溶性的蛋白质沉淀，以产生75%饱和的终浓度。将该混合物震动60分钟并离心收集沉淀物。将产生的小片悬浮于缓冲液B｛50mM Tris-HCl，pH8;30mM NaCl，1mM DL-二硫苏糖醇(DTT);1mM EDTA;1mM PMSF;10%甘油｝中，并对同一缓冲液透析18小时。
将一部分含有150mg蛋白质的透析提取物装入床尺寸为长70cm、直径2.5cm的Sephadex A 25阴离子交换柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。用缓冲液B以10cm/小时的线性流速将样品均匀地洗提。混合含有HIV蛋白酶活性部分(见下述的分析描述)，并通过添加饱和的(NH4)2SO4水溶液，将可溶性蛋白质沉淀，以产生85%饱和的总(NH4)2SO4浓度，将沉淀的蛋白质用离心分离作用移去，并将产生的小片溶解在缓冲液C｛50mM的2-(4-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH5.5;150mM NaCl;1mM DTT;1mM EDTA;10%甘油｝。该制备物对缓冲液C透析18小时，再冷冻在-70℃。所有的粗提取物都以含有150mg蛋白质的等分试样用如前述的色层分析的相同方法纯化。把每一批的终制备物汇集起来，分装成34μL的等分试样并存于-70℃。通常由20L发酵物回收的终蛋白质为300mg，并具有18.2m mol底物水解的/分/mg的HIV蛋白酶比活性。
在使用之前，将这些等分试样用缓冲液体稀释到原来浓度的1/18(即酶工作溶液)，见下文。
底物VSFNFPQITL-NH2，MW 1164，见Krausslich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，807(1989)，用作底物。将底物在DMSO中制成10mM贮液，存于4℃下。在使用前，将贮液用缓冲液稀释而得400μm溶液(即底物工作溶液)。
缓冲液将MES(100mM)，KCl(300mM)与EDTA(5mL)溶于蒸馏水(90mL)，并将溶液用浓NaOH水溶液调整到pH5.5。将新得溶液以水稀释成100mL以形成缓冲液。
步骤(1)通过混合20μL的底物工作溶液、10μL在10%DMSO中的试验化合物的溶液和10μL的酶工作溶液来制备分析混合物。(2)将分析混合物于37℃下培养30分钟。(3)通过加入200μL2%的三氟乙酸水溶液使反应骤停。(4)利用一个具有逐级梯度为4mL/min流速的Perkin-Elmer 3×3CRC8柱(Perkin Elmer Inc.，Norwalk，CT，USA)，使100μL骤停的分析混合物用HPLC而使底物与产物(即VSFNF与PQITL-NH2)分离。
该梯度如下0.0-0.5分钟，70%A/30%B;
0.5-3.0分钟，67%A/33%B;
3.0-5.0分钟，20%A/80%B;
5.0-6.5分钟，70%A/30%B;
其中A为3mM十二基硫酸钠/0.05%H3PO4于水中，而B为0.05%H3PO4于乙腈中，在210mM时监视洗提。
(5)将一参照物，它是无试验化合物的分析混合物，同时经受步骤2～4。
抑制研究水解产物与残留的原底物以峰高度或以适当的HPLC峰的积分来定量。使用下列关系计算底物转化%转化＝ (产物的峰高或峰域总和)/(底物与产物的峰高或峰域总和) ×100试验化合物的酶抑制的计算如下所述%抑制＝100- (分析混合物的%转化)/(参照物的%转化) ×100引起HIV-蛋白酶的50%抑制的试验化合物的浓度，即IC50，可按下述确定确定酶的抑制百分比，作为试验化合物的三种不同浓度的最小值。据此，通过将酶的抑制百分比对试验化合物的浓度作图，用图解法确定IC50。
作为式1化合物的例子的IC50，按重组HIV蛋白酶HPLC分析确定，列于下表中。
表Ⅰ
表Ⅰ(续)
实例13用于筛选式1化合物的抗病毒效果的下述条件，借用于先前由上述Harada等人发表的用HTLV-1转化细胞的空斑分析。之所以使用HTLV-1转化细胞，是因为HIV在该细胞中复制的快速性。
1.将试验化合物溶解在二甲基亚砜中至其浓度为5mg/mL。将所得的溶液可储存在4℃至使用。
2.将得到的溶液在RPMI 1640中(Gibco Laboratories，St.Lawrence，MA，USA)稀释到4倍(4X)，测试终浓度。一旦在RPMI 1640中稀释，该溶液需在4小时内用于细胞培养分析。
3.将该4倍溶液(50μL)加到96小孔平底微量滴定板的一式三份小孔中，将RPML(50μL)也加到对比小孔中。
4.将在50μL的HEPES-缓冲的RPMI 1640(pH＝7.2)中的C8166细胞(5×104)、10%热失活的胎牛血清(FCS)、12.5μL/mL的庆大霉素(完全培养基)加到所有的小孔中。
5.将在100μL的完全培养基中H9/HTLV-ⅢB贮液(存于液氮中，作为在50�S中细胞培养上清液)的50倍TCID50，加到所有的小孔中。病毒贮液的感染性效价如先前那样由C8166细胞的终点稀释所确定。贮液效价在储存于-193°下可稳定6-12个月。
6.然后将微量滴定板在37℃、5%潮湿的二氧化碳培养箱的层架上放72小时。7.然后将平板取出，并用低功率相衬光学显微镜计算在每一小孔中合胞体的中心数。显示任何合胞体形成的证据的每簇细胞即计为一个合胞体中心。对比小孔应使每小孔具有25-75个合胞体中心。
8.合胞体形成的抑制百分比用下式计算%抑制＝100× ((对比小孔中的合胞体中心数)-(测试小孔中的合胞体中心数))/((对比小孔中的合胞体中心数))引起抑制50%合胞体形成的的试验化合物的浓度，即EC50，由在步骤3中工作溶液的顺序稀释所使用的技术与用观测到的合胞体形成的抑制百分比对试验化合物的不同浓度所标绘的图形来确定。
在下列表Ⅱ中，作为式1的化合物的例子，列出的分析结果来自本实例的空斑分析。
表Ⅱ
式1的其它化合物为N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯硫酰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4，6-二甲基-2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苄基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-环戊基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯磺酰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺
1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-N-(1-甲基乙基)-4(R)-(2-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-环丙基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)异亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-萘羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4，6-二甲基-2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)异亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺
权利要求
1.一种式1的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐
其中X为R2OC(O)，R2C(O)或R2NR2C(O)，其中R2为(i)低碳烷基，(ii)低碳环烷基，(iii)苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基，(iv)苯基(低碳)烷基或苯基(低碳)烷基，其中它的芳香基部份用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代，(v)1-萘基或2-萘基(vi)(Het)或(Het)-(低碳烷基)，其中Het表示五或六元、含1或2个选自氮、氧与硫的杂环原子的单价杂环基，或(vii)2-喹啉基或3-喹啉基，R3为氢或低碳烷基；或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或用低碳烷基或卤素单取代，双取代或三取代的苯基；B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基；或低碳环烷基；(低碳环烷基)-(低碳烷基)苯基甲基；或用羟基、羧基、低碳烷氧羰基、氨基羰基、(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基单取代的低碳烷基；R1为低碳烷基或低碳环烷基；Y为低碳烷基；低碳环烷基，苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基；苯基甲基或用卤素，羟基，低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基甲基；或Y为W(CH2)nZ，其中W为氧代、硫代、亚硫酰基或硫酰基，Z为低碳烷基、苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基；或(Het)其中(Het)定义如前所述；和n为0或1。
2.权利要求1的化合物，或其在治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为R2OC(O)或R2C(O)，其中R2为低碳烷基;苯基(低碳)烷基;苯基(低碳)烷基，其中苯基部分的位置4用氯、氟、羟基、甲基或甲氧基取代;1-萘基;2-萘基;2-呋喃基;2-噻吩基;2-吡啶基;4-吡啶基;2-吡啶基甲基;4-噻唑基甲基或2-喹啉基;或X为R2AOCH2C(O)其中R2A为苯基或位置2、4和6上，用低碳烷基或卤素单、双或三取代的苯基;B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基;或用羟基、低碳烷氧羰基、氨基羰基，(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基单取代的低碳烷基。R1为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，2-甲基丙基，环丙基，环丁基，环戊基或环己基;Y为低碳环烷基，苯基，4-氯苯基，4-溴苯基，4-氟苯基，4-甲基苯基，4-甲氧苯基，苯甲基，(4-氟苯基)甲基或(4-甲基苯基)甲基;或Y为W(CH2) Z，式中W及n的定义如上，Z为低碳烷基，苯基，2-呋喃基，2-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，4-噻唑基，2-嘧啶基，4，6-二甲基-2-嘧啶基或2，6-二甲基-4-嘧啶基。
