引物探针组合、实时荧光定量PCR检测体系和检测方法及其在食管鳞状细胞癌体外预后评估中的应用

本发明涉及分子诊断及肿瘤精准医学，具体涉及引物探针组合、实时荧光定量pcr检测体系和检测方法及其在食管鳞状细胞癌体外预后评估中的应用。

背景技术：

1、目前，针对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，escc）的预后评估主要依赖临床病理分期、组织学分级、手术切缘状态以及蛋白/基因类分子标志物模型等。然而，这些手段在复发/进展风险分层、疗效预测的及时性及对肿瘤微环境（tme）动态变化的感知方面仍存在局限，难以满足精准医学对高灵敏、可重复、可规模化预后工具的需求。现有技术的方案及其主要缺陷如下：

2、（1）组织学与免疫组化：如ki-67、p53等能提示风险，但半定量与主观性问题突出，受样本质量与染色条件影响明显，跨中心复现性不足。

3、（2）基因测序/芯片：wes、rna-seq或多基因模型信息量大，但成本与周期掣肘、对样本新鲜度敏感，难以在常规随访与大规模人群管理中广泛落地。

4、在此背景下，tme中的细菌相关信号逐渐被认为可能影响肿瘤发生发展与治疗反应。已有研究提示，特定微生物群与escc的复发、进展及生存存在统计学相关。但既有公开技术通常依赖高通量测序得到相对丰度信号：一方面，相对丰度与临床结局之间的直接可解释性并不恒定；另一方面，该路径仍面临：（1）方法学挑战：样本前处理、污染/批次效应控制、引物偏倚与定量准确性问题导致跨实验室可重复性不足；（2）临床可用性不足：针对单一物种实现快速、特异、低成本定量并基于明确阈值实施风险分层的标准化技术路线尚不成熟；（3）判读不统一：如何把“生物学相关性”转化为可操作的临床判读规则（如ct阈值、评分卡、分层界点）仍缺乏明确、统一的公开方案。

5、实时荧光定量 pcr（rt-qpcr）在病原学与分子标志物检测中应用广泛，然而在实际应用层面仍存在以下瓶颈：（1）特异性不足：尚缺针对目标微生物的高特异引物/探针，且易与近缘/共居菌交叉扩增；（2）定量一致性：内参选择、反应体系与循环参数、标准曲线与定量区间、ct/相对定量方式等在跨批次与跨中心的稳定性不够；（3）样本基质差异：对食管冲洗液、手术组织及内镜活检组织等不同基质中的抑制因子与低拷贝问题应对不充分，影响灵敏度与稳健性；（4）阈值与分层缺位：面向预后终点（os/pfs）的训练—验证—外部验证闭环尚未形成，难以得出可直接用于临床决策的数值阈值/分层规则。

6、综上，迫切需要一种以prevotella nigrescens为靶标、用于escc预后评估的体外qpcr检测方法，并辅以特异引物/试剂盒与标准化判读方案，以实现临床可解释、可复制、可规模化的预后风险分层。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

2、在第一方面，本发明提供了一种引物探针组合，包括上游引物、下游引物和探针；

3、所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，为5’-cattcgtgttcccgttccat-3’；

4、所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，为5’-gcaagcacataatgccgttt-3’；

5、所述探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，为5’-agtttgatcctggctcaggatgaacgct-3’；

6、所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

7、在一种实施方式中，所述荧光报告基团可选用fam、hex、vic或rox中的一种或多种，荧光淬灭基团可选用bhq1、bhq2或tamra中的一种或多种。可选的，所述荧光报告基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1。

8、在一种实施方式中，所述上游引物和下游引物的浓度为0.2-0.6 μm，所述探针的浓度为0.1-0.3 μm。

9、在一种实施方式中，所述引物探针组合的扩增靶区域位于变黑普氏菌prevotellanigrescens的16s rrna基因，且在实时荧光定量pcr扩增条件下，所述引物探针组合能够特异性扩增变黑普氏菌，而对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、颊普雷沃菌、中间普氏菌、烟曲霉菌、白色念珠菌和/或人基因组dna不产生可检测的非特异性扩增信号。

