一种靶向KRAS-G12D突变的T细胞受体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向kras-g12d突变的t细胞受体及其应用。

背景技术：

1、近年来，免疫细胞治疗技术已经成为继手术治疗、放疗、化疗、小分子靶向治疗或单抗治疗后的肿瘤治疗新方法。tcr-t是采用基因工程技术将克隆的特异性识别肿瘤抗原tcr移植到自体cd8+t细胞上，使其获得特异性杀伤肿瘤细胞的能力。与car-t细胞仅能识别膜抗原相比，tcr-t细胞识别的抗原是由mhc提呈的抗原肽，因而可以靶向更广泛的抗原，包括胞内抗原和膜抗原；tcr-t细胞疗法在增加了t淋巴细胞的数量的同时，提高了t淋巴细胞对于肿瘤细胞的杀伤特异性，从而达到更好的肿瘤治疗效果。2024年8月，adaptimmune公司研发的靶向mage-a4癌睾丸抗原靶点、针对hla-a02:01亚型、用于晚期滑膜肉瘤的治疗的tcr-t细胞药物（afami-cel）已经fda批准上市，成为世界上第一款真正意义上的tcr-t细胞药物。研发靶向不同瘤种、不同患者中广泛存在的驱动基因突变所产生的“公共肿瘤新抗原”（如kras、tp53突变）的tcr-t细胞，能够惠及更多的肿瘤患者。尽管如此，领域内对公共肿瘤新抗原免疫原性与tcr-t的研究依然处于早期阶段，依然有更多潜在的肿瘤新抗原的免疫原性有待鉴定，依然有更多靶向公共肿瘤新抗原的tcr-t细胞有待研发。

2、kras基因是至今研究最为清楚的肿瘤驱动基因之一，kras的点突变破坏其gtp酶活性，致使kras蛋白与gtp永久结合，持续激活下游信号通路，从而促进肿瘤的迁移、免疫逃逸、靶器官定植等过程。一项通过对胰腺导管癌患者的全组学数据分析显示kras突变率高达97%，其中g12d占比最高为47.52%，g12v占比27.72%、g12r占比16.83%。几十年来，靶向kras一直具有挑战性，直到发现变构krasg12c突变特异性抑制剂，通过与switch-ii区域下方的突变半胱氨酸共价结合，将其锁定在无活性的gdp结合形式中。kras g12c抑制剂索托雷塞（amg510）和阿达格拉西布（mrtx849）临床试验报告了令人振奋的结果，两种药物均已获得美国fda批准，用于经治kras g12c突变晚期肺癌，但kras g12c突变在kras突变频率占比小于1%，临床上仍亟需开发靶向kras-g12d、g12v、g12r、q61h等高频突变的药物或细胞疗法，为肿瘤病人提供新的治疗选择。

3、2016年，steven rosenberg团队从转移性结直肠癌患者的til中分离了靶向hla-c08:02限制性kras-g12d突变抗原的特异性t细胞，经体外扩增培养后回输至该患者体内，患者肿瘤负荷显著降低，表明kras特异性t细胞具有潜在的肿瘤治疗价值。2022年，该团队在此前的基础上，进一步报道了靶向kras-g12d突变抗原特异性tcr-t细胞治疗1名转移性胰腺癌患者的临床研究结果，该团队将针对hla-c08:02限制性kras-g12d的tcr基因通过逆转录病毒载体转导入离体t细胞中，将体外扩增培养后的tcr-t细胞回输到患者体内，治疗6个月后，患者的肿瘤病灶显著消退，kras-g12d-tcr-t细胞仍占患者所有循环外周血t细胞的2%以上。上述研究表明，靶向kras突变的tcr-t细胞对于治疗kras突变的肿瘤具有潜在的治疗价值。hla基因具有高度多态性，且其分布具有显著的地域特征。上述hla-c08:02限制性kras-g12d-tcr-t在胰腺癌的治疗中展现出了优异的疗效，尽管某些癌症中kras-g12d突变的频率很高，但hla-c08:02的人群频率在全球占比仅约为5%，这将严重限制该项疗法的临床应用。因此，为了扩大tcr-t的临床应用，必须识别额外的hla-i和hla-ii限制的高频突变的kras特异性tcrs。近年来，多项靶向kras g12v突变，针对hla-a11:01亚型的tcr-t用于胰腺癌及肺癌的细胞疗法也正在开展临床研究中（nct06043713、nct06105021）。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种靶向kras-g12d突变的t细胞受体及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