3.权利要求2的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为叔-丁氧羰基，苄氧羰基，(4-氯苯基)甲氧羰基，(4-羟苯基)甲氧羰基，(4-甲氧苯基)甲氧羰基，乙酰基，苯甲酰基，1-萘羰基，2-萘羰基，2-吡啶甲氧羰基，或2-喹啉羰基，苯氧乙酰基，(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基，(4-氯苯氧基)乙酰基或(4-氟-2，6-二甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，式中R4为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，甲氧羰基甲基，乙氧羰基-甲基或氨基羰基甲基;R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;Y为环己基，苯基，4-氯苯基，4-氟苯基，4-甲氧苯基，苄基，(4-甲氧苯基)甲基，2-甲基丙氧基，苯氧基，2-吡啶氧基，3-吡啶氧基，4-吡啶氧基，2-嘧啶氧基，4，6-二甲基-2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，2-吡啶甲氧基，4-噻唑基甲氧基，2-嘧啶基甲氧基，苯硫基，苯亚硫酰基、苯硫酰基、2-吡啶基硫基、3-吡啶基硫基、4-吡啶基硫基，2-嘧啶基硫基，4，6-二甲基硫基-2-嘧啶硫基，苄硫基，苄亚硫酰基，苄硫酰基，(2-吡啶甲基)硫基，(3-吡啶甲基)硫基或(4-吡啶甲基)硫基。
4.权利要求3的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为叔-丁氧羰基，苄氧羰基，乙酰基，2-萘基羰基，2-吡啶基甲氧羰基、2-喹啉基羰基;B为缬氨酰基，异亮氨酰基或天冬酰胺酰基;R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;和Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基。
5.权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基或(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在;R1为1，1-二甲基乙基;而Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基。
6.权利要求1的化合物，选自4(S)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(S)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(S)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(R)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-环丙基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(S)-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2-(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)-吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(3-吡啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2-(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-｛(2，6-二甲基-4-嘧啶基｝氧基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)-吡咯烷-2(S)-羧酰胺，和N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺。
7.一种药物组合物，包括权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的盐，和可药用的载体。
8.一种治疗人体HIV感染的方法，包括服用有效量的权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的盐。
9.一种用于保护人体细胞抵抗HIV发病的方法，包括用抗-HIV有效量的权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐，处理该细胞。
10.一种制备权利要求1的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐的方法，包括(a)把式2的环氧化物
其中X如权利要求1中所定义的，与式3的吡咯烷羧酰胺反应，
其中R1与Y如权利要求1所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X，R1和Y如本权利要求中所定义的，而B为不存在;或
其中R1与Y如本权利要求中所定义的，与羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2(O)，其定义同权利要求1，可获得式1的相应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义同本权利要求，R1与Y如本权利要求中定义的，而B为不存在;或(c)将式4的化合物，其中R1与Y如本权利要求中所定义的，在偶联剂存在的情况下，与式X-NHCHR4COOH的α-氨基酸偶联，其中X为R4如权利要求1所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X，R1与Y如本权利要求中所定义的，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4如本权利要求中所定义的;或(d)将式5的化合物
其中R1、R4与Y如本权利要求中所定义的，与羧酸X-OH活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，如本权利要求中所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，如在本权利要求中所定义的，R1与Y如本权利要求中所定义的，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4如本权利要求中所定义的;和(e)假若想要，将前述(a)，(b);(c)或(d)节中所获得的式1的化合物转变成为相应的治疗上可接受的酸式加成盐。
全文摘要
本发明关于式I的化合物其中X为末端基，例如，芳氧羰基或烷酰基；B不存在或为氨基酸残基，例如，缬氨酸或天冬氨酸； R
文档编号C07D207/16GK1096292SQ93106800
公开日1994年12月14日 申请日期1993年6月8日 优先权日1993年6月8日
发明者维达·戈瑞斯, 克里斯蒂安·约克姆, 弗朗克斯·索西, 皮埃尔·L·博兰尤 申请人:比奥·梅加·贝林格尔·英格海姆研究公司
技术领域：
本发明是关于对抵抗特殊的还原病毒显示活性的化合物、生产这些化合物的方法、药物的制备、以及利用这些化合物去和由还原病毒所引起的感染作斗争的方法。
1983年，一种被称为人体免疫缺陷病毒第1型(HIV-1)的还原病毒被确定为后天免疫缺陷综合症(AIDS)的病源体，见R.C.Gallo和L.Montagnier，Scientific American(科学美国人)，259(4)，40(1988)。这种病毒已经成为具有惊人比率的一种疫病。最近，密切相关的病毒，人体免疫缺陷病毒第2型(HIV-2)已被鉴定为AIDS的第2种病源体。
作为病源体的人体免疫缺陷病毒(HIV)的识别和大量繁殖这种病毒方法的发展，已经导致在体外能抑制HIV复制的化合物的发现。照这样识别的抑制剂化合物的最重要的类别是一群属于双脱氧核苷类化合物，其中3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶核苷(也称为利多伍啶(Zidovndine)或AZT)以及新近的2′，3′-双脱氧肌苷(也称为迪多诺欣(didanosine)或DDI)用来治疗某些具有HIV感染症状的病人。业已发现这类化合物通过抑制逆转录酶干扰HIV的生活周期。这种酶把病毒RNA转化为双链的脱氧核糖核酸(DNA)，而其本身是HIV复制的一种必需酶。除了抑制逆转录酶外，HIV生活周期的其他阶段也已弄明，成为发展抗AIDSO药物的目标。越来越受到注意的一个目标是一种被称为HIV蛋白酶的HIV-编码酶。这种酶，象逆转录酶，由pol基因编码，并且对于HIV生长是必需的，它负责使gag(p55)或gag-pol(p180)蛋白质内产生某些分裂而释放出结构蛋白质，例如p17和p24，和酶，包括其本身，这些酶可在成熟的感染的病毒粒子内找到。因此，HIV蛋白酶的抑制剂能阻断HIV的生活周期。
最近几年来对于HIV蛋白酶所给予的日益增长的关注可从发现阻断这种酶的药物报告的增加上反映出来。例如，可看由D.W.Norbeck和D.J.Kempf写的关于蛋白酶的抑制剂方面的最新回顾，登在Annual Report In Medicinal Chemistry，26，141(1991)上。正如在最近的回顾中提到(由D.H.Rich等人发表的，登在J.Med.Chem.33，1285(1990)和N.A.Roberts等人发表的，登在Science，248，358(1990)上)，在具有p17/p24底物断裂点序列的缩氨酸中，通过羟乙基胺过度态类似物(TSA)的取代，可以获得两种有效的HIV蛋白酶抑制剂的系列产品。Roberts等人的引导化合物的生物学研究论文已经由H.A.Overton等人发表，登在Virology，179，508(1990)上，由J.A.Martin等人发表的登在Biochem、Biophys.Res.Commun.，176，180(1991)上和由J.C.Craig等人发表的登在Antiviral Chemistry andChemotheraphy，2，181(1991)上。
其它公开的具有羟乙基胺TSA的HIV蛋白酶抑制剂的包括B.K.Handa等人，欧洲专利申请案第346847号，1989，12，20公开。
G.B.Dreyer等人，欧洲专利申请案第352000号，1990，1，24.公开。
D.J.Kempf等人，欧洲专利申请案第402646号，1990，12，19.公开。
和K.E.B.Parkes等人，加拿大专利申请案，第2，030，415号，1991，6，12.公开。
