微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的制作方法

专利名称：微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸(cephalosporansaure)衍生物及其可溶性盐，其结构通式为
(其中R是氢原子、羟基或乙酸基)。论述一种新的从相应的头孢菌素C衍生物出发的制备方法，以及一种适用于此方法的新的微生物。
其次，本发明还涉及一种新的微生物方法，从丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物制备7-氨基头孢烷酸衍生物，并叙述一种假单孢菌属(PesudomonasSP，DSM7509)微生物的新的应用方法。
下面将说明丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物(结构式Ⅲ)，头孢菌素C-衍生物(结构式Ⅳ)，根据结构式Ⅱ的丙二酰-内酯，以及结构式Ⅰ的内酯及其可溶性盐，例如铵盐或碱金属盐。
丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物可作为制备7-氨基头孢烷酸衍生物的初始原料，它也是制备头孢菌属抗生素的重要初始化合物(J.Bacteriol.，1987，16912，5815-5820)。
至今不知道由丙二酰-7-头孢烷酸衍生物来的化学的和微生物制备方法。
许多微生物方法是以头孢菌素C为原料制备7-氨基头孢烷酸，例如在JP-A6248380中所描述的。但是这种方法有许多缺点，以至大型工业生产技术变得不可行。
本发明的任务是提供一种利用新的微生物来制备新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的方法，这是一种简单而又经济的微生物方法。接着在任务是用这种新的衍生物采用新的微生物方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物。
按照本发明，这一任务可以通过按照权利要求1的新的微生物，通过按照权利要求3的新的方法，通过按照权利要求8的新的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，以及通过按照权利要求10的新方法来解决。
按照本发明，筛选一种微生物，它能把内酯，其结构式为
作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰内酯其结构式为
而被利用，后者不会被分解代谢。这些微生物可以用按照结构式Ⅰ的内酯藉助传统的微生物技术，例如从各种各样的土样中进行筛选，也就是说从土样中接种进行微生物培养，可以得到微生物用按照结构式Ⅰ的内酯作为唯一的碳源、氮源和能源生长。然后按照专业的普通方法筛选这些微生物，筛选出能把按照结构式Ⅰ的内酯转化为结构式Ⅱ的丙二酰内酯，而不分解代谢的微生物。
筛选所需的内酯(结构式Ⅰ)可以从市场上购得的去乙酰头孢菌素C取得，为此，首先用已知的方法(Jefferayetal.，Biochem.J.，1961，81，591)把去乙酰头孢菌素C进行内酯化成相应的内酯，为生成希望得到的、具有内酰胺开环(结构式Ⅰ)的内酯，可以用专业的方法，例如借助青霉素酶将内酰胺环打开。
原则上在此筛选压力下取得的所有微生物都适用。这类微生物在文献中未曾描述，是本发明的组成部分。
据此目的，通过筛选可获得标记为FBI(DSM7007)的微生物及其突变体和子系体。这些均在1992年3月25日存入德国微生物和细胞培养公司(Mascheroderweg1b，D-3300Braunschweig)。
在提出关于16sRNA分析报告的优先日后这些微生物鉴定归入SphingomonasSP。
SphingomonasSpFB1(DSM7007)的描述细胞形态微小杆菌宽度，μm0.4～0.6长度，μm0.8～1.5活动性 鞭毛极生1革兰氏反应-3%KOH溶菌作用 氨肽酶(Cerny) 孢子-
