一种朱顶红花叶病毒HiMV的RT-PCR检测方法

本发明涉及一种朱顶红花叶病毒himv 的rt-pcr检测方法，属于分子生物学检测。

背景技术：

1、朱顶红具有品种繁多、花型多样、花色丰富、观赏价值高、养护简单及栽培管理容易等优势，一直深受消费者青睐，已逐渐成为重要的球根花卉之一，近年来更成为年宵花市场中的畅销品种。朱顶红在生产上主要采用分球、鳞片繁殖、组织培养等无性繁殖方式进行扩繁，在无性繁育过程中，病毒会随带毒的母本或带毒的繁殖材料持续传播，并随着繁殖代数增加，在种苗群体中不断积累和扩散，从而导致病毒携带率升高，直接影响植株长势、开花品质和种球质量，进而影响种植企业及种植农户的经济效益。

2、朱顶红花叶病毒（hippeastrum mosaic virus，简称himv）是侵染朱顶红、文殊兰等石蒜科植物的重要病毒之一。himv侵染植株后，可引起叶片花叶、黄绿斑驳、条纹、褪绿等症状，严重时可造成植株生长势减弱、叶片畸形、开花品质下降以及种球生长发育受阻。但himv侵染后的症状表现并不稳定，不同品种、不同生育阶段及不同环境条件下症状轻重差异较大，部分植株在感染早期、低病毒载量状态下甚至不表现明显症状，存在一定程度的隐症或潜伏感染现象。同时，himv可随营养繁殖材料长期保存并进行垂直传播，使得外观正常的带毒母株、种球或组培材料仍有可能作为繁殖材料进入下一代扩繁体系。

3、目前针对himv的检测手段主要包括电子显微镜检测和elisa血清学检测等。其中，电子显微镜检测需要专门的仪器设备和较高的操作技术水平，样品制备及观察过程较为繁琐，检测成本较高、检测周期较长，且对低浓度病毒样品的识别能力有限，难以满足生产过程中大批量、快速和高效筛查的需求。elisa血清学检测虽然具有一定的批量检测能力，但其检测效果较大程度依赖于抗体的质量、特异性及样品中的病毒含量，当病毒载量较低或病毒在组织中分布不均时，容易出现弱阳性或漏检。此外，部分potyvirus属通用抗体可与同属其他病毒发生交叉反应，难以仅凭血清学结果准确区分himv与其他马铃薯y病毒属病毒；而针对himv的高质量特异性抗体制备成本较高、周期较长，也限制了该方法在普通生产企业及基层种植环节中的推广应用。

4、由于himv具有可随无性繁殖材料持续传播、感染后症状表现不典型或不稳定、部分材料存在潜伏感染、低病毒载量状态下肉眼难以识别，以及病毒在不同组织、不同生育阶段中的含量和分布可能存在差异等特点，使其在实际生产中存在较大的早期检测难度。尤其是在种球繁育、组培快繁和母株筛选阶段，带毒但尚未表现明显症状的材料若不能被及时检出，极易继续作为繁殖母本或生产种球进入扩繁体系，导致病毒在后续无性繁殖过程中不断积累和扩散。

5、现有技术在himv检测方面仍存在检测周期较长、对仪器设备或专用抗体依赖较强，以及不利于快速开展批量检测等问题，难以同时满足himv早期诊断、种球母本筛选、组培材料检测及大规模生产监测的实际需求。因此，有必要对现有himv检测技术加以改进，建立一种灵敏度较高、特异性较强、检测周期较短、操作相对简便，并适合实际生产应用的检测方法。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种朱顶红花叶病毒himv 的rt-pcr检测方法，以便尽早发现朱顶红组织中是否感染himv，解决现有检测方法存在的检测周期长、低载量样品易漏检、特异性不足以及难以适应生产快速检测等问题，为朱顶红种球母本筛选、组培材料检测、种苗繁育过程中的病毒监测及无毒种苗生产提供可靠的技术支持，从而有效阻止himv在无性繁殖体系中的传播，保障朱顶红植株正常生长，提高种球品质和商品价值。