J.A.Martin和S.Redshaw，欧洲专利申请案，第432695号，1991，6，19.公开。
本发明描述了取代的吡咯烷衍生物，这些衍生物具有乙基胺TSA结合在它们的结构内。这些衍生物都是HIV蛋白酶的有效抑制剂。尤其是这些化合物具有抑制HIV导致的人体细胞的细胞病变的能力已被展示。这些性质，加之相对选择性作用的属性以及明显的无毒性，使这类化合物成为与HIV感染对的有用药物。
本发明的化合物如式1所示
其中X为R2OC(O)，R2C(O)或R2NR2C(O)，其中R2为(ⅰ)低碳烷基，(ⅱ)低碳环烷基，(ⅲ)苯基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基，(ⅳ)苯基(低碳)烷基或苯基(低碳)烷基，其中它的芳香基部分以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代，(ⅴ)1-萘基或2-萘基，(ⅵ)(Het)或(Het)-(低碳烷基)，其中Het表示5或6元、含有1个或2个选自氮、氧和硫的杂环原子的单价杂环基，或(ⅶ)2-喹啉基或3-喹啉基，而R2为氢或低碳烷基;
或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或以低碳烷基或卤素单取代的、双取代的或三取代的苯基;
B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基;低碳环烷基;(低碳环烷基)-(低碳烷基);苯基甲基;或以羟基、羧基、低级烷氧羰基、氨基羰基、(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基;
R1为低碳烷基或低碳环烷基;
Y为低碳烷基;低碳环烷基;苯基或以卤素，羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基;苯基甲基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基甲基;或Y为W(CH2)
Z，其中W为氧代、硫代、亚硫酰基或硫酰基，Z为低碳烷基;苯基或以卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基;或(Het)，其中(Het)的定义如前所述;而n为0或1;
或式(1)化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
关于式1中术语“B为不存在”，表示符号B已经成为把“X”连接到该仲氨基上的共价健，否则这个氨基将被连接到“B”。
用式1表示一组较佳的本发明化合物，其中X为R2OC(O)或R2C(O)，其中R2为低碳烷基;苯基(低碳)-烷基;苯基(低碳)烷基，其中苯基部分的位置4由氯、氟、羟基、甲基或甲氧基所取代;1-萘基;2-萘基;2-呋喃基;2-噻嗯基;2-吡啶基;4-吡啶基;2-吡啶基、甲基;4-噻唑基甲基或2-喹啉基;或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或以低碳烷基或卤素在选自位置2，4和6的位置作单、双或三取代的苯基;
B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基，或以羟基单取代的低碳烷基，低碳烷氧基羰基，氨基羰基，(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基;
R1为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，2-甲基丙基，环丙基，环丁基，环戊基或环己基;
Y为低碳环烷基、苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-氟苯基、4-甲苯基、4-甲氧苯基、苯甲基、(4-氟苯基)甲基或(4-甲苯基)甲基;或Y为W(CH2) Z，其中W和n的定义如前所述，而Z为低碳烷基、苯基、2-呋喃基、2-噻嗯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、4-噻唑基、2-嘧啶基、4，6-二甲基-2-嘧啶基或2，6-二甲基-4-嘧啶基;
或该组较佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式1表示一组更佳的化合物，其中X为叔-丁氧羰基、苄氧羰基、(4-氯-苯基)甲氧羰基、(4-羟苯基)甲氧羰基、(4-甲氧苯基)甲氧羰基、乙酰基、苯甲酰基、1-萘羰基、2-萘羰基、2-吡啶甲氧羰基、2-喹啉羰基、苯氧乙酰基、(2-甲苯氧基)乙酰基、(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基、(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基、(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基、(4-氯苯氧基)-乙酰基或(4-氟-2，6-二甲基苯氧基)乙酰基;
B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，甲氧羰基甲基，乙氧羰基甲基或氨基羰基甲基;
R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;
Y为环己基，苯基，4-氯苯基，4-氟苯基，4-甲氧苯基，苄基，(4-甲氧苯基)甲基，2-甲基丙氧基，苯氧基，2-吡啶氧基，3-吡啶氧基，4-吡啶氧基，2-嘧啶氧基，4，6-二甲基-2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，2-吡啶甲氧基，4-噻唑基甲氧基，2-嘧啶甲氧基，苯硫基，苯亚硫酰基，苯硫酰基，2-吡啶基硫基，3-吡啶基硫基，4-吡啶基硫基，2-嘧啶基硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶基硫基，苄硫基，苄亚硫酰基，苄硫酰基，(2-吡啶甲基)硫基，(3-吡啶甲基)硫基或(4-吡啶甲基)硫基;或该组更佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式1表示一组最佳的化合物，其中X为叔一丁氧羰基，苄氧羰基，乙酰基，2-萘基羰基，2-吡啶甲氧羰基，2-喹啉羰基;
B为缬氨酰基，异亮氨酰基或天冬酰胺酰基;
R1为1，1-二甲基乙基或环丙基，和Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基、2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基;或该组最佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
用式Ⅰ表示另一组最佳的化合物，其中X为(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基或(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在;R1为1，1-二甲基乙基;而Y的定义如上述最后例子所示;或为该另一组最佳化合物在治疗上可接受的酸式加成盐。
关于式1的化合物，较好的是其中B为二价基-NHCHR4C(O)-，这个带有R4的不对称的碳原子具有(S)构型。
包括在本发明的范围之内的是一种用于治疗人体HIV感染的药物组合物，这种药物组合物包含式1的化合物，或在治疗上可以接受的它的盐，以及可药用的载体。
本发明的范围亦包括一种用于治疗人体HIV感染的方法，这种方法包括服用有效量的式1化合物，或在治疗上可接受的它的盐。
在此范围中还包括一种用于保护人体细胞抵抗HIV发病机理的方法，这种方法包括用抗-HIV有效量的一种式1化合物或在治疗上可接受的它的盐，处理上述的细胞。
下文叙述制备式1化合物的方法。
通常，这里所用的供标明氨基酸与保护基的缩写，是以IUPAC-IUB生物化学命名委员会的建议为基础的，见European Journal of Biochemistry 138，9，(1984)。例如，Val，Ile，Asn，与Len分别表示L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、与L-亮胺酸的残基。
本文所用的术语“低碳烷基”，单独或和原子团结合，表示含有1至6个碳原子的直链烷基基团和含有3至4个碳原子的支链烷基基团以及包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基，1-甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基和1，1-二甲基乙基。
本文所用的术语“低碳环烷基”，单独或和原子团结合，表示含有自3至6个碳原子的饱和的环烃基，以及包括环丙基、环丁基、环戊基与环己基。
本文所用的术语“低碳烷氧基”表示含有1至6个碳原子的直链烷氧基，含有3至4个碳原子的支链烷氧基以及包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、己氧基，1-甲基乙氧基，丁氧基和1，1-二甲基乙氧基。后一基团通常称为叔一丁氧基。
本文所用的术语“卤素”表示选自溴、氯、氟或碘的卤素基。
本文所用的术语“Het”表示从5-或6-元饱和的或不饱和的杂环中除去一个氢原子而衍生的单价基，该5或6元饱和的或不饱和的杂环含有选自氮、氧和硫的1至2个杂原子。此杂环可任选地带有1或2个取代基;例如，低碳烷基、低碳烷氧基、卤素、氨基或低碳烷基氨基。适合的杂环与可任选取代的杂环的实例包括吡咯烷、四氢呋喃、噻唑烷、吡咯，1H-咪唑，1-甲基-1H-咪唑，异噁唑，噻唑，2-甲基噻唑，2-氨基噻唑，哌啶，1，4-二噁烷，4-吗啉，吡啶，2-甲基吡啶，嘧啶，4-甲基嘧啶和2，4-二甲基嘧啶。
关于氨基酸的术语“残基”，表示自对应的α-氨基酸通过除去羧基上的羟基和α-氨基的一个氢原子而衍生的基。
本文所用的术语“可药用的载体”表示对于活性成份是一种无毒性、通常为惰性的载体，它对活性成份不具不利的影响。
本文所用的术语“有效量”表示本发明的化合物的预定量足够有效地对抗体内的HIV。
方法通常，式1的化合物按已知之方法，使用已知适合于反应物的反应条件来制备。制备方法的描述可于标准教科书内找到，标准教科书诸如"Annual Report In Organic Systheesis-1990(“有机合成之年度报告-1990”)K.Turnbull等人，Eds，大学出版公司，圣地亚哥，加州，美国，1990(与先前的年度报告)，"Vogel′s Textbook of Practical Orgainic Chemistry"(“沃杰的实用有机化学教科书”)，B.S.Furniss等人，Eds，龙门集团有限公司，艾塞司省，英国，1986，与"The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology"(肽分析，合成，生物学")，E.Grass等人，Eds，大学出版社，纽约，纽约州，美国，1979-1987，第1至9册。