氧化酶 过氧化氢酶 主要苯醌组分辅酶Q10HPLC-快速法的DNA-碱基组成63mol%G C一般是在无机盐介质中进行微生物的筛选和培养，这种无机盐介质的组成列于表1(a和b)。成功的筛选出微生物后，最理想的是在另一种介质中进行培养，例如商业上通用的完全培养基。
据此目的，培养和筛选时，将0.2～1重量%，最好是0.3～0.6重量%的结构Ⅰ内酯加入列机盐培养基中。
筛选和培养温度为0～60℃，最好是20～40℃。pH值5～9，最好是6～8。
在650nm(OD650)时光密度达到0.1～1，可以按照专业通用的方法采集微生物，并使用本发明的方法。
按本发明，用这一方法筛选出的微生物使用本发明的方法将头孢菌素C衍生物，其结构通式为 其中R是氢原子、羟基或乙酸基(作为底物)，转化为丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，其结构通式为
其中R如前述。
适宜的是，这一方法用筛选出的如前所述保存的微生物SphingomonasSP.FB1(DSM7007)或其子系体和突变体来实施。
一般，这一方法以专业通用的方法用未生长的细胞进行。
将头孢菌素C衍生物(结构通式Ⅳ)作为底物，其中R为前述。用头孢菌素C(R在结构式Ⅲ中＝乙酸基)作底物也是适宜的。
按照本方法，可将底物一次性或持续性地加入。理想的做法是，添加底物使其在培养基中的浓度不超过20重量%，最好是4重量%。
本方法可使用专业通用的介质，最好是在低分子的HEPES(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-乙烷-磺酸)缓冲液中进行。
一般，此方法可以用微生物悬浮液进行，此悬浮液OD650为1～100，最好是2～50。
本方法适宜在温度为0～60℃之间，最好是20-40℃，pH值为5-9，最好是6-8时进行。
通常经1～24小时转化后，可以用专业通用的方法分离出至今尚未叙述过的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物，作为分离的丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物的最好代表物是丙二酰-7-氨基头孢烷酸(R在结构式Ⅲ中＝乙酸基)。
本发明方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物的结构通式为
其中R如前述，按下述方式进行将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐(结构通式Ⅲ)作为底物，借助假单孢菌属(DSM7509)微生物，或其子系体和突变体，或者用此微生物无细胞的酶转化为产物(结构式Ⅴ)。
这种假单孢菌属微生物PseudomonasSP(DSM7509)于1993年3月5日存入德国微生物与细胞培养公司(Mascheroderweg1b，D-3300Bravnschweig)。
这类微生物为已知的，在JP-A6248380中叙述为假单孢菌微生物PseudomonasSP.SE-495(FERMBP-818)，按照JPA6248380所述，这类微生物的筛选方法是，将戊二酰-7-氨基头孢烷酸水解为7-氨基头孢酸。但未述及利用此微生物水解丙二酰-7-氨基头孢烷酸。
然后本发明再论述利用这类微生物水解丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物(结构式Ⅴ)，特别是丙二酰-7-氨基头孢烷酸(R＝乙酸基)。
本发明也适宜用具有通透性的微生物细胞，或用无细胞的酶提取物来进行，最好是用无细胞的酶提取物。
可以用专业通用的方法制备无细胞酶提取物，例如用超声技术或应用“French-Press”方法。
可以用丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物作为底物(结构通式Ⅴ，其中R如前述)。用丙二酰-7-氨基头孢烷酸(R＝乙酸基)作底物更适宜。
可以将底物一次性或持续性地加入，适当的方式是底物在培养基中的浓度不超过10重量%，最好为2重量%。
在本方法中可使用专业通用的营养培养基。
要是本方法使用无细胞的酶提取物，则此提取物的蛋白质浓度应为0.1-20克/升，最好是1～5克/升。