2、本发明结合hla亚型的分布比例及kras突变体的突变频率，选取了高频的hla亚型（hla-a11:01）对应的高频kras-g12d（rank1）肿瘤新生抗原，体外开展kras-g12d肿瘤抗原特异tcr筛选，单细胞tcr测序后获取tcr序列，并进行了kras-g12d-tcr体外激活、tcr-pmhc的亲和力检测，以及体内外杀伤功能验证，这将为开发靶向kras-g12d肿瘤抗原的tcr-t疗法提供坚实地理论及实验基础；此外，本发明提交的靶向kras-g12d突变的tcr序列为国内外首次报道，与既往报道的均不相同，本发明具有原始创新性。开发适用我国人群高频hla亚型（a11:01）的kras g12d-tcr-t细胞疗法，将惠及我国众多伴kras g12d突变的肿瘤患者，具有重大的研究价值与临床应用前景。

3、为实现上述目的及其他相关目的，本技术第一方面提供一种靶向kras-g12d突变的t细胞受体，所述t细胞受体包含tcrα链和tcrβ链，所述tcrα链包含tcrα链可变区中的cdrα1、cdrα2和cdrα3；所述tcrβ链包含tcrβ链可变区中的cdrβ1、cdrβ2和cdrβ3；所述cdrα3的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述cdrβ3的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、优选地，所述tcrα链可变区中cdrα1的氨基酸序列如seq id no.3所示或cdrα2的氨基酸序列如seq id no.4所示；和/或，所述tcrβ链可变区中cdrβ1的氨基酸序列如seq idno.5所示或cdrβ2的氨基酸序列如seq id no.6所示。

5、本发明第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码前述tcr。

6、本发明第三方面提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含前述多核苷酸和质粒骨架。

7、本发明第四方面提供一种病毒，所述病毒含有前述多核苷酸。

8、本发明第五方面提供一种t细胞，所述t细胞含有前述tcr、前述多核苷酸、前述核酸构建体或前述病毒。

9、本发明第六方面提供前述t细胞受体、前述多核苷酸、前述核酸构建体、前述病毒或前述t细胞在制备肿瘤治疗产品中的用途。

10、本发明第六方面提供一种肿瘤治疗产品，所述肿瘤治疗产品包含前述t细胞受体、前述kras-g12d抗原肽或前述t细胞和药学上可接受的辅料。

11、本发明第七方面提供一种肿瘤治疗方法，所述方法为向肿瘤患者使用前述t细胞受体、前述多核苷酸、前述核酸构建体、前述病毒或前述t细胞。

12、综上所述，本发明公开了一种靶向kras-g12d突变的t细胞受体及其制备方法和用途，并且获得以下有益效果：

13、本发明结合hla亚型的分布比例及kras突变体的突变频率，选取了高频的hla亚型(hla-a11:01)对应的高频kras-g12d（rank 1）肿瘤特异性抗原（tsa），体外开展kras-g12d肿瘤抗原特异tcr筛选，单细胞tcr测序后获取tcr序列，并进行了kras-g12d-tcr体外激活及杀伤功能验证，通过将本发明的kras-g12d-tcr稳定表达于cd8+t细胞后制备的kras-g12d-tcr-t细胞在体内/外实验结果表明kras g12d-tcr-t细胞可特异性识别并杀伤表达hla-a11:01及kras-g12d突变抗原的肿瘤细胞，最终实现对靶细胞的特异性杀伤。本发明可为开发靶向kras-g12d肿瘤特异性抗原的tcr-t疗法提供坚实的理论及实验基础。此外，本发明提交的tcr序列为国内外首次报道，与既往报道的kras-g12d-tcr均不相同，本发明具有原始创新性。