更加详细地，制备式1化合物的方法包括(a)将式2的环氧化物，其中X的定义如本文所述
和式3的吡咯烷羧酰胺反应
其中R1和Y的定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X，R1与Y的定义如本文所述，而B为不存在;或(b)将式4的化合物
式中R2与Y的定义如本文所述，和羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，R1与Y的定义如本文所述，而B为不存在;
(c)在偶联剂存在的情况下，偶联式4化合物，其中R1与Y的定义如本文所述，和式X-NHCHR4COOH的α-氨基酸，其中X与R4的定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X、R1与Y的定义如本文所述，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4的定义如本文所述，或
(d)将式5的化合物
其中R1、R4与Y的定义如本文所述，与羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，可获得式1的对应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义如本文所述，R2与Y的定义如本文所述，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4的定义如本文所述;以及(e)如果有需要，可将如由前面(a)、(b)、(c)或(d)部分所获得的式1的化合物转变成在治疗上可接受的酸式加成盐。
需注意的是式1化合物的种类，其中X为通常使用的N-保护基，例如Boc，Z，Fmoc或对一甲氧苄氧羰基，用方法(a)和(c)时非常容易而便利地获得。这种种类的容易获得性使它们变得可作为优选路线的中间体，分别经由方法(b)与(d)，以产生式1的相应化合物，其中X不是通常使用的N-保护基。因此，作为中间体，此类式1的化合物将被去保护(也就是说，将保护基除去)，依据方法(b)与(d)将所得的N-末端自由胺用作式4或式5的相应的化合物，依B为不存在或存在，以最终制备式1化合物，其中X不是通常使用的N-保护基，例如，2-吡啶甲氧羰基或2-喹啉羰基。
更为清楚地，按照前面的方法(a)，B为不存在的式1化合物可通过把式2环氧化物加入式3吡咯烷羧酰胺的N-烷基化反应制备。在20°～110℃的温度范围内，使两种反应物在如二醇、四氢呋喃或二甲基甲酰胺的惰性溶剂中接触，能使这种反应合宜地完成。反应时间取决于温度和反应物的性质，通常在2～24小时的范围内。
按照方法(b)，通过式4的相应的化合物和羧酸X-OH(其中X分别为在本文中所定义的R2C(O)或R2AOCH2C(O)的活性衍生物反应，可以获得式1的化合物(其中B不存在，而X为在本文中所定义的R2C(O)或R2AOCH2C(O)。合适的活性衍生物是能够提供适当的酰基X-CO的酰化剂，并且包括相应的酸性卤化物，优先选用氯化物或溴化物，活性脂类，酐类或混合酐类。按照已知的方法和完成反应的条件可以使反应完成。这些方法包括通过选择适当的反应物的比例或者如果需要，通过向与期望的活性基竞争的任何其他的活性基临时提供已知的保护基，来达到所希望的反应选择性的方法。通常，温度为0°～50℃，反应时间从15分钟到24小时的范围内，在如四氢呋喃、二甲基甲酰胺或二氯甲烷的惰性溶剂中完成这种反应。
按照方法(C)，在偶联剂存在的情况下，通过偶联式4的化合物和式α-NHCHR4COOH的α-氨基酸，可以获得B为二价基-NHCHR4C(O)-的式1的化合物，-NHCHR4C(O)-中的R4如本文中所定义。用偶联剂来促进一个反应物的自由羧基和另一个反应物的自由氨基的脱水偶联是大家熟知的;例如，见“肽分析、合成，生物学”，第1至8卷，出处见上文。合适的偶联剂例子是1，1′-羰基-二咪唑或N，N′-二环己基-碳化二亚胺。其它例子是在N，N′-二环己基-碳化二亚胺存在下的1-羟基苯并三唑或N-乙基-N′-[(3-二甲基-氨基)丙基]碳化二亚胺。一种非常实际和有用的偶联剂是在商业上可获得的(苯并三唑-1-基氧基)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，无论是其本身或在1-羟基苯并三唑的存在下。另一个非常实际和有用的偶联剂为在商业上可以获得的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基
四氟硼酸盐。
偶联反应在惰性溶剂中进行，惰性溶剂如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺。加入过量的有机胺如二异丙基乙胺或N-甲基吗啉，使反应混合物的酸碱度维持在pH值大约为8。反应温度通常在-20°到30℃左右，反应时间从15分钟到8小时。
参考方法(d)，此方法按上文所述的方法(b)相同的方式实行，唯一的例外是用式5的化合物代替式4的化合物作为起始物料。
用作方法(a)的起始物料的式2的环氧化物都是已知的或者能用已知的方法制备的。更正确地说，式2的环氧化物已由B.K.Handa等人描述，欧洲专利申请案第346，847号，1989，12，20.公开，或者式2的环氧化物可由该专利申请案中描述的方法制造。
这些方法的其它起始物料，也就是说式3的吡咯烷羧酰胺，与式4及式5的化合物，均为新化合物，因此，成为本发明的目的之一。制备式4与5的化合物的适合方法已于上文提到。通过对已知相应的吡咯烷羧酸的标准胺化作用，可以制备式3的吡咯烷羧酰胺。其亦可用F.Soucy，D.Wernic与P.Beaulieu的方法制备。J.Chem.Soc.Perkins Trans.1，2885(1991)。生产式5的吡咯烷羧酰胺的方法将于下文的实例中说明。
本发明的式1化合物可以在治疗上可接受的酸式加成盐的形式而获得。这些盐类的实例为带有有机酸的盐类，所说的有机酸如乙酸、乳酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸或对-甲苯磺酸，亦可为聚合酸，如单宁酸或羧甲基纤维素，和带有无机酸的盐类，所说的无机酸如氢卤酸，例如盐酸，硫酸，或磷酸。假如想要，可把1个具体的酸式加成盐转化为另一种酸式加成盐，例如无毒性、可药用的盐，即可通过用登在Helv.Chim.Acta，43，1849(1960)上、由R.A.Boissonnas等人描述的方法，用适当的离子交换树脂处理。
通常，在治疗上可接受的式1的肽的盐类在生物学上完全相当于这些肽本身。
式1的化合物或在治疗上可接受的它的盐的HIV蛋白酶抑制性质和抗HIV致病原因的细胞保护作用，可通过生物化学的、微生物学的与生物学的方法说明。
用于说明式1的化合物或它们的在治疗上可接受的盐类的HIV蛋白酶抑制性质的一种特别有用的方法为“重组HIV蛋白酶HPLC分析法”。此方法以试验化合物抑制具有氨基酸序列的十肽(底物)的HIV蛋白酶的酶水解的能力为基础，这种氨基酸系列含有一个已知的HIV聚蛋白质的HIV蛋白酶断裂点;见H.G.Krausslich等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，86，807，(1989)。这种分析法的详述以及作为式1化合物的例子所获得的结果在下文的实例中叙述。
式1的化合物或在治疗上可接受的它们的盐类保护细胞抵抗HIV感染的能力，可以用评估试验化合物对人体T细胞系内HIV的细胞致病性的抑制作用的微生物学的方法说明。这些方法的典型例子描述于S.Harada与N.Yamamoto，Jpn.J.Cancer Res.(Gann)，76，432(1985)，和S.Harada等人，Science，229，563(1985)。以后者方法为基础的一种分析法在下文的实例中叙述。
当本发明的化合物，或在治疗上可接受的它的盐，用于和人体的HIV感染作斗争时，可以用一种含有一种或多种可药用的载体的赋形剂经口腔、表皮或非胃肠道引入肽，各种载体的比例取决于这种化合物的溶解度和化学性质，所选择的给药途径和生物学上标准的应用。对于口服给药，可以将这种化合物或在治疗上可接受的它的盐配制成单位剂量形式，例如胶囊或片剂，在可药用的载体内，每个胶囊或片剂大约含5～150mg预定量的活性成分。对于表皮给药，可以将这种化合物用可药用的、含有0.01～2%，最好是0.05～1%活性剂的赋形剂配制。这类配方可为乳膏、洗剂、舌下片剂最好是经皮给药的贴剂或颊贴剂。对于非胃肠道给药，以带有可药用的赋形剂或载体的组合物的形式，通过静脉、皮下或肌肉注射引入式1的化合物。对于通过注射给药，使用在无菌液体赋形剂中的化合物溶液是较佳的，这种赋形剂也可以含有别的溶液，例如缓冲剂或保护剂以及足够量的可药用的盐类或葡萄糖，以使溶液等渗压。
用于上述配方的适合的赋形剂或载体可以在标准的教科书中找到，例如，在"Remington′s Pharmaceutical Sciences"，18th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Penn，1990.(“雷明顿的制药科学，第18版，麦克出版公司，伊斯顿，宾州，1990)。
化合物的剂量随给药方式和所选择的具体的活性剂而变化。而且，将随治疗下的特定宿主而变。通常，治疗以小剂量开始，明显小于肽的最佳剂量，其后，此剂量以小的增加量增加直至在该情况下达到最佳的效果。通常，非常希望在一般能产生抗病毒效果的结果而不会造成任何不利的或有害的副作用的浓度水平引入这种化合物。
对于口服给药，每天每公斤体重5～150mg，较佳的范围为每公斤5～50mg，引入这种化合物或在治疗上可接受的盐。关于全身性给药，虽然前面提到的变化情况会发生，以每天每公斤体重10μg～1000μg的剂量引入式1的化合物。
对于医治HIV感染，虽然上文揭示的各种配方都是有效和相当安全的药物，但不排除这些配方和其它的抗病毒药物或药剂的同时服用可获得有利的结果的可能性，象这样的其他的抗病毒药物或药剂包括可溶的CD4，利多伍啶(Zidovudine)，迪多诺欣(didanosine)、查西他宾(Zalcitabine)，膦甲酸三钠，三唑核苷(ribavarin)、无环鸟苷(acyclovir)，或抗病毒的干扰素，(例如，α-干扰素或中间白细胞素-2(interleukin-2))。
下述实例进一步说明本发明。溶液百分比或比例表示体积对体积的相互关系，除非另作说明。温度以摄氏度数表示。在Bruker 200MHz光谱计上记录质子核磁共振(NMR)光谱;以每百万分(PPM)记录该化学位移(δ)。在实例中使用的缩写包括Boc叔-丁氧羰基;Bop(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐;Bu叔-丁基;BZL苄基;DIEA二异丙基乙基胺;DMF二甲基甲酰胺;HEPESN-2-羟乙基-哌嗪-N′-2-乙基磺酸;Et2O乙醚;EtOAc醋酸乙酯;EtOH乙醇，HPLC高效液体色谱MeOH甲醇;Ph苯基;THF四氢呋喃;Z苄氧羰基。