10、在第二方面，本发明提供了一种实时荧光定量pcr检测体系，所述检测体系含有第一方面所述引物探针组合。

11、在一种实施方式中，所述检测体系还含有qpcr预混液和模板dna。

12、在一种实施方式中，所述检测体系的总体积为20 μl，按每孔计算的各组分用量如下：2×qpcr预混液10.0 μl；10 μm的上游引物0.5 μl，反应终浓度为0.25 μm；10μm的下游引物0.5 μl，反应终浓度为0.25 μm；10 μm的探针0.5 μl，反应终浓度为0.25 μm；模板dna为含50 ng dna的模板溶液；余量以无核酸酶水补足至20 μl。

13、在第三方面，本发明提供了一种实时荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：采用第二方面所述的检测体系进行实时荧光定量pcr检测。

14、在一种实施方式中，所述实时荧光定量pcr检测的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸30s，共40个循环；每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

15、在第四方面，本发明提供第一方面所述引物探针组合或第二方面所述的检测体系在制备食管鳞状细胞癌体外预后评估试剂中的应用。

16、在一种实施方式中，所述食管鳞状细胞癌体外预后评估试剂用于检测食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织样本中变黑普氏菌的含量，通过检测获得的变黑普氏菌阈值循环数ct值评估患者的预后风险。

17、在一种实施方式中，变黑普氏菌含量越高，ct值越高，患者预后风险越高、生存期越短。

18、在一种实施方式中，当检测获得的ct值≤ct值阈值时，提示患者总生存期预后良好；当ct值>ct值阈值时，提示患者预后不良。

19、在一种实施方式中，所述ct值阈值为28~33中的任一数值。优选的，所述ct值阈值为32.6。

20、在一种实施方式中，所述样本为离体的食管鳞状细胞癌肿瘤组织样本。

21、在一种实施方式中，所述试剂还包含第二方面所述的实时荧光定量pcr检测体系。

22、在一种实施方式中，所述预后评估包括评估食管鳞状细胞癌患者的肿瘤进展速度、转移风险和/或术后复发风险。

23、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

24、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

25、（1）本发明通过序列比对及实验筛选获得的引物探针组合，可在设定条件下仅对变黑普氏菌产生特异性扩增，对牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis, p.gingivalis）及具核梭杆菌（fusobacterium nucleatum, f. nucleatum）等不产生特异扩增峰，显著提高检测特异性，避免属水平或群落水平分析的模糊性。

26、（2）本发明的检测体系经不同基质类型验证，在新鲜或冷冻肿瘤组织、食管内镜活检组织中均表现出良好的灵敏度和重复性，对潜在pcr抑制因子具有一定耐受性，适合临床实际取样流程。

27、（3）基于102例escc患者随访数据，本发明采用x-tile等统计方法系统评估变黑普氏菌qpcr ct值与总生存期之间的关系，确定ct＝32.6为最佳截断点；以此为界，将患者划分为pn高丰度组（ct≤32.6）和低丰度组（ct＞32.6），结果显示高丰度组患者的不良生存风险显著降低（多因素hr＝0.608，95%ci：0.410–0.901），见图2及表2。据此，本发明建立了ct≤32.6提示预后较好，ct＞32.6提示预后较差的风险分层规则，实现了从微生物相关性到可操作临床指标的转化。

28、基于临床样本的检测结果，本发明建立的pn定量指标与患者生存结局呈现出明确相关性，能够在实际人群中区分预后较好与预后较差的患者亚群。与单纯依赖组织学分期、影像学指标的传统预后评估方式相比，本发明提供的是一种反映肿瘤微生态状态及宿主反应的功能性分子标志物，可在现有分期体系基础上进一步细化风险分层，为治疗策略选择和随访频率的调整提供客观依据，具有良好的临床应用潜力。方法简便、成本可控，便于临床推广。相较高通量测序等昂贵复杂的检测方式，本发明立足于常规qpcr平台，操作简单、成本较低、周转时间短，适用于各级医疗机构的常规检测和随访管理。

29、（4）本发明明确了引物序列、反应体系、扩增条件及判读阈值，为多中心一致性验证和真实世界研究提供基础，有利于构建统一的escc微生物预后评估标准。