2、本发明通过下列技术方案实现：一种朱顶红花叶病毒himv 的rt-pcr检测方法，包括下列步骤：

3、1）用试剂盒提取朱顶红植物总rna，取朱顶红植物组织，用专门的rna提取试剂盒提取总rna；

4、2）反转录合成cdna，用专门的反转录试剂盒通过一步法去除gdna及第一链cdna，合成cdna，保存于-20 ℃冰箱备用；

5、3）特异检测引物设计，以朱顶红花叶病毒himv cp蛋白保守序列设计引物如下：

6、正向引物为：5’-aaggatgtggacgcaggaac-3’，

7、反向引物为：5’-tctgaattgcatatcgcggc-3’；

8、4）pcr反应

9、4.1）pcr反应体系如下：

10、pcr supermix 10μl，

11、10μm himv正向引物 0.4μl，

12、10μm himv反向引物 0.4μl，

13、cdna 2μl，

14、无菌水 5μl，

15、总反应体系 20μl；

16、4.2）pcr反应程序如下：

17、pcr反应体系各组分混匀后，于94℃预变性5min，再于94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s；如此循环35次后，于72℃终延伸5min，得pcr反应产物；

18、5）电泳检测，步骤4）的pcr反应产物用1%琼脂糖凝胶在1×tbe 缓冲体系中进行电泳检测，分析是否有特异性的朱顶红花叶病毒himv的cp蛋白基因片段，有，则说明检测的朱顶红植物组织感染了朱顶红花叶病毒himv。

19、所述步骤1）的朱顶红植物总rna提取如下：

20、1.1）取朱顶红植物组织放入含小钢珠的研磨管中，用液氮处理，之后放于研磨机60hz，研磨60s，至粉末状，重复三次；

21、1.2）将粉末样品移至离心管中，并在该粉末样品中加入1ml/100g的 transzol up和0.2ml /100g 的rna extraction agent，放于涡旋仪上，于室温涡旋振荡5 min；之后放入离心柱中，在10,000 xg、2-8℃下，离心15 min，样品被分为：上层的无色水相、中间层、下层的粉红色有机相，其中：含rna的无色水相体积为所用transzol up试剂的50-60%；

22、1.3）取步骤1.2）的无色水相放于新的离心管中，加入等体积的无水乙醇混匀，得混合物；

23、1.4）将步骤1.3）得到的混合物放入离心柱中，在12,000 xg 、室温下，离心30s，得离心物，弃流出液；在离心物中加入500μl cb9，放入离心柱中，于12,000 xg、室温下，离心30s，得离心物，弃流出液；重复本步骤一次，得离心物，弃流出液；在所得离心物中加入500μl wb9，放入离心柱中，于12,000 xg、室温下，离心30s，得离心物，弃流出液；重复本步骤一次，得离心物，弃流出液；所得离心物放入离心柱中，于12,000 xg、室温下，离心2min，去除残留的乙醇，得离心物；

24、1.5）将步骤1.4）所得离心物放入试剂盒已配好的rnase-frce tube中，加入50μlrnase-free water ，放于离心柱中央，室温静置1分钟，得静置物；

25、1.6）将步骤1.5）所得静置物于离心柱中，在12,000 xg、室温下，离心1min，洗脱rna，得总rna，并置于-80℃保存备用。

26、所述步骤1）专门的rna提取试剂盒，采用北京全式金生物公司生产的transzol upplus rna kit高纯度rna提取试剂盒。

27、所述步骤2）专门的反转录试剂盒，采用北京全式金生物公司生产的easyscript®one-step gdna removal and cdna synthesis supermix easyscript反转录试剂盒。

28、所述步骤2）的反转录合成cdna采用的反转录体系如下：

29、anchored oligo(dt)18 prime 1μl，

30、2xes reaction mix 2μl，

31、easyscript rt/ri enzyme mix 1μl，

32、gdna remover 1μl，

33、rnase-free water 2μl，

34、total rna 5μl，

35、总反应体系 20μl；

36、反转录合成cdna时，将上述各组分混匀后，于42℃孵育30min，85 ℃加热2min，得合成的cdna，并保存于-20 ℃冰箱备用。

37、所述步骤3）的特异检测引物设计，是以ncbi登录号为：mn068006.1的朱顶红花叶病毒himv cp蛋白保守序列进行的引物设计，该设计的引物由北京擎科生物技术有限公司合成。

38、本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述技术方案，可方便地对采集的朱顶红植物组织进行检测，并分析其是否带朱顶红花叶病毒himv，从而尽早发现朱顶红组织中是否感染花叶病毒，为阻止花叶病毒的传播提供可靠的技术支持，保障朱顶红植株正常生长，提高种球品质。本发明检测方法针对himv保守特异序列设计专一性引物、无需制备特异性抗体、检测周期短、灵敏度高、能够检出低载量和无明显症状样品、可用于种球和组培苗的大批量筛查。