实例14(S)-苄氧基-N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺的制备。
(a)N-保护的酸，1-(叔-丁氧羰基)-4(S-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸，通过4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸｛顺-4-羟基-L-脯氨酸，由S.G.Ramaswamy与E.Adams所描述，登在J.Org.Chem.(有机化学期刊)，42，3440(1977)上｝和二-叔-丁基碳酸盐，在过量NaOH的存在下，在THF/H2O(1∶1)溶液中于室温下反应18小时来制备。
(b)将这样获得的N-保护的酸(400mg，1.73mmol)溶解在DMF(7ml)中。将氢化钠(99%，87mg，3.63mmol)加入到此溶液中。将此混合物在室温下(20～22℃)搅拌2小时，加入苄基溴(1.03ml，8.65mmol)并将此混合物于室温下搅拌18小时。其后，将此混合物用EtOAc稀释，冷却到0℃并且加入10%的柠檬酸水溶液使成酸性(pH3)，分离有机层，用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。残留的黄色油状物用色层分离法纯化(SiO2，洗脱液∶己烷-醋酸乙脂，9∶1)，可得到4(S)-苄氧基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酸苄基脂(301mg，70%)。
(c)将新得化合物(301mg，0.73mmol)溶于MeOH/H2O(2∶1，4ml)中，将此溶液搅拌并冷却至0℃。加入2M的氢氧化钠水溶液(1.16ml)，10分钟后，使混合物升温至室温，然后在同样的温度下搅拌18小时。其后，用Et2O/己烷(1∶1，10ml)和水(5ml)将反应物稀释。分离水相，用Et2O/己烷(1∶1)萃取2次，冷却至0℃，用10%的柠檬酸水溶液使成酸性(pH3)，并用EtOAc萃取(3次)。混合的EtOAc萃取物用水(2次)和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并在减压下浓缩。将残留物于高真空下干燥得到4(S)-苄氧基-1-(叔-丁氧羰基)-吡咯烷-2(S)-羧酸的定量产品。
(d)将在CH2Cl2中的新得化合物的0.2M溶液(234.7ml，0.73 mmol)加到DIEA(127μl，0.74m mol)中，随后加入叔-丁胺(84.4μl，0.803m mol)与BOP(387mg，0.0876m mol)。通过定时检验将反应混合物的pH值维持在8(在需要时，可加入DIEA)的同时，在室温下将反应混合物搅拌3小时。其后用EtOAc将反应化合物稀释，并用饱和NaHCO3水溶液(2次)、水与盐水依次地洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。将所得的黄色油状物用快速色层分离法(flash chromatography)(Sio2，洗脱液∶己烷-EtOAc，7∶3之后6∶4)纯化，可获得标题化合物(252mg，92%)。1NMR(CDCl3)δ7.40-7.25(m，5H)，6.05(broad s，1H)，4.6-4.35(broad d，2H)，4.2-4.05(m，2H)，3.8-3.55(m，2H)，2.55-2.1(m，2H)，1.46(s，9H)，1.20(broad s，9H)。
实例21-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(S)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式4∶R1＝C(CH3)3，和Y-OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备(a)将在6N盐酸/二噁烷中实例1的标题化合物的(250mg，0.664m mol)的溶液，在室温下搅拌20分钟，然后在减压下浓缩至干燥。将残留物用EtOAc(10ml)与2N NaOH水溶液(3ml)稀释。将此混合物在室温下搅拌15分钟。分离有机层，用最小量的水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并于减压下浓缩至干燥。将残留物于高真空下干燥，可得4(S)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，即式3的羧酰胺其中R1为C(CH3)3，Y为OCH2Ph{C(O)NHR1/Y＝顺式｝。
(b)将新得化合物在无水EtOH(5ml)中与3(S)-(苄氧羰基)-1，2(R)-环氧-4-苯基丁烷(180mg，0.604m mol)混合，就是式2环氧化物，其中X为Z，见上文B.K.Handa等人，将混合物回流加热18小时，然后在减压下浓缩至干燥。通过快速色层分离法将残留物纯化(SiO2，洗脱液CHCl3-MeOH，39∶1然后19∶1)，可得4(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛(苄氧羰基)氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(220mg，63%)，为白色泡沫状。
(c)新得化合物(220mg，0.384m mol)经过氢解作用(5%Pd/C，1氢气的大气压，MeOH，3.5小时)，可得标题化合物，该化合物按照下列实例的偶联方法立即用。
实例34(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3，和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备按照下述的偶联方法制备标题化合物将DIEA(33.4μl，0.192m mol)，保护的氨基酸Z-Val-OH(53.1mg，0.211m mol)和Bop(102mg，0.23m mol)加到在CH2Cl2中实例2的标题化合物(0.192m mol)的0.2M溶液中。在将混合物在室温下搅拌2小时的同时，通过定时检验将反应混合物的pH值维持在8，并在需要时可加入DIEA。其后，将反应混合物用EtOAc稀释，用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水和盐水依次洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并于减压下浓缩。将残留物用快速色层分离法纯化(SiO2，洗脱液∶CHCl3-MeOH，39∶1)，可得本实例之标题化合物，为白色固体(108mg，83%)。FAB质量光谱，m/z673.3(M H) 。
实例44(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1、2、3顺序的方法，但将实例1(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸(反式-4-羟基脯氨酸-2-羧酸)替代，见上文S.G.Ramaswamy与E.Adams，则可获得标题化合物。FAB质量光谱，m/z673.3(M H) 。
实例54(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1，2顺序的方法，但将实例1的(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)羧酸替代，并将如此得到的1-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酸胺进行下述的偶联步骤，则可得标题化合物。
将1-羟基苯并三唑(20.1mg，0.148m mol)加到冷却到0℃的THF(2mL)中的N，N′-二环己基碳化二亚胺(34mg，0.165m mol)溶液中。将此混合物搅拌15分钟。将在DMF(1mL)中经保护的氨基酸Z-Asn-OH(395mg，0.148m mol)溶液和前述的1-｛3(S)-氨基-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-苄氧基-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(35.4mg，0.083m mol)溶液加到此混合物中。使此混合物缓慢的升温至室温，随后搅拌18小时。其后，用EtOAc将此混合物稀释。将有机相分离，用饱和的NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，在减压下浓缩至干燥。用快速色层分离法(SiO2，洗脱液∶EtOAc/MeOH，97∶3然后19∶1)将该白色残留物纯化，可得本实例的标题化合物。EI质量光谱，m/e689.2(M 2H) 。
(注意先前例举的在N，N′-二环己基碳化二亚胺存在的情况下，利用1-羟基苯并三唑的偶联方法代表为制备B为氨基酸残基Asn的式1化合物的较好的偶联方法。)实例64(S)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1-C(CH3)3，和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝顺式)的制备按照实例1与2顺序的方法和实例5的偶联方法，可获得标题化合物。FAB质量光谱，m/z688.4(M H) 710.4(M Na) 。
实例71-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(S)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺｛式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2CH(CH3)3;C(O)NHR1/Y＝顺式｝的制备按照实例1，2与3顺序的方法，但将实例1的(b)节步骤中的苄基溴用等量的2-甲基丙基溴替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/z583.3(MH2-C4H3) 。
实例81-(｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(R)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺｛式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝C(CH3)3和Y＝OCH2CH(CH3)2;C(O)NHR1/Y＝反式｝的制备按照实例1、2与3顺序的方法，但将实例1的(a)节步骤中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸替代，在实例1(b)节步骤中的苄基溴用等量的2-甲基丙基溴替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/e583.3(MH2-C4H3) 。