本方法适合在温度4～50℃，最好为20-35℃，pH值为4-9，最好是7-8的条件下进行。
一般经过3-24小时的转化反应，就可分离出7-氨基头孢酸衍生物(结构式Ⅴ)。
实施例1微生物分离把从Visp(瑞士)郊区土壤中取得的各种土样作为接种物加入100毫升无机盐介质中(表1)，pH7.0，含5毫克分子浓度(0.5mmol/100毫升)具有酰胺开环(结构式Ⅰ)的内酯，于25℃在摇床上培养，摇床为140UPm(每分钟转数)。把这些培养物在新鲜的无机盐培养基中移种4次，然后借助分析型HPLC对内酯转化反应进行测试。
然后将此培养物在含5毫克分子浓度内酯(结构Ⅰ)的无机盐培养基-琼脂-平板上于25℃时进行培养。接着分离SphingomonasSP.FB1(DSM7007)菌株，它在内酯中生长时生成丙二酰-丙酯(结构式Ⅱ)，后者不会完全分解。
实施例2丙二酰-7-氨基头孢烷酸(结构式Ⅲ)的生成把微生物Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)在含5毫克分子浓度内酯(结构式Ⅰ)无机盐培养基中培养，pH为7.0(表1b)，4天内达到OD650＝0.44。(在头2天后再加入此内酯，使总浓度达到1毫克分子/100毫升培养基)。接着离心分离细胞，并将细胞沉淀物在20毫升10毫克分子浓度HEPES缓冲液中(pH为7.0)再悬浮，此时将OD650调节到2.2。在细胞悬浮液中加入0.4毫克分子头孢菌素C(结构式Ⅳ)，在摇床上(140转/分钟)于25℃时进行培养。
在30分钟、60分钟、2.25小时、5小时和24小时后，用HPLC分析法测试样品。
丙二酰-7-氨基头孢烷酸的生成率在2.25小时时为410毫克/升/小时/OD650。
5小时后分析可检出142mg丙二酰-7-氨基头孢烷酸，相当于转化99%头孢菌素C。丙二酰-7-氨基头孢烷酸可用制备型HPLC分离，得率为40%。
实施例3丙二酰-7-氨基头孢烷酸(结构式Ⅲ)的鉴定鉴定结构式Ⅲ的产物采用500ml无机盐培养基(表Ⅰ)，pH7.0，加入结构式Ⅰ的内酯溶液，使最终浓度达到5毫克分子。然后将此预培养溶液，OD650＝0.5，在25℃和140转/分条件下进行接种，一天后每500毫升培养基再加入5mmol内酰(结构式Ⅰ)。当OD650达到0.5时收集细胞，然后将细胞沉淀物放入30ml10毫克分子浓度的HEPES缓冲液中再悬浮，pH为7.0，含0.6mmol头孢菌素C(结构式Ⅳ)。在25℃，140转/分培养5小时后将细胞离心分离，并用制备型HPLC将丙二酰-7-氨基头孢烷酸从上清液中净化。将净化的样品经冷冻干燥过夜，用NMR(1H和13C)分析冻干物。
对照化学方法制备的参比物(从7-氨基头孢烷酸制得，按照Bull.Soc.Chem.Belg.，1977，86，991～1002)，证实生成丙二酰-7-氨基头孢烷酸。
丙二酰-7-氨基头孢烷酸钠盐(化学标准)13C-NMR(DMSO，100.5MHz，δ以ppm计)
20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。
丙二酰-7-氨基头孢烷酸(按照本发明的方法)13C-NMR(DMSO，100.5MHzδ以ppm计)20，s;25，s;40，m;58，d;64，s;112，s;134，s;164，d;170，t。
1H-NMR(化学标准，DMSO，400MHz，δppm计);
20，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。
1H-NMR(按本发明的方法)2.0，s;2.5，s;3.0，t;3.5，m;4.8，d;5.0，d;5.6，d。
实施例4去乙酰头孢菌素的内酯化用下述方法从去乙酰头孢菌素C(Ciba-Geigy公司，Basel)制备去乙酰头孢菌素C-内酯将100g去乙酰头孢菌素C溶于1升20毫克分子浓度磷酸钠pH7.0缓冲液中，再将离子交换剂DOWEX50×8(H 型)(Fluka)加入此溶液中，使pH达到2.5。搅拌10分钟后(250转/分，室温下)，滤出离子交换树脂，用浓盐酸将溶液的pH值调节到0.8;搅拌1小时后(室温，250转/分)在反应液中加DOWEX1×8(乙酸盐型)(Fluka)使pH达到3.0～3.2。