实例94(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-环丙基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1∶X＝Z，B＝Val，R1＝环丙基和Y＝OCH2Ph;C(O)NHR1/Y＝反式)的制备按照实例1、2与3顺序的方法，但将实例1(a)节中的4(S)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸用等量的4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酸替代，而于实例1(d)节中的叔-丁胺用等量的环丙胺替代，则可获得标题化合物。EI质量光谱，m/e657.5(M H) 。
实例104-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)-天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R，S)、4(R)与4(S)的异构体(式1∶X＝Z，B＝Asn，R1＝C(CH3)3和Y＝BzL)的制备通过用上述由F.Soucy，D.Wernic与P.Beaulieu所描述的方法，4-苄基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酸的4(R)与4(S)非对映异构体的混合物(3∶2，W/W)，可由丝氨酸内酯与3-苯基-2-丙烯溴获得。按照实例1(d)节的步骤，在BOP存在的情况下，该非对映异构的混合物和叔-丁胺偶联，可得到4-苄基-N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R)与4(S)的异构体的相应的非对映异构的混合物。其后，按照实例2(b)节的步骤并使用新得非对映异构的混合物作为式3的羧酰胺，则可得到4-苄基-1-｛3(S)-｛(苄氧羰基)-氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基-丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4(R)与4(S)异构体的相应非对映异构的混合物。FAB质量光谱，m/z558(M H) 。接着，按照实例5的偶联方法，后者非对映异构的混合物与N-保护的氨基酸Z-Asn-OH反应，可得4-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺的4R与4S异构体的相应的非对映异构的混合物。FAB质量光谱，m/z672(M H) 。
用HPLC技术分离的这两个异构体，可得到相应的纯4R与4S异构体。更进一步的举例说明。将20mg上文最后提到的混合物的样品溶解在2.5mL的50%醋酸水溶液中(起始条件)，装在Whatman Magnum 9
中，C10十八甲硅烷基柱(0.94×50cm)中。起始的柱平衡条件如下10%A与90%B(泵A0.06%三氟醋酸于乙腈中，泵B0.06%三氟醋酸于水中)。一旦相应于醋酸(在溶剂前面)的高峰通过，一个线性梯度就跟着而来。异构体分离方案如下在3mL/min和230nm下，10-30%的A5分钟，30%的A10分钟，随后，30-100%的A110分钟。4(R)异构体与4(S)异构体分别在60%A(9.2mg)和63% A(8.3mg)下被收集。
实例11N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝-丁基｝-4(R)-(2-嘧啶基硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺(式1X＝2-喹啉羰基，B＝Val，R1＝(C(CH3)3和Y＝2-嘧啶基硫基)的制备(a)将N-保护的酸(17.5g，75.6m mol，描述于实例1(a)节)溶解在CH2Cl2(300mL)与EIDA(13mL，76.6m mol)中。将叔-丁胺(8.73mL，83.1m mol)加到此溶液中，随后加入BOP(40g，90.7m mol)与DIEA(13mL，151m mol)。将混合物于室温下搅拌7小时，随后用EtOAc稀释。分离有机相，用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水(2次)和盐水(2次)洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干燥。用Et2O/EtOAc(9∶1)将固体残留物研制，收集在过滤器上，用Et2O洗涤并干燥，得到N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)-4(R)-羟基吡咯烷-2(S)-羧酰胺(15.6g，72%)。
(b)将新得化合物(5.0g，17.5m mol)溶解在甲苯/THF(3∶1，175mL)中。在室温下将三苯膦(5.72g，21.8m mol)与咪唑(1.08g，30.5m mol)加到此溶液中。将此混合物升温至45-50℃，加入碘(5.54g，21.8m mol)在45-50℃下用力搅拌混合物80分钟。其后，将反应混合物冷却并用Et2O和水稀释。分离有机层，用饱和的NaHCO3水溶液(1次)和盐水(1次)洗涤、干燥(MgSO4)并蒸发至干燥，则可得棕色油状物，内含少许固体(三苯膦氧化物)。将油状固体用Et2O研制并将固体收集在过滤器上。将滤液蒸发至干燥，则可得棕色油状物。用快速色层分离法将该油状物纯化(SiO2，洗脱液EtOAc/己烷，1∶4)，可得N-叔-丁基-1-(叔-丁基羰基)-4(S)-碘吡咯烷-2(S)-羧酰胺，为黄色固体(4.83g，70%)。1NMR(CDCl3)δ6.2-6.0(broads，1H)，4.27-4.0(m，3H)，3.75-3.55(m，1H)，2.9-2.5(m，2H)，1.47(s，9H)，1.38(s，9H)。
(c)将2-嘧啶硫醇(1.06g，9.46m mol)分批加到冷却的(0℃)DMF(10mL)中的氢化钠(99%，182mg，7.57m mol)悬浮液中。将混合物在相同的温度下搅拌30分钟。其后，将在DMF(5ml)中的上文(b)节的产物(1.5g，3.79m mol)的溶液滴入该混合物。将此反应混合物于室温下搅拌18小时后，再用EtOAc和水稀释。分离有机相，用冷水(1次)、1N的NaOH水溶液(2次)在盐水(1次)洗涤、干燥(MgSO4)，并蒸发至干燥，得到固体。将此固体用Et2O研制，可得N-叔-丁基-1-(叔-丁氧羰基)-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，为一种灰白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ8.53-8.51(d，J＝4.85Hz，2H)，7.01-6.96(t，J-4.85，10.0Hz，1H)，5.97-5.75(broad s，1H)，4.4-4.2(m，2H)，4.1-3.91(m，1H)，3.70-3.35(m，2H)，2.92-2.75(m，1H)，1.47(s，9H)，1.36(s，9H)。FAB质量光谱(m/z)381(M H) ，403(M Na) 。
(d)按照实例2(a)与(b)节的步骤，将新得化合物去保护，并与式2的环氧化物(其中X为Boc)反应，可得N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛(叔-丁氧羰基)氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺。FAB质量光谱，m/z;544(M H) ，566(M Na) 。
接着，按照实例2(a)节的步骤，将新得化合物去保护，并按照实例3的方法与Boc-Val-OH偶联，可得N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛N-(叔-丁氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺。FAB质量光谱(m/z)643(M H) 665(M Na) 。
(e)将于6N盐酸/二噁烷(7mL)中的新得化合物(887mg，1.38m mol)溶液于室温下搅拌20分钟。在减压下将溶剂移去。一种为白色固体的残留物在高真空下干燥20分钟，得到相应的去保护胺，为盐酸盐。将新得盐溶解在CH2Cl2(7mL)和DIEA(481μL，2.76m mol)中。把2-喹啉羧酸(263mg，1.52m mol)与BOP(732mg，1.66m mol)加入该盐的溶液中。在通过定时检验，将此混合物的pH值维持在8(在需要时可加入DIEA)的同时，将此反应混合物在室温下搅拌5小时。其后，将反应混合物用EtOAc稀释，并依次用饱和的NaHCO3水溶液(2次)、水(2次)与盐水洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，并在减压下浓缩至干燥。所得的无色油状物用快速色层分离法(SiO2，洗脱液∶己烷-EtOAc，3∶7然后1∶9)纯化，得标题化合物，为白色泡沫状物(750mg，78%)。将该泡沫状物用Et2O研制，可得标题化合物，为白色固体(378mg，40%)。FAB质量光谱(m/z698(M H) ，720(M Na) 。化合物的NMR与指定的结构一致。
按照本实例的方法，但将(c)节内的2-嘧啶硫醇用3-吡啶甲硫醇替代，则可得N-叔-丁基-1-(2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝-氨基｝丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺。
FAB质量光谱m/z711(M H) ，733(M Na) 。
再次，按照本实例的方法，但将(c)节内的2-嘧啶硫醇用2，6-二甲基-4-羟基嘧啶取代，则可得N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-｛(2，6-二甲基-4-嘧啶基｝氧基｝
式中X是氧保护基团，
b)使式Ⅳ特定差向异构体与式Ⅴ化合物反应，生成相应的式Ⅵ特定差向异构体，所述式Ⅴ和式Ⅵ如下
作实例11中N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝-丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺的中间体)，得到N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-｛(3-嘧啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，FAB质量光谱m/z619(M H) ，641(M Na) 。