然后在室温，250转/分继续搅拌1.5小时，接着滤出离子交换树脂，重又加入DOWEX1×8(乙酸盐型)至pH达到3.3～3.5，搅拌1小时(室温，250转/分)，接着再滤出离子交换树脂，然后将反应液在旋转蒸发器内蒸发(30毫巴，30℃)干燥。为去除尚存的乙酸，将蒸发后产物溶于水成35%溶液，然后用浓盐酸将pH调到1.5。将得到的溶液用等体积乙酸乙酯提取2次，液相净化并用3克分子浓度KOH溶液将pH调到3.5，再在旋转蒸发器内蒸发(30毫巴，30℃)。然后再将此产品置干燥器内于真空下(30毫巴，20℃)完全干燥。
总得率为60克，相当于100g去乙酰头孢菌素C中得率60%。
实施例5制备内酰胺开环的内酯(结构式Ⅰ)为制备内酯，将去乙酰头孢菌素C-内酯置于含有β-内酰胺酶(青霉素酶〔E.C.3.5.2.6〕(Sigma))的储备溶液6(表1a)中进行处理。加入青霉素酶后反应立即开始，在反应过程中加入1当量NaoH溶液使pH保持在7.0，一俟不再加NaoH而pH值稳定在7.0时反应即结束。在反应结束后(约2小时)将此溶液灭菌过滤(0.2Mm滤器)，保藏在-80℃。
实施例67-氨基头孢烷酸(结构式Ⅴ)的生成将假单孢菌属微生物PseudomonasSpSE-495(DSM7509;FERMBP-818)置于营养培养基中于30℃培养过夜，该营养培养基pH为7.0，含0.2%W/V肉汁，0.2%W/V酵母提取物，0.5%W/V胨，0.5%W/V谷氨酸钠和0.005%W/V硫酸镁。再将此培养物置于相同组成的新鲜培养基中进行移种(接种量为10%)，再培养2-4天。
接着，通过离心分离(20分钟，600转/分)收集细胞，置于0.1克分子浓度磷酸钾缓冲液中悬浮，并再离心分离(总共各3次，为培养物的10%容量)，然后在尽可能少容量的磷酸钾缓冲液中将细胞沉淀物再悬浮，在冰冷下用超声波处理(10次;每次30秒间隔20秒)，然后离心分离(20分钟，至少10000转/分)将粗提取物从细胞碎片中分离出来。
为生成7-氨基头孢酸将此粗提取物(蛋白质浓度为2毫克/毫升)加热至室温，然后添加在磷酸钾缓冲液中的丙二酰-7-氨基头孢烷酸，使其浓度为5毫克分子/升。全部于25℃静置培养，并在24小时内分析生成的7-氨基头孢烷酸。
分析用薄层色谱法，(平板硅胶60F245，溶剂丁醇-甲醇-冰醋酸-水，比例50∶30∶3∶17)。从丙二酰-7-氨基头孢烷酸(Rf-值0.43)生成7-氨基头孢烷酸(Rf-值0.51)可用UV-波长254nm检测，或者喷洒Fluram试剂(3mg Fluram;Fluka CH-9470 Buchs在10毫升丙酮中)后在UV-波长366nm检测。
用此粗提取物(含丙二酰-7-氨基头孢烷酸-酰基转移酶)在约14小时后可检测出50～100μmol7-氨基头孢烷酸。
表1a)无机盐培养基储备液储备液1:
NaH2PO4·2H2O 156.0gNH4Cl 10.0gK2SO41.2g蒸镏水500.00ml储备液2:
对氨基苯甲酸8.0mgD-生物素2.0mg烟酸20.0mgD-泛酸钙10.0mg吡哆醛盐酸盐30.0mg二氯化硫胺20.0mg氰钴胺素10.0mg蒸镏水100.0ml灭菌储备液3:
HCl(37%)7.0mlFeCl2·4H2O 1.5gZnCl20.07gMnCl2·4H2O 0.1gH3BO30.006gCoCl2·6H2O 0.19gCuCl2·6H2O 0.002gNiCl2·6H2O 0.024gNa2MoO4·2H2O 0.036g蒸镏水1000.00ml,高压灭菌121℃,20分钟储备液4NaoH0.5gNa2SeO3;·5H2O 0.003gNa2WO4·2H2O 0.004g蒸镏水1000.0ml,高压灭菌121℃,20分钟储备液5:
MgCl2·6H2O 40.0gCaCl2·2H2O 5.0g蒸馏水200.0ml,高压灭菌,
121℃,20分钟储备液6:
去乙酰头孢菌素C-内酯3.55g蒸镏水60.0ml青霉素酶(EC3.5.2.6)1.0mg(25000单位)(Sigma pO389)用NaOH调pH至7.0加蒸镏水至100mlb)制备无机盐培养基储备液1:25.0ml用KOH调pH至7.0然后蒸镏水加至950.0ml,高压灭菌,121℃,20分钟消毒灭菌后加入下列物质:
储备液20.5ml储备液31.0ml储备液41.0ml储备液50.5ml从实施例5得到的溶液50.0ml
权利要求
1.一种筛选的微生物，它能把内酯或其可溶性盐，结构式为 作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰-内酯或其可溶性盐结构式为 被利用，而后者不会被分解代谢。
2.按照权利要求1的微生物，标号为Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)及其子系体和突变体。
3.用微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构式为
(其中R是氢原子、羟基或乙酸基)，其特征在于可把头孢菌素C衍生物或其可溶性盐其结构通式为
(其中R如前述)作为底物通过按照权利要求1的微生物方法转化为结构式Ⅲ的产物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，转化反应可以用微生物Sphingomonas SP.FB1(DSM7007)或其子系体和突变体来进行。
5.至少按照权利要求3和4之一的方法，其特征在于，用头孢菌素C作底物。
6.至少用权利要求3-5之一的方法，其特征在于，转化反应在一次性或连续性加入底物的情况下进行，培养基中的底物浓度不超过20重量%。
7.至少按照权利要求3-6之一的方法，其特征在于，转化反应在温度0-60℃，pH5-9条件下进行。
8.丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构式为
(其中R是氢原子、羟基或乙酸基)。
9.丙二酰-7-氨基头孢烷酸。
10.微生物方法制备7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，其结构通式为
(其中R如权利要求3所述)，其特征在于，可以将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐(结构式Ⅲ)作为底物，通过假单孢菌属微生物Pseudomonas SP.(DSM 7509)或其子系体和突变体，或用这些微生物的无细胞的酶转化成结构式Ⅴ的产物。
11.按照权利要求10的方法，其特征在于，可以用丙二酰-7-氨基头孢烷酸作底物。
12.至少按照权利要求10和11之一的方法，其特征在于，转化反应可以在一次性或连续性加入底物的情况下进行，培养基中底物浓度不得超过10重量%。
13.至少按照权利要求10-12之一的方法，其特征在于，转化反应在温度为4-50℃，pH为4-9条件下进行。
14.利用假单孢菌属Pseudomonas SP.(DSM7509)微生物，将丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物及其可溶性盐(结构式Ⅲ)水解生成7-氨基头孢烷酸衍生物(结构通式Ⅴ)。
15.用按照权利要求14的方法，其特征在于，将丙二酰-7-氨基头孢烷酸水解反应生成7-氨基头孢酸。
全文摘要
叙述一种新的微生物，其筛选方法是用内酯或其可溶性盐，结构式为(I)。作为唯一的碳源、氮源和能源，通过丙二酰-内酯或其可溶性盐，结构式为(II)而被利用，后者不会被分解代谢。其次叙述一种微生物方法制备丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物或其可溶性盐，结构通式为(III)。此方法是由头孢菌素C衍生物或其可溶性盐，结构通式为(IV)用微生物制得的。此外还叙述了由丙二酰-7-氨基头孢烷酸衍生物制备7-氨基头孢烷酸衍生物的新方法，其结构通式为(V)。
文档编号C07D513/14GK1077989SQ93105288
公开日1993年11月3日 申请日期1993年4月29日 优先权日1992年4月29日
发明者萨宾·舒尔, 安德烈亚斯·切希 申请人:瑞士隆萨股份公司