实例13重组HIV蛋白酰HPLC分析酶在大肠杆菌中可表达出HIV蛋白酶｛构建体pBRTlprt ，见W.G.Farmerie等人，Science，236，305(1987)，按照下面的条件除非另有说明，所有的溶液均为水溶液。
(ⅰ)发酵含有pBRTl prt 质粒的大肠杆菌细胞，用来接种由含100μg/mL的氨苄青霉素的卢-柏肉汤(Luria-Bertani Broth)组成的种子培养基。将烧瓶于37℃在震动下培养17小时。含有无菌M9肉汤的制备烧瓶，补充100μg/mL的氨苄青霉素，用上述的种子培养基，以1%(V/V)的浓度接种。在每一个制备烧瓶中的总体积为2L的欧伦麦耳氏(Erlenmeyer)烧瓶中的500mL。将烧瓶于37℃在震荡下培养直至细胞浓度达到对应的光密度为0.6(λ＝540μm)(没有稀释)。这种时间间隔通常为3-4小时。然后给烧瓶补充5mM三异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Organics，Cleveland，Ohio，USA)，并继续培养至细胞浓度于16-倍稀释下光密度为0.2。然后补充1mM的苯基甲基磺酰氟(PMSF)至烧瓶，并快速冷却至4℃。细菌细胞于4℃下离心回收。将湿的小片在-70℃下贮存。
(ⅱ)分析级酶的提取与制备以下所有的步骤均于4℃下实行，除非另有说明，混合解冻细胞与缓冲液A｛50mM的三(羟基甲基)氨基乙烷盐酸(Tris-HCl，pH7.4);0.6mM的乙二胺四乙酸(EDTA);0.375M的NaCl，0.2%的Nonidet p
(BDH Chemical，Ltd.，Povle，UK);1mM的PMSF}，其比例为1份细胞对9份缓冲液A。加入硅藻土(Celite 545
，John Manville，Lompoc，CA，USA)，其比例为2份对1份湿细胞重量。产生的糊状物于高速(约20，000rpm)下在Waring
工业搅拌器上进行均化8×15秒脉冲。细胞碎片/Celite
从离心收集，使用上述的均质化步骤将产生的小片用4.5份的缓冲液A对1份湿固体进行提取。混合由上述两个均质化步骤而来的上清液，并加入固体的(NH4)2SO4，将可溶性的蛋白质沉淀，以产生75%饱和的终浓度。将该混合物震动60分钟并离心收集沉淀物。将产生的小片悬浮于缓冲液B｛50mM Tris-HCl，pH8;30mM NaCl，1mM DL-二硫苏糖醇(DTT);1mM EDTA;1mM PMSF;10%甘油｝中，并对同一缓冲液透析18小时。
将一部分含有150mg蛋白质的透析提取物装入床尺寸为长70cm、直径2.5cm的Sephadex A 25阴离子交换柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。用缓冲液B以10cm/小时的线性流速将样品均匀地洗提。混合含有HIV蛋白酶活性部分(见下述的分析描述)，并通过添加饱和的(NH4)2SO4水溶液，将可溶性蛋白质沉淀，以产生85%饱和的总(NH4)2SO4浓度，将沉淀的蛋白质用离心分离作用移去，并将产生的小片溶解在缓冲液C｛50mM的2-(4-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH5.5;150mM NaCl;1mM DTT;1mM EDTA;10%甘油｝。该制备物对缓冲液C透析18小时，再冷冻在-70℃。所有的粗提取物都以含有150mg蛋白质的等分试样用如前述的色层分析的相同方法纯化。把每一批的终制备物汇集起来，分装成34μL的等分试样并存于-70℃。通常由20L发酵物回收的终蛋白质为300mg，并具有18.2m mol底物水解的/分/mg的HIV蛋白酶比活性。
在使用之前，将这些等分试样用缓冲液体稀释到原来浓度的1/18(即酶工作溶液)，见下文。
底物VSFNFPQITL-NH2，MW 1164，见Krausslich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，807(1989)，用作底物。将底物在DMSO中制成10mM贮液，存于4℃下。在使用前，将贮液用缓冲液稀释而得400μm溶液(即底物工作溶液)。
缓冲液将MES(100mM)，KCl(300mM)与EDTA(5mL)溶于蒸馏水(90mL)，并将溶液用浓NaOH水溶液调整到pH5.5。将新得溶液以水稀释成100mL以形成缓冲液。
步骤(1)通过混合20μL的底物工作溶液、10μL在10%DMSO中的试验化合物的溶液和10μL的酶工作溶液来制备分析混合物。(2)将分析混合物于37℃下培养30分钟。(3)通过加入200μL2%的三氟乙酸水溶液使反应骤停。(4)利用一个具有逐级梯度为4mL/min流速的Perkin-Elmer 3×3CRC8柱(Perkin Elmer Inc.，Norwalk，CT，USA)，使100μL骤停的分析混合物用HPLC而使底物与产物(即VSFNF与PQITL-NH2)分离。
该梯度如下0.0-0.5分钟，70%A/30%B;
0.5-3.0分钟，67%A/33%B;
3.0-5.0分钟，20%A/80%B;
5.0-6.5分钟，70%A/30%B;
其中A为3mM十二基硫酸钠/0.05%H3PO4于水中，而B为0.05%H3PO4于乙腈中，在210mM时监视洗提。
(5)将一参照物，它是无试验化合物的分析混合物，同时经受步骤2～4。
抑制研究水解产物与残留的原底物以峰高度或以适当的HPLC峰的积分来定量。使用下列关系计算底物转化%转化＝ (产物的峰高或峰域总和)/(底物与产物的峰高或峰域总和) ×100试验化合物的酶抑制的计算如下所述%抑制＝100- (分析混合物的%转化)/(参照物的%转化) ×100引起HIV-蛋白酶的50%抑制的试验化合物的浓度，即IC50，可按下述确定确定酶的抑制百分比，作为试验化合物的三种不同浓度的最小值。据此，通过将酶的抑制百分比对试验化合物的浓度作图，用图解法确定IC50。
作为式1化合物的例子的IC50，按重组HIV蛋白酶HPLC分析确定，列于下表中。
表Ⅰ
表Ⅰ(续)
实例13用于筛选式1化合物的抗病毒效果的下述条件，借用于先前由上述Harada等人发表的用HTLV-1转化细胞的空斑分析。之所以使用HTLV-1转化细胞，是因为HIV在该细胞中复制的快速性。
1.将试验化合物溶解在二甲基亚砜中至其浓度为5mg/mL。将所得的溶液可储存在4℃至使用。
2.将得到的溶液在RPMI 1640中(Gibco Laboratories，St.Lawrence，MA，USA)稀释到4倍(4X)，测试终浓度。一旦在RPMI 1640中稀释，该溶液需在4小时内用于细胞培养分析。
3.将该4倍溶液(50μL)加到96小孔平底微量滴定板的一式三份小孔中，将RPML(50μL)也加到对比小孔中。
4.将在50μL的HEPES-缓冲的RPMI 1640(pH＝7.2)中的C8166细胞(5×104)、10%热失活的胎牛血清(FCS)、12.5μL/mL的庆大霉素(完全培养基)加到所有的小孔中。
5.将在100μL的完全培养基中H9/HTLV-ⅢB贮液(存于液氮中，作为在50�S中细胞培养上清液)的50倍TCID50，加到所有的小孔中。病毒贮液的感染性效价如先前那样由C8166细胞的终点稀释所确定。贮液效价在储存于-193°下可稳定6-12个月。
6.然后将微量滴定板在37℃、5%潮湿的二氧化碳培养箱的层架上放72小时。7.然后将平板取出，并用低功率相衬光学显微镜计算在每一小孔中合胞体的中心数。显示任何合胞体形成的证据的每簇细胞即计为一个合胞体中心。对比小孔应使每小孔具有25-75个合胞体中心。
8.合胞体形成的抑制百分比用下式计算%抑制＝100× ((对比小孔中的合胞体中心数)-(测试小孔中的合胞体中心数))/((对比小孔中的合胞体中心数))引起抑制50%合胞体形成的的试验化合物的浓度，即EC50，由在步骤3中工作溶液的顺序稀释所使用的技术与用观测到的合胞体形成的抑制百分比对试验化合物的不同浓度所标绘的图形来确定。
在下列表Ⅱ中，作为式1的化合物的例子，列出的分析结果来自本实例的空斑分析。
表Ⅱ
式1的其它化合物为N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯硫酰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4，6-二甲基-2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苄基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-环戊基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯磺酰基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺
1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-N-(1-甲基乙基)-4(R)-(2-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-环丙基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4-吡啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)异亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-萘羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(4，6-二甲基-2-嘧啶硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)异亮氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)苯氧吡咯烷-2(S)-羧酰胺N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-吡啶羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(苯硫基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺
权利要求
1.一种式1的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐
其中X为R2OC(O)，R2C(O)或R2NR2C(O)，其中R2为(i)低碳烷基，(ii)低碳环烷基，(iii)苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基，(iv)苯基(低碳)烷基或苯基(低碳)烷基，其中它的芳香基部份用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代，(v)1-萘基或2-萘基(vi)(Het)或(Het)-(低碳烷基)，其中Het表示五或六元、含1或2个选自氮、氧与硫的杂环原子的单价杂环基，或(vii)2-喹啉基或3-喹啉基，R3为氢或低碳烷基；或X为R2AOCH2C(O)，其中R2A为苯基或用低碳烷基或卤素单取代，双取代或三取代的苯基；B为不存在或二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基；或低碳环烷基；(低碳环烷基)-(低碳烷基)苯基甲基；或用羟基、羧基、低碳烷氧羰基、氨基羰基、(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基单取代的低碳烷基；R1为低碳烷基或低碳环烷基；Y为低碳烷基；低碳环烷基，苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基；苯基甲基或用卤素，羟基，低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基甲基；或Y为W(CH2)nZ，其中W为氧代、硫代、亚硫酰基或硫酰基，Z为低碳烷基、苯基或用卤素、羟基、低碳烷基或低碳烷氧基单取代的苯基；或(Het)其中(Het)定义如前所述；和n为0或1。
2.权利要求1的化合物，或其在治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为R2OC(O)或R2C(O)，其中R2为低碳烷基;苯基(低碳)烷基;苯基(低碳)烷基，其中苯基部分的位置4用氯、氟、羟基、甲基或甲氧基取代;1-萘基;2-萘基;2-呋喃基;2-噻吩基;2-吡啶基;4-吡啶基;2-吡啶基甲基;4-噻唑基甲基或2-喹啉基;或X为R2AOCH2C(O)其中R2A为苯基或位置2、4和6上，用低碳烷基或卤素单、双或三取代的苯基;B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4为低碳烷基;或用羟基、低碳烷氧羰基、氨基羰基，(低碳烷基)氨基羰基或二(低碳烷基)氨基羰基单取代的低碳烷基。R1为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，2-甲基丙基，环丙基，环丁基，环戊基或环己基;Y为低碳环烷基，苯基，4-氯苯基，4-溴苯基，4-氟苯基，4-甲基苯基，4-甲氧苯基，苯甲基，(4-氟苯基)甲基或(4-甲基苯基)甲基;或Y为W(CH2) Z，式中W及n的定义如上，Z为低碳烷基，苯基，2-呋喃基，2-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，4-噻唑基，2-嘧啶基，4，6-二甲基-2-嘧啶基或2，6-二甲基-4-嘧啶基。
3.权利要求2的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为叔-丁氧羰基，苄氧羰基，(4-氯苯基)甲氧羰基，(4-羟苯基)甲氧羰基，(4-甲氧苯基)甲氧羰基，乙酰基，苯甲酰基，1-萘羰基，2-萘羰基，2-吡啶甲氧羰基，或2-喹啉羰基，苯氧乙酰基，(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基，(4-氯苯氧基)乙酰基或(4-氟-2，6-二甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在或为二价基-NHCHR4C(O)-，式中R4为1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，甲氧羰基甲基，乙氧羰基-甲基或氨基羰基甲基;R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;Y为环己基，苯基，4-氯苯基，4-氟苯基，4-甲氧苯基，苄基，(4-甲氧苯基)甲基，2-甲基丙氧基，苯氧基，2-吡啶氧基，3-吡啶氧基，4-吡啶氧基，2-嘧啶氧基，4，6-二甲基-2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，2-吡啶甲氧基，4-噻唑基甲氧基，2-嘧啶基甲氧基，苯硫基，苯亚硫酰基、苯硫酰基、2-吡啶基硫基、3-吡啶基硫基、4-吡啶基硫基，2-嘧啶基硫基，4，6-二甲基硫基-2-嘧啶硫基，苄硫基，苄亚硫酰基，苄硫酰基，(2-吡啶甲基)硫基，(3-吡啶甲基)硫基或(4-吡啶甲基)硫基。
4.权利要求3的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为叔-丁氧羰基，苄氧羰基，乙酰基，2-萘基羰基，2-吡啶基甲氧羰基、2-喹啉基羰基;B为缬氨酰基，异亮氨酰基或天冬酰胺酰基;R1为1，1-二甲基乙基或环丙基;和Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基。
5.权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的酸式加成盐，其中X为(2-甲基苯氧基)乙酰基，(2，4-二甲基苯氧基)乙酰基，(2，6-二甲基苯氧基)乙酰基或(2，4，6-三甲基苯氧基)乙酰基;B为不存在;R1为1，1-二甲基乙基;而Y为苯基，苄基，苯氧基，2-嘧啶氧基，2，6-二甲基-4-嘧啶氧基，苄氧基，苯硫基，苯硫酰基，2-吡啶硫基，3-吡啶硫基，4-吡啶硫基，2-嘧啶硫基，4，6-二甲基-2-嘧啶硫基或(3-吡啶甲基)硫基。
6.权利要求1的化合物，选自4(S)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(S)-苄氧基-1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，1-｛3-(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(S)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基-4(R)-(2-甲基丙氧基)吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄氧基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)缬氨酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-环丙基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(R)-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，4(S)-苄基-1-｛3(S)-｛｛N-(苄氧羰基)天冬酰胺酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-N-叔-丁基吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2-(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)-吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-(3-吡啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛2-(R)-羟基-4-苯基-3(S)-｛｛N-(2-喹啉羰基)缬氨酰基｝氨基｝丁基｝-4(R)-｛(2，6-二甲基-4-嘧啶基｝氧基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺，N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-(2-嘧啶硫基)-吡咯烷-2(S)-羧酰胺，和N-叔-丁基-1-｛3(S)-｛｛2，6-二甲基苯氧基)乙酰基｝氨基｝-2(R)-羟基-4-苯基丁基｝-4(R)-｛(3-吡啶甲基)-硫基｝吡咯烷-2(S)-羧酰胺。
7.一种药物组合物，包括权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的盐，和可药用的载体。
8.一种治疗人体HIV感染的方法，包括服用有效量的权利要求1的化合物，或其治疗上可接受的盐。
9.一种用于保护人体细胞抵抗HIV发病的方法，包括用抗-HIV有效量的权利要求1的化合物或其治疗上可接受的盐，处理该细胞。
10.一种制备权利要求1的化合物或其治疗上可接受的酸式加成盐的方法，包括(a)把式2的环氧化物
其中X如权利要求1中所定义的，与式3的吡咯烷羧酰胺反应，
其中R1与Y如权利要求1所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X，R1和Y如本权利要求中所定义的，而B为不存在;或
其中R1与Y如本权利要求中所定义的，与羧酸X-OH的活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2(O)，其定义同权利要求1，可获得式1的相应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，其定义同本权利要求，R1与Y如本权利要求中定义的，而B为不存在;或(c)将式4的化合物，其中R1与Y如本权利要求中所定义的，在偶联剂存在的情况下，与式X-NHCHR4COOH的α-氨基酸偶联，其中X为R4如权利要求1所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X，R1与Y如本权利要求中所定义的，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4如本权利要求中所定义的;或(d)将式5的化合物
其中R1、R4与Y如本权利要求中所定义的，与羧酸X-OH活性衍生物反应，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，如本权利要求中所定义的，可获得式1的相应化合物，其中X为R2C(O)或R2AOCH2C(O)，如在本权利要求中所定义的，R1与Y如本权利要求中所定义的，而B为二价基-NHCHR4C(O)-，其中R4如本权利要求中所定义的;和(e)假若想要，将前述(a)，(b);(c)或(d)节中所获得的式1的化合物转变成为相应的治疗上可接受的酸式加成盐。
全文摘要
本发明关于式I的化合物其中X为末端基，例如，芳氧羰基或烷酰基；B不存在或为氨基酸残基，例如，缬氨酸或天冬氨酸； R
文档编号C07D207/16GK1096292SQ93106800
公开日1994年12月14日 申请日期1993年6月8日 优先权日1993年6月8日
发明者维达·戈瑞斯, 克里斯蒂安·约克姆, 弗朗克斯·索西, 皮埃尔·L·博兰尤 申请人:比奥·梅加·贝林格尔·英格海姆研究公司
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